高效液相色譜法

高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高效快速的分離分析技術(shù).液相色譜法是指流動(dòng)相為液體的色譜技術(shù).在經(jīng)典的液體柱色譜法的基礎(chǔ)上,引入了氣相色譜法的理論,在技術(shù)上采用了高壓泵(一般在150-350×105Pa),高效固定相和高靈敏度(ng,pg級(jí))的檢測(cè)器,實(shí)現(xiàn)了分析速度快,分離效率高和操作自動(dòng)化.第2頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天主要特點(diǎn):

高壓:一般在150-350×105Pa

高速:一般在1h之內(nèi)完成分析高效:GC2000塔板/米;LC30000塔板/米高靈敏:

10-9gng

10-11gpg第3頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天

HPLC的原理及特點(diǎn)HPLC的主要類型及其分離原理HPLC的固定相選擇

HPLC的流動(dòng)相選擇HPLC儀器及評(píng)價(jià)HPLC的應(yīng)用第4頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天toMSPressuregaugeFilterPrecolumnHighpressurepumpMixingvesselInjectionportTowasteDetectorAutosamplerAnalyticalcolumnSignalcollectionPulsedamperSolvent1Solvent2ReservoirsDegasser1VacuumpumpDegasser2第5頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜原理ConcentrationinPhaseAConcentrationinPhaseBKD=第6頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜原理高效液相色譜是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次的交換過(guò)程，它借助溶質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)、親和力、吸附能力、離子交換、分子大小引起的排阻作用等差別使不同溶質(zhì)進(jìn)行分離（分離條件）。分離過(guò)程受溶質(zhì)在兩相的擴(kuò)散系數(shù)、固定相填料的顆粒大小、填充密度、流動(dòng)相組成及流速等因素影響。流動(dòng)相固定相第7頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜原理--分離過(guò)程ISDC第8頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜參數(shù)--保留值保留時(shí)間

tR

保留體積VR=tRF,死時(shí)間

tM

調(diào)整保留時(shí)間t`R=tR-tM

調(diào)整保留體積V`R=t`RF

第9頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜參數(shù)--容量因子、選擇性、相對(duì)保留值容量因子k`==K=物質(zhì)在固定相上的量qs物質(zhì)在流動(dòng)相上的量qmVsVmtR-t`RtM相對(duì)保留值a=t`R(2)t`R(1)

選擇性a`==tR(2)tR(1)

1+k`(2)1+k`(1)(a`-1)=(a-1)k`(1)1+k`(1)第10頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜參數(shù)--柱效h=h0exp{-}(t–tR)22

2理論塔板數(shù)N=()2

tR

N有效=N()2k`1+k`H有效=H()2

1+k`k`第11頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜參數(shù)—分離度和分離效能總指標(biāo)R=

2{tR(2)-tR(1)}W1+W2K1=

2{tR(2)-tR(1)}W1/2(1)+W1/2(2)R=0.59K1其它參數(shù)：譜帶擴(kuò)張和滲透性第12頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天

提高柱效—改變色譜峰的寬窄

提高選擇性—改變色譜峰的間距第13頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天

高效液相色譜法的原理及參數(shù)

HPLC分類

HPLC儀器及評(píng)價(jià)

HPLC的應(yīng)用常見(jiàn)問(wèn)題及注意事項(xiàng)第14頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天體積排阻色譜(SizeExclusionChrom.)反相色譜(ReversedPhaseChrom.)離子交換色譜(IonExchangeChrom.)疏水作用色譜(HydrophobicInteraction)親和色譜(AffinityChrom.)金屬鏊和色譜(ChelatingChrom.)第15頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天SizeExclusion

Chromatography常用填料：硅膠、甘油基丙基鍵合、交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖、甲基丙烯酸酯等。主要公司：Merk,Pharmacia,Tosoh,Waters,Synchrom…(SEC,GFC,GPC)第16頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天SizeExclusionChromatography

Buffer:PBS+NaClTris-HCl+NaClGradient:No主要用于：測(cè)定分子量；目標(biāo)蛋白的純化，脫鹽等.柱的選擇：能夠分離相對(duì)分子量的上下限為:100-800000，孔徑等30KD50KD第17頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天IonExchangeChromproteinBProtein

