分子生物學分子克隆技術

1關于分子生物學分子克隆技術第2頁,共83頁，2024年2月25日，星期天基因工程是指在微觀領域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學和遺傳學原理，設計并實施一項把一個生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉入另一個生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達所需要的產(chǎn)物，最終實現(xiàn)該技術的商業(yè)價值?；蚬こ痰幕咎攸c是，分子水平操作，細胞水平表達。基因工程基因工程與建筑工程第3頁,共83頁，2024年2月25日，星期天重組DNA技術的重大突破帶動了現(xiàn)代生物技術的興起，并很快產(chǎn)生了許多生命科學的高技術產(chǎn)業(yè)。重組DNA技術，又稱為基因或分子克隆技術，是基因工程的核心技術。該技術包括了一系列的分子生物學操作步驟?；蚬こ痰暮诵募夹g是DNA重組技術第4頁,共83頁，2024年2月25日，星期天分子克隆技術

又稱為重組DNA技術，是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。第5頁,共83頁，2024年2月25日，星期天重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；（4）對轉化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。第6頁,共83頁，2024年2月25日，星期天獲得需要的目的基因（外源基因）獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構建基因文庫(genelibrary)，從中調用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉錄合成互補的DNA片段；（3）利用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。第7頁,共83頁，2024年2月25日，星期天細胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因文庫的構建細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序第8頁,共83頁，2024年2月25日，星期天紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。第9頁,共83頁，2024年2月25日，星期天基因工程的工具酶“手術刀”專司切割之職，內(nèi)切酶“縫紉針”具有連接之功，連接酶“復印機”行使復制之責，DNA聚合酶第10頁,共83頁，2024年2月25日，星期天(“交通工具車子”)——載體有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個“車子”將重組DNA送到宿主細胞中去。

第11頁,共83頁，2024年2月25日，星期天逆轉錄酶使真核基因的制備成為可能。

（1）真核基因組龐大而復雜，不易制得基因圖譜。（2）即使有了基因圖譜，因為真核基因有內(nèi)含子，不能在原核表達系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應得產(chǎn)物。（3）經(jīng)過逆轉錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)得到的cDNA文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。

第12頁,共83頁，2024年2月25日，星期天四、分子克隆的技術支撐核酸凝膠電泳技術核酸分子連接技術細菌轉化技術DNA序列分析技術寡核苷酸合成技術基因定點突變技術聚合酶鏈反應（PCR）技術DNA序列測定技術第13頁,共83頁，2024年2月25日，星期天核酸凝膠電泳第14頁,共83頁，2024年2月25日，星期天細菌轉化技術（包括感受態(tài)細胞制備）第15頁,共83頁，2024年2月25日，星期天聚合酶鏈反應（PCR）技術第16頁,共83頁，2024年2月25日，星期天大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質野生細胞野生細胞分離工程酶分離工程基因工程蛋白質工程途徑工程

工程細胞發(fā)酵工程酶工程細胞工程生物活性物質第17頁,共83頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共83頁，2024年2月25日，星期天

