牛結(jié)節(jié)性皮膚病的實(shí)驗(yàn)室診斷與防治

摘要：結(jié)節(jié)性皮膚?。↙SD），是一種新興的跨界病毒性痘病，影響所有年齡和品種的牛。是由山羊痘病毒屬結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LumpySkinDiseaseVirus,LSDV)

引起的傳染病,

牛和亞洲水牛均可感染，是牲畜的病毒性疾病，可引起皮膚和內(nèi)部損害，影響牛奶產(chǎn)量，生皮質(zhì)量，并可導(dǎo)致被感染動(dòng)物死亡。采血液，使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在實(shí)驗(yàn)室對(duì)死亡和懷疑感染的動(dòng)物和牛的內(nèi)臟或病變進(jìn)行測(cè)試。對(duì)其可采取包括行動(dòng)限制，病媒控制和疫苗接種在內(nèi)的預(yù)防措施，以減緩疾病的傳播。01病原病原是結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSDV），屬DNA病毒羊痘的痘病毒家族包括羊痘病毒（SPV），山羊痘病毒（GPV）和LSDV，具有97％的核苷酸同一性，并且在血清學(xué)上具有交叉保護(hù)作用。盡管Capripox的其他菌株感染綿羊和山羊，但LSDV與牛有關(guān)。LSDV以兩種傳染形式存在：具有單個(gè)外膜的成熟病毒體（MVS）和專門用于細(xì)胞間擴(kuò)散的包膜病毒體（EV）具有附加膜。02簡(jiǎn)介宿主對(duì)LSDV感染的易感性受許多因素影響。CaPV感染的免疫主要是細(xì)胞介導(dǎo)的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)子代病毒仍保留在被感染的細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)在本地直接在細(xì)胞之間傳播，該病毒不在循環(huán)抗體的范圍內(nèi)。通過(guò)從受感染細(xì)胞中萌芽釋放的細(xì)胞外包膜病毒體，可能感染鄰近細(xì)胞或逃逸到血液中，并在全身傳播。LSDV的傳播是通過(guò)蚊子，蒼蠅和蜱。

已知對(duì)牛的LSDV感染具有天然抵抗力，并且亞臨床LSDV感染很常見(jiàn)。LSDV造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，主要是由于導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量嚴(yán)重下降，體重減輕，流產(chǎn)，不育和生皮損害。為了成功地控制LSD，所有易感動(dòng)物的疫苗接種被認(rèn)為是主要支柱，并輔之以其他控制措施，例如撲滅，動(dòng)物移動(dòng)限制和媒介控制。03臨床特征該疾病的特征是發(fā)燒、皮膚黏膜和內(nèi)臟器官上的結(jié)節(jié)性病變。可能會(huì)出現(xiàn)牛奶產(chǎn)量減少，生皮受損，暫時(shí)或永久不育和受感染動(dòng)物死亡的情況，從而在受影響的國(guó)家造成重大的經(jīng)濟(jì)后果。臨床體征的嚴(yán)重程度取決于病毒的株系和被感染牛的品種。傳播主要是通過(guò)叮咬昆蟲(chóng)的間接接觸。LSDV的平均潛伏期為6～9d。該疾病的平均死亡率約為10％。04材料與方法動(dòng)物和組織采樣

從受影響的動(dòng)物中收集生物標(biāo)本。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。從患病動(dòng)物的脖子和頭部收集結(jié)節(jié)性皮膚病變的皮膚刮擦5mL血樣。尸檢是對(duì)表現(xiàn)出與LSD一致的病死牛進(jìn)行的。從這些動(dòng)物中收集肺，腎，肝和心臟的一小部分進(jìn)行測(cè)試。

制備樣品，在提取DNA之前，將皮膚樣品置于磷酸鹽緩沖液（1XPBS）中1h。一塊（約1.3cm2用剪刀將每個(gè)內(nèi)部器官（肝，腎，心臟和肺）切成小塊，并匯集在一起（總量不超過(guò)5g）。使用研缽和研棒，少量研磨加入8mL1×PBS的樣品。將樣品（皮膚或合并的內(nèi)部器官）勻漿。勻漿后，將漿液倒入15mLEP中，并以8000rpm離心10min。將所得的上清液中提取DNA。試劑盒還可用于從血液樣本中提取DNA。研缽和研棒之間用漂白劑消毒。

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

抗體檢測(cè)：采集全血，分離血清用于抗體檢測(cè)，可采用病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法。

病毒中和試驗(yàn)

使用標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)試血清樣本（n=80），該程序?qū)⒅泻椭笖?shù)確定為首選方法。針對(duì)恒定稀釋的測(cè)試血清滴定病毒株。以此方式，需要更大體積的測(cè)試血清，但是消除了確保50％組織培養(yǎng)物感染劑量（TCID50）為100的困難。根據(jù)可用的OIE程序，使用羊睪丸（LTe）細(xì)胞在96孔板中進(jìn)行測(cè)試。

病原檢測(cè)：采集皮膚結(jié)痂、口鼻拭子、抗凝血等用于病原檢測(cè)。病毒核酸檢測(cè)可采用實(shí)時(shí)PCR等方法，病毒分離鑒定可采用細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒，動(dòng)物回歸試驗(yàn)等方法。

實(shí)時(shí)PCR測(cè)試

內(nèi)部器官樣本進(jìn)行檢測(cè)。使用Taq聚合酶，10xPCR緩沖液，50mMMgCl2和10mMdNTPs制備PCR主混合物。將總共5μL提取的樣品DNA或模板對(duì)照添加到15μL制備的預(yù)混液中，總體積為20μL。使用對(duì)應(yīng)的熱循環(huán)條件，在PCR儀器上進(jìn)行反應(yīng)。在樣品測(cè)試之前，將陽(yáng)性模板對(duì)照（PTC）從1pg/μL連續(xù)稀釋至0.001fg/μL，并在PCR儀器上運(yùn)行。合成循環(huán)閾值（CT）vs.PTC濃度曲線的對(duì)數(shù)給出3.76的斜率，對(duì)應(yīng)于92％的擴(kuò)增效率（每個(gè)循環(huán)100％加倍）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在后續(xù)測(cè)量中使用濃度為1fg