GB-T 《木薯葉片中黃酮醇的測定 高效液相色譜法》

GB/TXXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。

本文件起草單位：

本文件主要起草人：

2

GB/TXXXXX—XXXX

木薯葉片中黃酮醇的測定

高效液相色譜法

1范圍

本文件規(guī)定了高效液相色譜法測定木薯葉片中黃酮醇的測定方法的原理、試劑與材料、儀器與設(shè)備、

試樣制備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算與表示、精密度的要求。

本文件適用于木薯新鮮葉片和木薯葉粉中4種黃酮醇類化合物含量的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T32467化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制術(shù)語及定義

3術(shù)語和定義

GB/T32467界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

4原理

試樣中黃酮醇經(jīng)50％乙醇溶液超聲波輔助提取，提取液經(jīng)離心，上清液混合后過濾，用高效液相色

譜儀測定，外標(biāo)法定量。

5試劑和材料

以下所用的試劑，除另有說明外均為分析純?cè)噭?，水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

5.1甲醇，CH3OH，色譜純，CASNO：67-56-1。

5.2無水乙醇，C2H6O，CASNO：64-17-5。

5.3磷酸H3PO4，CASNO：7664-38-2。

5.450％乙醇溶液：取500mL無水乙醇，加入500mL水，混勻。

5.50.2％磷酸溶液：取2mL磷酸，置于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

5.64種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)樣品：楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷，純度≥98％，見附錄A。

5.7微孔濾膜：13mm×0.22μm。

5.8黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

5.8.1楊梅苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取楊梅苷標(biāo)準(zhǔn)樣品10.0mg，加甲醇溶解并定容至10.0mL，配成

濃度為1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

5.8.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品60.0mg，加甲醇溶解并定容至10.0mL，配成濃度

為6.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

3

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5.8.3煙花苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取煙花苷標(biāo)準(zhǔn)樣品30.0mg，加甲醇溶解并定容至10.0mL，配成

濃度為3.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

5.8.4水仙苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取水仙苷標(biāo)準(zhǔn)樣品10.0mg，加甲醇溶解并定容至10.0mL，配成

濃度為1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

5.8.5標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液：分別移取1.0mL的楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10mL

棕色容量瓶中，用甲醇定容至10.0mL，獲得楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷濃度分別為100μg/mL、

600μg/mL、300μg/mL、100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

5.8.6混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，逐漸稀釋，配制成蘆丁濃度為1.5μg/mL，

15μg/mL，30μg/mL，150μg/mL，300μg/mL和600μg/mL，煙花苷濃度為0.75μg/mL，1.5μg/mL，

7.5μg/mL，15μg/mL，75μg/mL，150μg/mL和300μg/mL，楊梅苷、水仙苷濃度分別為0.25μg/mL，

2.5μg/mL，5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL和100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于4℃保

存，有效期7d。

6儀器和設(shè)備

6.1高效液相色譜儀：配配紫外檢測器或二極管陣列檢測器。

6.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。

6.3超聲波清洗器：功率≥500W。

6.4離心機(jī)：帶15mL轉(zhuǎn)子或適配器，轉(zhuǎn)速≥5000r/min。

6.5植物組織研磨儀：帶0.2mm的篩。

6.6烘箱：溫度可調(diào)。

7試樣制備與保存

7.1試樣制備

7.1.1木薯鮮葉

木薯新鮮葉片采集后，擦拭干凈葉片表面塵土或水分，用液氮速凍后研磨至粉末，裝入潔凈的離心

管中，密封保存。

7.2木薯葉粉

木薯新鮮葉片采集后，放入60℃烘箱連續(xù)烘干24h，取出后用植物組織研磨儀粉粹，過0.2mm的

篩，混勻，裝入潔凈的密封袋中，密封保存。

8試樣保存

木薯新鮮葉片試樣保存于-40℃，木薯葉粉保存于4℃以下。試樣制備過程中，應(yīng)防止樣品污染或

組分變化。

9操作步驟

9.1提取

9.1.1木薯新鮮葉片

4

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準(zhǔn)確稱取木薯鮮葉粉末0.2g（精確至0.0001g）于15.0mL離心管中，加入50％的乙醇5.0mL，

