DB32T4058-2021載脂蛋白B羊多抗血清制備技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20

CCSB42

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T4058—2021

載脂蛋白B羊多抗血清制備技術(shù)規(guī)程

TechnicalregulationofapolipoproteinBsheepmultipleantiserum

2021-06-03發(fā)布2021-07-03實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T4058-2021

載脂蛋白B羊多抗血清制備技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了載脂蛋白B羊多抗血清制備技術(shù)規(guī)程的羊品種選擇和飼養(yǎng)要求、免疫佐劑選用、抗原

乳化、免疫劑量和部位、抗體檢測(cè)、采血、血清分離、羊血清保存、記錄。

本文件適用于羊多抗血清的制備。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

載脂蛋白BApolipoproteinB

載脂蛋白是血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，它的基本功能是運(yùn)輸血液當(dāng)中的脂類。載脂蛋白B，由于

氨基酸組成的不同，分為載脂蛋白B48和載脂蛋白B100。載脂蛋白B48是乳糜微粒的載脂蛋白，載脂蛋

白B100是極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的載脂蛋白。

3.2

乳化emulsification

乳化是一種液體以極微小液滴均勻地分散在互不相溶的另一種液體中的作用。乳化是液-液界面現(xiàn)

象，兩種不相溶的液體，如油與水，在容器中分成兩層，密度小的油在上層，密度大的水在下層。若加

入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┰趶?qiáng)烈的攪拌下，油被分散在水中，形成乳狀液，該過程叫乳化。

3.3

佐劑adjuvant

非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)與抗原一起注射或預(yù)先注入機(jī)體時(shí)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變

免疫應(yīng)答類型。佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制是通過改變抗原的物理形狀，延長(zhǎng)抗原在機(jī)體內(nèi)保留時(shí)間，刺

激單核吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的遞呈能力，刺激淋巴細(xì)胞分化，增強(qiáng)擴(kuò)大免疫應(yīng)答能力。

4羊品種選擇和飼養(yǎng)要求

選用體重約35kg的健康青年羊公羊，年齡在10月齡至2周歲。免疫前全部打上耳標(biāo)，采用群養(yǎng)放牧

飼養(yǎng)方式，白天放牧4h，上午、下午各2h，晚上添加少量精料，有利于羊只身體健壯，避免過肥，自

動(dòng)飲水，每天早晚各觀察１次羊的健康狀況。

DB32/T4058-2021

5免疫佐劑選用

首次免疫佐劑采用sigma完全弗氏佐劑，從第二次免疫開始，采用ISA206佐劑。

6抗原乳化

采用高速剪切法乳化抗原。將佐劑按需要量放置在乳化容器中，乳化容器需放置在降溫夾套中，用

漩渦混合器使之高速旋轉(zhuǎn)，5?號(hào)針頭逐滴加入載脂蛋白B抗原溶液，待前滴抗原溶液完全消失后，再加

入第二滴抗原溶液；抗原溶液全部加完后，再混合15min。

7免疫劑量和部位

免疫劑量和部位見表1.。

表1免疫劑量和部位

次數(shù)間隔時(shí)間（d）免疫接種部位免疫劑量（mg）

第一次免疫接種15腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)，足窩注射2

第二次免疫接種9腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)，腹股溝淋巴結(jié)點(diǎn)的免疫2

第三次免疫接種9腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)2

第四次免疫接種9腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)2

第五次免疫接種9腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)2

8抗體檢測(cè)

8.1外觀

應(yīng)呈黃色或微紅色血清狀液體、允許少量的絮狀物或沉淀。

8.2效價(jià)測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,效價(jià)不低于≥1：256。

9采血

在第五次免疫后，檢測(cè)抗體水平，達(dá)到效價(jià)要求后，采用動(dòng)脈一次性采血。血液用250mL玻璃瓶

收集，血液占玻璃瓶的1/5。

10血清分離

把收集好血液的玻璃瓶，放在37℃恒溫水浴鍋中一個(gè)小時(shí)，把玻璃瓶從水浴鍋中取出；再把血清

從玻璃瓶中吸出；用低速離心機(jī)4500rmp/min，離心15min，取上清液，顏色為乳白色或微黃色，去掉

沉淀物雜質(zhì)。

DB32/T4058-2021

11血清保存

用玻璃瓶收集血清，放在-20℃保存3年，或-70℃保存6年冰柜保存。

12記錄

對(duì)生產(chǎn)全過程進(jìn)行記錄，生產(chǎn)檔案保存血清，沒有用完血清繼續(xù)保存用完。

__________________________

DB32/T4058-2021

前?言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提出。

本文件由江蘇省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本文件起草單位：江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、江蘇大學(xué)、江蘇省句容市茅山管委會(huì)、江蘇