用攜帶了外源基因的農(nóng)桿菌Ti質粒轉化植物原生質體，發(fā)育成具有新性狀的完整植株——轉基因植物。

第19頁,共83頁，2024年2月25日，星期天基因工程的工具酶“手術刀”專司切割之職“縫紉針”具有連接之功“復印機”行使復制之責內(nèi)切酶連接酶聚合酶第20頁,共83頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)切酶“手術刀”專司切割之職“縫紉針”具有連接之功“復印機”行使復制之責內(nèi)切酶連接酶聚合酶第21頁,共83頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)切酶第22頁,共83頁，2024年2月25日，星期天同裂酶(Isoschizomers）第23頁,共83頁，2024年2月25日，星期天同尾酶第24頁,共83頁，2024年2月25日，星期天星活性*所謂星活性又稱Star活性。是指由于反應條件不同而產(chǎn)生的切斷與原來認識序列不同的位點的現(xiàn)象，也就是說產(chǎn)生Star活性后，不但可以切斷特異性的識別位點，還可以切斷非特異性的位點。產(chǎn)生Star活性的結果是酶切條帶增多。Differenceswhichcanleadtostaractivityincludelowionicstrength,highpH,andhigh(>5%v/v)glycerolconcentrations.HighFidelity(HF)RestrictionEnzymescanbeusedtoreducestaractivity.第25頁,共83頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共83頁，2024年2月25日，星期天DNA聚合酶Taq酶 用Taq酶擴增DNA時常使片段3‘端凸出一個A。Pfu酶 產(chǎn)生平末端產(chǎn)物。第27頁,共83頁，2024年2月25日，星期天連接酶T4DNALigase(invitrogen)16°C過夜或者室溫1-2個小時了連接即可。第28頁,共83頁，2024年2月25日，星期天基因工程的載體---用于擴增第29頁,共83頁，2024年2月25日，星期天克隆載體必備條件（1）具有復制起點（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶單一識別位點（4）具有較小的相對分子質量和較高的拷貝數(shù)。第30頁,共83頁，2024年2月25日，星期天表達型基因工程的載體----以PET32為例第31頁,共83頁，2024年2月25日，星期天多克隆位點第32頁,共83頁，2024年2月25日，星期天宿主要考慮宿主菌對密碼子的偏愛性大腸桿菌不同密碼子的偏愛性問題，將64組密碼子分為強、中、弱密碼子第33頁,共83頁，2024年2月25日，星期天目的產(chǎn)物目的基因不溶性的高效表達過程：目的基因編碼的真核蛋白質與宿主基因編碼的原核多肽或或其它基因編碼的具有其它功能的多肽和結合在一起，這種結合在一起的形成的不溶性無活性的包涵體，又叫為融合蛋白。舉例：胰島素與β-半乳糖苷酶形成包涵體優(yōu)點：避免細菌蛋白酶破壞，提高目的基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量。缺點：需要經(jīng)過溶解和復性才能獲得有活性的適合：不需要翻譯后修飾的蛋白質產(chǎn)物第34頁,共83頁，2024年2月25日，星期天目的基因的高效分泌表達概念：目的蛋白分泌到細胞周質和目的蛋白轉運到細胞周質后再分泌到細胞外優(yōu)點：①防止宿主菌對表達產(chǎn)物的降解；②有利于蛋白質正確折疊，形成天然構象③減輕宿主細胞代謝負荷④有利于分離需要在質粒設計時加入一段信號肽基因第35頁,共83頁，2024年2月25日，星期天基因克隆操作過程第36頁,共83頁，2024年2月25日，星期天克隆示意圖第37頁,共83頁，2024年2月25日，星期天克隆示意圖第38頁,共83頁，2024年2月25日，星期天克隆技術流程分切連轉篩第39頁,共83頁，2024年2月25日，星期天分分離（來自生物組織）、擴增（設計引物，PCR擴增）mRNA-------DNA------擴增第40頁,共83頁，2024年2月25日，星期天引物設計與訂購酶切位點雙酶切、保護堿基、最合適的緩沖液。引物訂購第41頁,共83頁，2024年2月25日，星期天保護堿基第42頁,共83頁，2024年2月25日，星期天1.用限制性酶消化

DNA樣品第43頁,共83頁，2024年2月25日，星期天單酶切第44頁,共83頁，2024年2月25日，星期天雙酶切第45頁,共83頁，2024年2月25日，星期天選擇合適的雙酶切緩沖液第46頁,共83頁，2024年2月25日，星期天2.用限制性內(nèi)切酶消化質粒DNA第47頁,共83頁，2024年2月25日，星期天3.連接樣品DNA和質粒DNA的消化產(chǎn)物第48頁,共83頁，2024年2月25日，星期天連接前最好要定量連接比例摩爾比例為： 插入片度：質粒=10:1---5:1為佳。質粒幾十個ng為佳。第49頁,共83頁，2024年2月25日，星期天雙酶切EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。第50頁,共83頁，2024年2月25日，星期天冷循環(huán)器第51頁,共83頁，2024年2月25日，星期天4.用連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞轉化細菌有兩個基本方法。一是