旋渦振蕩混勻，超聲提取60min（50℃，4kHz），待樣品冷卻后混勻，樣品離心10min（10000r/min，

25℃）；上清液轉(zhuǎn)移至干凈的10mL容量瓶中，殘?jiān)偌尤?.0mL50％的乙醇溶液，旋渦振蕩混勻，

樣品離心5min（10000r/min，25℃），合并兩次離心的上清液，加入50％的乙醇定容至10.0mL，

混勻即為待測液，取1mL混合的待測液，通過0.22μm微孔濾膜，供高效液相色譜儀測定。

9.1.2木薯葉粉

準(zhǔn)確稱取木薯葉粉末0.2g（精確至0.0001g）于15mL離心管中，加入50％的乙醇5.0mL，旋渦振

蕩混勻，超聲提取60min（50℃，4kHz），待樣品冷卻后，樣品離心10min（10000r/min，25℃）；

上清液轉(zhuǎn)移至干凈的10mL容量瓶，殘?jiān)偌尤?.0mL50%的乙醇溶液，旋渦振蕩混勻，樣品離心5min

（10000r/min，25℃），合并兩次離心的上清液，加入50％的乙醇定容至10.0mL，混勻即為待測液，

取1mL混合的待測液，通過0.22μm微孔濾膜，供高效液相色譜儀測定。

9.2色譜參考條件

a)XDBC18柱（250mm×4.6mm，5μm）或性能相當(dāng)?shù)纳V柱；

b)流動(dòng)相：甲醇和0.2％磷酸水，按表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；

c)流速：0.8mL/min；

d)檢測波長:360nm；

e)進(jìn)樣量:10μL；

f)柱溫：40℃。

表1梯度洗脫表

時(shí)間/min甲醇/％0.2％磷酸水溶液/％

02575

155842

208020

251000

272575

322575

9.3測定

參考上述色譜條件（9.2）調(diào)節(jié)高效液相色譜儀，使木薯葉黃酮醇各組分的色譜峰完全分離。分別

吸取10μL適當(dāng)濃度的木薯葉黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作也和樣液進(jìn)行液相色譜測定，分別得到木薯葉黃酮醇

各組分的標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積（Aii）和樣液木薯葉各組分峰面積（Ai）。如果樣液中木薯葉黃酮醇某一

組分峰面積與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的該組分峰面積相差較大時(shí)，稀釋樣液或調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度后再行測定。

在上述色譜條件下，樣品中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷保留時(shí)間分別為11.467min、13.632min、

15.684min、16.097min，標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖參見附錄圖B.1。

9.4空白試驗(yàn)

5

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除不加試樣外，按9.1～9.3操作步驟進(jìn)行測定

10結(jié)果計(jì)算與表示

10.1木薯葉黃酮醇各組分含量

按式（1）計(jì)算試樣中木薯葉黃酮醇各組分含量（mg/kg）。

···········································································(1)

式中：

Xi——試樣中某一黃酮醇組分含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

Ai——試樣提取液中某一黃酮醇組分的峰面積；

Aii——木薯葉黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中某一組分的峰面積；

Cii——木薯葉黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)液中某一組分的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V——試樣提取液最終定容體積，單位為毫升（mL）；

m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。

10.2木薯黃酮醇總含量

試樣木薯葉黃酮醇總含量為各組分之和，按式（2）計(jì)算：

··············································································(2)

式中：

X——試樣中總黃酮醇含量，單位為毫克每千克（mg/kg）。

注：本標(biāo)準(zhǔn)4種黃酮醇已包括木薯葉黃酮醇的絕大部分組分，可認(rèn)為是木薯葉黃酮醇的總含量。

10.3結(jié)果表示

結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留1位有效數(shù)字。

11精密度

11.1重復(fù)性

在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于其算術(shù)平均值的10％。

11.2再現(xiàn)性

在再現(xiàn)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10％。

12檢出限和定量限

木薯葉中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷檢出限分別為：3.50mg/kg、2.50mg/kg、2.50mg/kg、