省農(nóng)科院畜牧研究所、鎮(zhèn)江萬(wàn)山紅遍農(nóng)業(yè)園。

本文件主要起草人：徐志偉、徐一然、周金桂、王慧娟、花衛(wèi)華、徐小波、于建寧、朱明空、朱建

飛、魯群。

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載脂蛋白B羊多抗血清制備技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了載脂蛋白B羊多抗血清制備技術(shù)規(guī)程的羊品種選擇和飼養(yǎng)要求、免疫佐劑選用、抗原

乳化、免疫劑量和部位、抗體檢測(cè)、采血、血清分離、羊血清保存、記錄。

本文件適用于羊多抗血清的制備。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

載脂蛋白BApolipoproteinB

載脂蛋白是血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，它的基本功能是運(yùn)輸血液當(dāng)中的脂類。載脂蛋白B，由于

氨基酸組成的不同，分為載脂蛋白B48和載脂蛋白B100。載脂蛋白B48是乳糜微粒的載脂蛋白，載脂蛋

白B100是極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的載脂蛋白。

3.2

乳化emulsification

乳化是一種液體以極微小液滴均勻地分散在互不相溶的另一種液體中的作用。乳化是液-液界面現(xiàn)

象，兩種不相溶的液體，如油與水，在容器中分成兩層，密度小的油在上層，密度大的水在下層。若加

入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┰趶?qiáng)烈的攪拌下，油被分散在水中，形成乳狀液，該過程叫乳化。

3.3

佐劑adjuvant

非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)與抗原一起注射或預(yù)先注入機(jī)體時(shí)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變

免疫應(yīng)答類型。佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制是通過改變抗原的物理形狀，延長(zhǎng)抗原在機(jī)體內(nèi)保留時(shí)間，刺

激單核吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的遞呈能力，刺激淋巴細(xì)胞分化，增強(qiáng)擴(kuò)大免疫應(yīng)答能力。

4羊品種選擇和飼養(yǎng)要求

選用體重約35kg的健康青年羊公羊，年齡在10月齡至2周歲。免疫前全部打上耳標(biāo)，采用群養(yǎng)放牧

飼養(yǎng)方式，白天放牧4h，上午、下午各2h，晚上添加少量精料，有利于羊只身體健壯，避免過肥，自

動(dòng)飲水，每天早晚各觀察１次羊的健康狀況。

DB32/T4058-2021

5免疫佐劑選用

首次免疫佐劑采用sigma完全弗氏佐劑，從第二次免疫開始，采用ISA206佐劑。

6抗原乳化

采用高速剪切法乳化抗原。將佐劑按需要量放置在乳化容器中，乳化容器需放置在降溫夾套中，用

漩渦混合器使之高速旋轉(zhuǎn)，5?號(hào)針頭逐滴加入載脂蛋白B抗原溶液，待前滴抗原溶液完全消失后，再加

入第二滴抗原溶液；抗原溶液全部加完后，再混合15min。

7免疫劑量和部位

免疫劑量和部位見表1.。

表1免疫劑量和部位

次數(shù)間隔時(shí)間（d）免疫接種部位免疫劑量（mg）

第一次免疫接種15腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)，足窩注射2

第二次免疫接種9腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)，腹股溝淋巴結(jié)點(diǎn)的免疫2

第三次免疫接種9腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)2

第四次免疫接種9腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)2

第五次免疫接種9腹股溝、肘部、耳后、額下、背側(cè)2

8抗體檢測(cè)

8.1外觀

應(yīng)呈黃色或微紅色血清狀液體、允許少量的絮狀物或沉淀。

8.2效價(jià)測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,效價(jià)不低于≥1：256。

9采血

在第五次免疫后，檢測(cè)抗體水平，達(dá)到效價(jià)要求后，采用動(dòng)脈一次性采血。血液用250mL玻璃瓶

收集，血液占玻璃瓶的1/5。

10血清分離

把收集好血液的玻璃瓶，放在37℃恒溫水浴鍋中一個(gè)小時(shí)，把玻璃瓶從水浴鍋中取出；再把血清

從玻璃瓶中吸出；用低速離心機(jī)4500rmp/min，離心15min，取上