BproteinBProtein

BProtein

AProteinANa+SO3+--CM常用填料：磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、表面改性硅膠等…分類：陽(yáng)離子交換、陰離子交換第18頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天IonExchangeChromBuffer:PBS+NaClTris-HCl+NaClGradient:Yes柱的選擇：當(dāng)溶質(zhì)在pH一定的流動(dòng)相中帶正電荷，

選用陽(yáng)離子交換柱，否則用陰離子交換柱影響因素：鹽的類型，離子強(qiáng)度，pH影響選擇性和分離度resin-O-(CH2)2-NH+

--NCH3+CH2CH3CH2CH3resin-O-CH2-COO-resin-O-(CH2)3-SO3-第19頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天IonExchangeChrom第20頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天Affinity

Chromatography基質(zhì)配基目標(biāo)產(chǎn)物填料：基質(zhì)---纖維素、凝集素、交聯(lián)瓊脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃…配基---抗體、凝集素、酶、抑制劑、抗生素、配位體…第21頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天AffinityChromatographyUVabsorbanceFreeligandconcentration柱的選擇：根據(jù)被分離目標(biāo)產(chǎn)物的特點(diǎn)選擇合適的色譜柱，重要是配基。影響因素：配基容易被雜質(zhì)污染，柱子的壽命短，樣品須前處理。主要用于純化較為昂貴的蛋白，抗體等。Buffer:含有可以與基質(zhì)上的配基結(jié)合物的溶液Gradient:Yes第22頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天HydrophobicinteractionChromatography

proteinsurface---+++-nonpolarnonpolar填料：基質(zhì)：有機(jī)聚合物（交聯(lián)瓊脂糖、乙烯聚合物、TSK-PW）和大孔硅膠鍵合相配基：苯基、戊基、丁基、羥丙基、乙基、聚乙二醇、芐基等H3C-C-N-C-O-H3C-C-N-C-O-NHOH3C-C-N-C-O-NHOONH第23頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天decreasingsaltconcentrationUVabsorbanceHydrophobicInteractionChromatography柱的選擇：根據(jù)被分離目標(biāo)產(chǎn)物的疏水性選擇合適的色譜柱，基質(zhì)和配基的類型是關(guān)鍵。影響因素：鹽的種類，離子強(qiáng)度，溶液的pH以及溫度對(duì)疏水作用都影響較大。Buffer:

常用：(NH4)2SO4,PBS,pH4~8Gradient:Yes第24頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天ReversedPhaseChromatography反相色譜是指流動(dòng)相的極性大于固定相的分離體系，其分離機(jī)理主要基于溶質(zhì)與固定相疏水作用的差別填料：基質(zhì)：硅膠配基：

C18,C8,C4,Phenyl硅膠硅膠第25頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天ReversedPhaseChromatography柱的選擇：根據(jù)被分離目標(biāo)產(chǎn)物的疏水性及分子大小選擇合適的色譜柱。C18穩(wěn)定性高，有效孔徑小，對(duì)分離蛋白容易產(chǎn)生不可逆吸附。影響因素：流動(dòng)相的組成，溶液的pH以及溫度。第26頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天ComparisonbetweenRPCandHIC

RPCHIC分離機(jī)理強(qiáng)疏水性弱疏水性配基C18,C8,C4,Phenyl

復(fù)雜流動(dòng)相有機(jī)相，水相，梯度蛋白的分離容易失活失活<10%

常用于分析可用于制備可分離物

范圍較大相對(duì)較小操作方式

高壓常壓第27頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天ComparisonbetweenRPCandNPC正相色譜-流動(dòng)相的極性小于固定相的分離體系；機(jī)理-被分離化合物的極性基團(tuán)與固定相的極性基團(tuán)相互作用；流動(dòng)相-非極性的有機(jī)溶劑加入極性的有機(jī)溶劑；分離-異構(gòu)體，易水解，在極性溶劑中溶解度小的物質(zhì)。反相色譜-流動(dòng)相的極性小于固定相的分離體系；機(jī)理-被分離物的與固定相的疏水相互作用力的差別；流動(dòng)相-極性的有機(jī)溶劑或水；分離-范圍最廣。RPCNPC第28頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天液相色譜固定相1、液液色譜法及離子色譜法固定相全多孔型擔(dān)體表面多孔型擔(dān)體

