食品理化檢驗食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢驗

食品理化檢驗食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢驗“轉(zhuǎn)基因”是指利用分子生物學手段將外源性基因轉(zhuǎn)移到某種特定生物體中，使其生物性狀或機能發(fā)生部分改變。轉(zhuǎn)基因食品就是以轉(zhuǎn)基因生物體直接作為食品或以其為原料加工生產(chǎn)的食品。轉(zhuǎn)基因食品（GMF）的定義GeneticallyModifiedFoods第2頁,共71頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本步驟

1.辨認能體現(xiàn)所期望特征的目的基因代碼，才可能從具有該基因的天然活體中分離。2.DNA的分離。利用特殊的剪切酶。在特定位點上將供體的DNA分裂成含有目的基因的片段，然后分離、純化。第3頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3.利用載體將目的基因轉(zhuǎn)移，而其中典型的載體是由細菌或病毒的DNA環(huán)型片段組成的4.目的基因的擴大培養(yǎng)及嫁入寄主細胞5.選擇性的標記基因第4頁,共71頁，2024年2月25日，星期天6.為控制基因表達而必需的DNA序列（啟動子、終止子的DNA序列必須結(jié)合其中）7.篩選和繁殖。經(jīng)過轉(zhuǎn)基因的寄主細胞必須經(jīng)過嚴格篩選、測試才能用于食品生產(chǎn)。第5頁,共71頁，2024年2月25日，星期天目前上市的轉(zhuǎn)基因食品

抗除草劑基因大豆

抗蟲基因玉米

抗病毒基因油菜

抗病毒土豆

抗軟化基因西紅柿

轉(zhuǎn)抗蟲基因棉花第6頁,共71頁，2024年2月25日，星期天BT（蘇云金芽胞桿菌）玉米蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生毒害劑的基因除害劑基因與質(zhì)粒結(jié)合

BT玉米含轉(zhuǎn)基因的幼苗植物細胞與重組基因

重組基因在細菌中

細菌共同培養(yǎng)培養(yǎng)擴增細菌

基因重組第7頁,共71頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒細菌細胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，存在于細胞質(zhì)中能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術(shù)中重要的工具。第8頁,共71頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因食品的優(yōu)勢增加作物單位面積產(chǎn)量降低生產(chǎn)成本增強作物抗蟲害、抗病毒能力提高農(nóng)產(chǎn)品的耐貯性，延長保鮮期擺脫季節(jié)、氣候的影響，四季低成本供應(yīng)食品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值提高富含

—胡蘿卜素的轉(zhuǎn)基因“金色水稻”第9頁,共71頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因食品安全性爭論贊同的人：認為該項技術(shù)及其產(chǎn)品能大大提高人們的生活水平懷疑的人：認為它走得“太快”了，在現(xiàn)實生活中可能會產(chǎn)生副作用目前對轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價主要集中在兩個方面，一個是環(huán)境安全性，另一個是食品安全性。第10頁,共71頁，2024年2月25日，星期天英國“普茲臺事件”：1998年，英國羅伊特研究所普茲臺教授說他的實驗證明，幼鼠食用轉(zhuǎn)基因土豆會使內(nèi)臟和免疫系統(tǒng)受損。轉(zhuǎn)基因安全事件第11頁,共71頁，2024年2月25日，星期天美國的“斑蝶事件”：1999年美國康乃爾大學副教授約翰·羅西在《自然》上發(fā)表文章說，一種轉(zhuǎn)基因玉米可產(chǎn)生殺死害蟲的花粉，而身為益蟲的一種美州大蝴蝶食用了這種轉(zhuǎn)基因玉米花粉后有44％死亡。轉(zhuǎn)基因安全事件第12頁,共71頁，2024年2月25日，星期天過敏反應(yīng)問題：對于一種食物過敏的人有時還會對一種以前他們不過敏的食物產(chǎn)生過敏比如：科學家將玉米的某一段基因加入到核桃、小麥和貝類動物的基因中，蛋白質(zhì)也隨基因加了進去，那么，以前吃玉米過敏的人就可能對這些核桃、小麥和貝類食品過敏。營養(yǎng)問題：科學家們認為外來基因會以一種人們目前還不甚了解的方式破壞食物中的營養(yǎng)成分。第13頁,共71頁，2024年2月25日，星期天對抗生素的抵抗作用：當科學家把一個外來基因加入到植物或細菌中去，這個基因會與別的基因連接在一起。人們在服用了這種改良食物后，產(chǎn)生抗藥性對環(huán)境的威脅：不在改良范圍之內(nèi)的其它物種有可能成為改良物種的受害者第14頁,共71頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)特征利用載體系統(tǒng)（細菌質(zhì)粒、病毒的環(huán)形基因）的重組DNA技術(shù)利用物理、化學和生物學等方法將重組DNA導(dǎo)入有機體的技術(shù)轉(zhuǎn)基因食品的特征顯微注射、基因槍等農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法第15頁,共71頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因食品的特征產(chǎn)品特征具有食品或食品添加劑的特征產(chǎn)品的基因組構(gòu)成發(fā)生了改變，并存在外源DNA（基因重組體構(gòu)成元件）產(chǎn)品中存在外源DNA表達產(chǎn)物及其生物活性產(chǎn)品具有基因工程所設(shè)計的性狀和功能第16頁,共71頁，2024年2月25日，星期天基因重組體構(gòu)成元件載體目的基因（定義P184）病毒衣殼蛋白基因病毒衛(wèi)星RNA病毒復(fù)制酶基因蘇云金桿菌殺蟲蛋白基因蛋白酶抑制劑基因植物凝集素基因等第17頁,共71頁，2024年2月25日，星期天調(diào)控元件啟動子（花椰菜花葉病毒的35S啟動子等）終止子（花椰菜花葉病毒的35S終止子等）標記基因和報告基因