2.50mg/kg，定量限分別為：10.00mg/kg、7.50mg/kg、7.50mg/kg、7.50mg/kg。

6

GB/TXXXXX—XXXX

A

附錄A

（資料性）

4種黃酮醇中英文名稱、CAS號(hào)、分子式

4種黃酮醇中英文名稱、CAS號(hào)、分子式見表A.1。

表A.14種黃酮醇中英文名稱、CAS號(hào)、分子式

序號(hào)中文通用名英文通用名CASNo.分子式

Myricitrin，

１楊梅苷/楊梅素-3-O-蕓香糖苷41093-68-9C27H30O17

myricetin-3-O-rutinoside

Rutin，

2蘆丁/槲皮素-3-O-蕓香糖苷153-18-4C27H30O16

Quercetin3-O-rutinoside

Nicotiflorin，

3煙花苷/山柰酚-3-O-蕓香糖苷17650-84-9C27H30O15

Kaempferol-3-O-rutinoside

Narcissoside，

4水仙苷/異鼠李素-3-O-蕓香糖苷604-80-8C28H32O16

Isorhamnetin-3-O-rutinoside

7

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A

C

附錄B

（資料性）

4種黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

4種黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖B.1。

mAU

800

2

700

600

13.7763

500

400

15.8284

3001

200

16.243

10011.629

0

810121416min

保留時(shí)間（min）

圖B.14種黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖

注：圖B.1中編號(hào)1～4分別為：楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷，濃度分別為：50mg/L、150mg/L、50mg/L、50mg/L。

8

ICS67.050

CCSX04

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

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`

木薯葉片中黃酮醇的測定

高效液相色譜法

Determinationofflavonolforcassavaleaves—

High-performanceliquidchromatography

(點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí))

（征求意見稿）

（本草案完成時(shí)間：2022-2-25）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

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木薯葉片中黃酮醇的測定

高效液相色譜法

1范圍

本文件規(guī)定了高效液相色譜法測定木薯葉片中黃酮醇的測定方法的原理、試劑與材料、儀器與設(shè)備、

試樣制備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算與表示、精密度的要求。

本文件適用于木薯新鮮葉片和木薯葉粉中4種黃酮醇類化合物含量的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T32467化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制術(shù)語及定義

3術(shù)語和定義

GB/T32467界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

4原理

試樣中黃酮醇經(jīng)50％乙醇溶液超聲波輔助提取，提取液經(jīng)離心，上清液混合后過濾，用高效液相色

譜儀測定，外標(biāo)法定量。

5試劑和材料

以下所用的試劑，除另有說明外均為分析純?cè)噭?，水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

5.1甲醇，CH3OH，色譜純，CASNO：67-56-1。

5.2無水乙醇，C2H6O，CASNO：64-17-5。

5.3磷酸H3PO4，CASNO：7664-38-2。

5.450％乙醇溶液：取500mL無水乙醇，加入500mL水，混勻。

5.50.2％磷酸溶液：取2mL磷酸，置于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

5.64種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)樣品：楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷，純度≥98％，見附錄A。

5.7微孔濾膜：13mm×0.22μm。

5.8黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

5.8.1楊梅苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取楊梅苷標(biāo)準(zhǔn)樣品10.0mg，加甲醇溶解并定容至10.0mL，配成

濃度為1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

5.8.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品60.0mg，加甲醇溶解并定容至10.0mL，配成濃度

為6.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

3

GB/TXXXXX—XXXX

5.8.3煙花苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取煙花苷標(biāo)準(zhǔn)樣品30.0mg，加甲醇溶解并定容至10.0mL，配成

濃度為3.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

5.8.4水仙苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取水仙苷標(biāo)準(zhǔn)樣品10.0mg，加甲醇溶解并定容至10.0mL，配成

濃度為1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

5.8.5標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液：分別移取1.0mL的楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10mL

棕色容量瓶中，用甲醇定容至10.0mL，獲得楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷濃度分別為100μg/mL、