化學(xué)鍵合固定相

Si-O-CSi-O-Si-CSi-CSi-N

Si-O-Si-C化學(xué)鍵穩(wěn)定，耐水、耐熱、耐有機(jī)溶劑，第29頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天化學(xué)鍵合固定相具有的特點(diǎn)：1）表面沒(méi)有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快。2）無(wú)固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命。3）可以鍵合不同官能團(tuán)，能靈活的改變選擇性4）有利于梯度洗滌，有利于配用靈敏檢測(cè)器和餾分的收集第30頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天2液固吸附色譜法固定相

硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等3離子交換色譜法固定相

薄膜型離子交換樹(shù)脂

離子交換鍵合固定相

陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)酸性、弱酸性樹(shù)脂）

陰離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)堿性、弱堿性樹(shù)脂）第31頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天4空間排阻色譜固定相

軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠水為流動(dòng)相

半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠(交聯(lián)聚苯乙烯凝膠)適用于非極性有機(jī)溶劑,丙酮乙醇等極性溶劑不能用.

硬質(zhì)凝膠

多孔硅膠多孔玻璃珠等第32頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天液相色譜流動(dòng)相

GCN2H2HeLC流動(dòng)相的種類,流動(dòng)相的配比能顯著影響分離效果.流動(dòng)相選擇:

1)流動(dòng)相純度AR2)應(yīng)避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑

3)對(duì)樣品要有適宜的溶解度

4)溶劑的黏度小一些為好

5)應(yīng)與檢測(cè)器相匹配第33頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用溶劑的極性順序:

水(極性最大),甲酰胺,乙腈,甲醇,乙醇,丙醇,丙酮,四氫呋喃,甲乙酮,正丁醇,乙酸乙酯,乙醚,二氯甲烷,氯仿,溴乙烷,苯,甲苯,四氯化碳,二硫化碳,環(huán)己烷,己烷,庚烷,煤油,石油醚(極性最小).第34頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天

為了獲得合適的溶劑強(qiáng)度(極性),常采用二元或多元組合的溶劑體系作為流動(dòng)相.采用的溶劑可分為底劑及洗脫劑兩部分底劑決定基本的色譜分離,洗脫劑具有對(duì)組分選擇性分離

正相色譜中底劑采用低極性溶劑,洗脫劑選擇極性較強(qiáng)的溶劑.

反相色譜中底劑采用強(qiáng)極性溶劑(水),洗脫劑選擇極性較弱的溶劑(有機(jī)溶劑).第35頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天

離子交換色譜主要在含水介質(zhì)中進(jìn)行,組分保留值可以用流動(dòng)相中鹽的濃度和pH來(lái)控制,增加鹽的濃度導(dǎo)致保留值降低,由于流動(dòng)相離子與交換樹(shù)脂相互作用力不同,因此流動(dòng)相中離子類型對(duì)樣品組分的保留值有顯著影響.一般陰離子的滯留次序?yàn)?

檸檬酸離子＞SO4

＞草酸離子＞I＞NO3

＞CrO4

＞Br＞SCN＞Cl＞HCOO＞CH3COO＞OH＞F一般陽(yáng)離子的滯留次序?yàn)?Ba

＞Pb＞Ca＞Ni＞Cd＞Cu＞Co＞Zn＞Mg＞Rb＞K＞NH4＞Na＞H＞Li第36頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天

排阻色譜法所用的溶劑必須與凝膠本身相似,才能潤(rùn)濕凝膠并防止吸附.

一般情況下,

對(duì)分離高分子有機(jī)化合物采用溶劑主要是四氫呋喃,甲苯,間甲苯,苯酚,NN-二甲基甲酰胺等.

生物物質(zhì)的分離主要用水,緩沖鹽溶液,乙醇及丙酮等.第37頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC分離類型的選擇

應(yīng)用HPLC對(duì)樣品進(jìn)行分離分析應(yīng)考慮各種因素,包括樣品的性質(zhì)(相對(duì)分子量,化學(xué)結(jié)構(gòu),極性,溶解度參數(shù)等化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)),液相色譜分離的類型的特點(diǎn)及應(yīng)用范圍,實(shí)驗(yàn)室條件(儀器,色譜柱,檢測(cè)器等)等因素.