化學法，即用CaCl2

處理并加熱激以促進DNA進入菌體；二是電激法，即

施加短脈沖的電荷以促進DNA吸收。第52頁,共83頁，2024年2月25日，星期天用氯化鈣化學轉化第53頁,共83頁，2024年2月25日，星期天用氯化鈣化學轉化第54頁,共83頁，2024年2月25日，星期天電激轉化第55頁,共83頁，2024年2月25日，星期天一個電激轉化程序加50-200ngDNA到40ul電激感受態(tài)細菌中將混合物放入一個預冷的電激杯中施以脈沖電處理，脈沖長度預期值為8to12ms立即加1mlLB培養(yǎng)液，在室溫下振蕩2-4小時。

分別取10ul和100ul涂布在到兩個加有抗菌素的LB瓊脂平板上，保溫培養(yǎng)1天。第56頁,共83頁，2024年2月25日，星期天5.

細菌在加有Amp+X-Gal的培養(yǎng)基上生長以進行篩選連接會有三種結果，一是要插入的序列自連；二是切開的質粒重連；三是要插入的序列與質粒相連。第一種連接結果沒有菌落形成。第二種連接結果表現(xiàn)為藍色菌落。只有后一種結果是符合需要的，產(chǎn)生白色的抗氨芐青霉素菌落。第57頁,共83頁，2024年2月25日，星期天滅菌器第58頁,共83頁，2024年2月25日，星期天加IPTG和X-GAL第59頁,共83頁，2024年2月25日，星期天倒平板第60頁,共83頁，2024年2月25日，星期天

α互補利用α互補原理篩選重組體pUC18第61頁,共83頁，2024年2月25日，星期天篩選結果藍菌落代表含有質粒的耐藥菌，表達出由完好的α

LacZ序列編碼的功能性的

α

片段。白菌落代表含有質粒的耐氨芐青霉素菌，質粒上α

LacZ序列上有插入片段。第62頁,共83頁，2024年2月25日，星期天乳糖和誘導物IPTG的化學結構isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside第63頁,共83頁，2024年2月25日，星期天X-galX-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下會產(chǎn)生藍色產(chǎn)物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色檢測以及藍白斑篩選。

第64頁,共83頁，2024年2月25日，星期天X-gal水解第65頁,共83頁，2024年2月25日，星期天篩選結果模式圖第66頁,共83頁，2024年2月25日，星期天藍菌落建議用DH5α做宿主菌。

第67頁,共83頁，2024年2月25日，星期天藍白菌落第68頁,共83頁，2024年2月25日，星期天電泳儀第69頁,共83頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)過雙酶切、PCR等鑒定，送陽性克隆測序。提取正確的克隆菌中的質粒，轉入表達型的菌株，如BL21等。誘導表達蛋白第70頁,共83頁，2024年2月25日，星期天鑒定方法第71頁,共83頁，2024年2月25日，星期天

PCR鑒定第72頁,共83頁，2024年2月25日，星期天

原位雜交第73頁,共83頁，2024年2月25日，星期天雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法第74頁,共83頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的純化第75頁,共83頁，2024年2月25日，星期天謝 謝！第76頁,共83頁，2024年2月25日，星期天多利誕生的過程

為什么震驚和驚呼，我們先了解一下多利誕生的過程以及胚胎細胞克隆和體細胞克隆的區(qū)別這兩個基本問題，對我們學習后面內(nèi)容或許有所幫助和啟發(fā)。多利誕生的過程：

1.取出第一只成年母羊乳腺的普通細胞，分離基因備用。

2.取出第二只母羊未受精的卵細胞，取出基因換上第一只羊乳腺細胞基因（“掉包”），放電激活該卵細胞，使之象正常受精卵一樣