600μg/mL、300μg/mL、100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液，在-18℃下密封保存，有效期6個(gè)月。

5.8.6混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，逐漸稀釋，配制成蘆丁濃度為1.5μg/mL，

15μg/mL，30μg/mL，150μg/mL，300μg/mL和600μg/mL，煙花苷濃度為0.75μg/mL，1.5μg/mL，

7.5μg/mL，15μg/mL，75μg/mL，150μg/mL和300μg/mL，楊梅苷、水仙苷濃度分別為0.25μg/mL，

2.5μg/mL，5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL和100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于4℃保

存，有效期7d。

6儀器和設(shè)備

6.1高效液相色譜儀：配配紫外檢測器或二極管陣列檢測器。

6.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。

6.3超聲波清洗器：功率≥500W。

6.4離心機(jī)：帶15mL轉(zhuǎn)子或適配器，轉(zhuǎn)速≥5000r/min。

6.5植物組織研磨儀：帶0.2mm的篩。

6.6烘箱：溫度可調(diào)。

7試樣制備與保存

7.1試樣制備

7.1.1木薯鮮葉

木薯新鮮葉片采集后，擦拭干凈葉片表面塵土或水分，用液氮速凍后研磨至粉末，裝入潔凈的離心

管中，密封保存。

7.2木薯葉粉

木薯新鮮葉片采集后，放入60℃烘箱連續(xù)烘干24h，取出后用植物組織研磨儀粉粹，過0.2mm的

篩，混勻，裝入潔凈的密封袋中，密封保存。

8試樣保存

木薯新鮮葉片試樣保存于-40℃，木薯葉粉保存于4℃以下。試樣制備過程中，應(yīng)防止樣品污染或

組分變化。

9操作步驟

9.1提取

9.1.1木薯新鮮葉片

4

GB/TXXXXX—XXXX

準(zhǔn)確稱取木薯鮮葉粉末0.2g（精確至0.0001g）于15.0mL離心管中，加入50％的乙醇5.0mL，

旋渦振蕩混勻，超聲提取60min（50℃，4kHz），待樣品冷卻后混勻，樣品離心10min（10000r/min，

25℃）；上清液轉(zhuǎn)移至干凈的10mL容量瓶中，殘?jiān)偌尤?.0mL50％的乙醇溶液，旋渦振蕩混勻，

樣品離心5min（10000r/min，25℃），合并兩次離心的上清液，加入50％的乙醇定容至10.0mL，

混勻即為待測液，取1mL混合的待測液，通過0.22μm微孔濾膜，供高效液相色譜儀測定。

9.1.2木薯葉粉

準(zhǔn)確稱取木薯葉粉末0.2g（精確至0.0001g）于15mL離心管中，加入50％的乙醇5.0mL，旋渦振

蕩混勻，超聲提取60min（50℃，4kHz），待樣品冷卻后，樣品離心10min（10000r/min，25℃）；

上清液轉(zhuǎn)移至干凈的10mL容量瓶，殘?jiān)偌尤?.0mL50%的乙醇溶液，旋渦振蕩混勻，樣品離心5min

（10000r/min，25℃），合并兩次離心的上清液，加入50％的乙醇定容至10.0mL，混勻即為待測液，

取1mL混合的待測液，通過0.22μm微孔濾膜，供高效液相色譜儀測定。

9.2色譜參考條件

a)XDBC18柱（250mm×4.6mm，5μm）或性能相當(dāng)?shù)纳V柱；

b)流動(dòng)相：甲醇和0.2％磷酸水，按表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；

c)流速：0.8mL/min；

d)檢測波長:360nm；

e)進(jìn)樣量:10μL；

f)柱溫：40℃。

表1梯度洗脫表

時(shí)間/min甲醇/％0.2％磷酸水溶液/％

02575

155842

208020

251000

272575

322575

9.3測定

參考上述色譜條件（9.2）調(diào)節(jié)高效液相色譜儀，使木薯葉黃酮醇各組分的色譜峰完全分離。分別

吸取10μL適當(dāng)濃度的木薯葉黃酮醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作也和樣液進(jìn)行液相色譜測定