相對(duì)分子量較低,揮發(fā)性較高的試樣適用于GC分析.

標(biāo)準(zhǔn)的LC類型(液-固,液-液,離子交換,離子對(duì)色譜,離子色譜等)適用于分離相對(duì)分子量為200到2000的試樣,而大于2000的則用空間排阻色譜.

第38頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天試樣相對(duì)分子量相對(duì)分子量大于2000小于2000不溶于水溶于水排阻色譜,水為流動(dòng)相排阻色譜,非水流動(dòng)相不溶于水同系物—正相或反相色譜異構(gòu)體多官能團(tuán)—吸附色譜分子量大小差異—排阻色譜溶于水,不離解反相色譜排阻色譜,水為流動(dòng)相溶于水,可離解堿-----陽(yáng)離交換色譜酸-----陰離交換色譜溶于水,離子和非離子反相離子對(duì)色譜

第39頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天toMSPressuregaugeFilterPrecolumnHighpressurepumpMixingvesselInjectionportTowasteDetectorAutosamplerAnalyticalcolumnSignalcollectionPulsedamperSolvent1Solvent2ReservoirsDegasser1VacuumpumpDegasser2第40頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天第41頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天DegasserMembraneVacuumchamberPressuresensorControllerThree-wayvalveVacuumpumpHPLCpumpEluent高效液相色譜儀單元介紹第42頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天PumpPPtt第43頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天PumptowastePurgevalveABCDtomixingchamberAB四元梯度泵--低壓混合二元梯度泵--高壓混合比例伐第44頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天Damper第45頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天Autosampler第46頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天Injectionport第47頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天DetectorConductivityDetector

UV/VisDetectorFixedWavelengthDetector

variablewavelengthdetectorPhotoDiodeArrayDetector

RefractiveIndexDetector

FluorescenceDetector

ElectrochemicalDetectorMassSpectrometryEvaporativeLightScatteringDetector

第48頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天UV/Vis--FixedWavelengthDetector第49頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天UV/Vis--variablewavelengthdetectorTheUV/Vissourceusuallycomesfromamonochromatorsothewavelengthcanbeselected,orscanned.Absorbanceincreasesaseluatepassesthroughthecell.Ifwavelengthscanningisdesired,theflowisstoppedlongenoughforthescantotakeplace.第50頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天UV/Vis--PhotoDiodeArrayDetector第51頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天ConductivityDetectorSensitivitiesforcompoundssuchasphenol,catecholamines,nitrosamines,andorganicacidsareinthepicomole(nanogram)Themobilephasemustbemadeelectricallyconductive,usuallybytheadditionofasuitablesalt第52頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天RefractiveIndexDetectorAvalveisopenedandpuresolventpassesintoonehalfofacell.Theeluateflowsthroughtheotherhalfofthecell.Thetwohalvesareseparatedbyaglassplatemountedatananglesuchthatbendingoftheincidentbeamoccursifthetwosolutionsdifferinrefractiveindex.第53頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天FluorescenceDetector

Shortpass-transmitsallwavelengthsbelowaspecifiedcutoffLongpass-transmitsallwavelengthsaboveaspecifiedcutoffBandpass-blocksallwavelengthsoutsideaspecifiedband第54頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天ElectrochemicalDetectorDetectorsthatbasedonelectroanalyticalproceduresareavailable.Theyoffertheadvantagesofhighsensitivityandsimplicity第55頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天EvaporativeLightScatteringDetectorThescatteredlightisdetectedbyasiliconephotodiodelocatedat90oanglefromthelaser,thephotodiodeproducesasignalwhichissenttotheanalogoutputsforcollection,alighttrapislocated180ofromthelasertocollectanylightnotscatteredbyparticlesintheaerosolstream第56頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天OtherDetectorProgrammableDetectorsChemiluminescencedetectionRadioactivitydetectionPulsed-amperometricdetectionFT-IR第57頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天ComparisonbetweendifferentdetectorsDetectorCompoundsSensitivityUVUV/Vischromophoressuchasaromatics,aldehydes,ketones1ppbRIUniversal,allcompounds-cannotusegradientmobilephases10ppm