標記基因：已知效應(yīng)的基因，能夠使個體具備特定的特征并且通過生理學、形態(tài)學、生物化學或分子生物學檢測能夠發(fā)現(xiàn)其存在的基因?；蛑亟M體構(gòu)成元件第18頁,共71頁，2024年2月25日，星期天標記基因的作用是一種已知功能或已知序列的基因，能夠起著特異性標記的作用

重組DNA載體的重要標記，用來檢驗?zāi)康幕蜣D(zhuǎn)化成功與否檢測目的基因在細胞中的定位抗生素抗性基因、除草劑抗性基因第19頁,共71頁，2024年2月25日，星期天目的基因是需要表達的基因，標記基因是有一定特點的基因

標記基因與目的基因的區(qū)別大腸桿菌的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因，當這種質(zhì)粒與目的基因組合在一起形成重組質(zhì)粒，并被轉(zhuǎn)入受體細胞后，就可以根據(jù)受體是否具有青霉素抗性來判斷受體細胞是否獲得了目的基因。然后，選擇含有青霉素的培養(yǎng)基來培養(yǎng)受體細胞，能夠在培養(yǎng)基中存活下來的受體細胞就可以認為是成功的導(dǎo)入了外源DNA，標記基因就起作用了

第20頁,共71頁，2024年2月25日，星期天報告基因與標記基因的異同作用與標記基因相同標記基因的缺陷：檢測慢（蛋白酶作用需要時間）依賴外界篩選壓力（如抗生素、除草劑）而報告基因則是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、且不依賴于外界壓力的一類基因。第21頁,共71頁，2024年2月25日，星期天理想的報告基因具備如下要求受體細胞中不存在相應(yīng)內(nèi)源等位基因的活性它的產(chǎn)物是唯一的，且不會損害受體細胞具有快速、廉價、靈敏、定量和可重復(fù)性的檢測特性

常用的報告基因有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、熒光素酶基因（luc）、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）等第22頁,共71頁，2024年2月25日，星期天氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)：可催化乙酰CoA的乙?；D(zhuǎn)移到氯霉素3羥基，而使氯霉素解毒用同位素、熒光素和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測其活性，也可進行蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)和免疫組織化學分析第23頁,共71頁，2024年2月25日，星期天熒光素酶催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶，哺乳細胞無內(nèi)源性熒光素酶。最常用的熒光素酶有細菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶。用熒光比色計即可檢測酶活性。第24頁,共71頁，2024年2月25日，星期天β半乳糖苷酶由大腸桿菌基因編碼，可催化半乳糖苷水解最大優(yōu)勢是易于用免疫組織化學法觀測其原位表達，是最常用的監(jiān)測轉(zhuǎn)染率的報道基因之一以鄰—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)為底物可用標準的比色法檢測酶活性第25頁,共71頁，2024年2月25日，星期天GMF成分檢測外源蛋白質(zhì)的檢測外源基因的檢測蛋白質(zhì)印跡法蛋白芯片試紙條法“側(cè)流”型免疫測定酶聯(lián)免疫吸附試驗PCRSouthern雜交基因芯片定性PCR實時定量熒光PCR法定量競爭性QC-PCR法PCR-ELISA法定量PCR反轉(zhuǎn)錄RT-PCR法其它技術(shù)第26頁,共71頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)勢:

除蛋白芯片法外?？焖?具有一定的靈敏度,也能進行半定量尤其是試紙條法,不需特殊儀器設(shè)備,適用于現(xiàn)場檢驗或初篩外源蛋白質(zhì)檢測方法第27頁,共71頁，2024年2月25日，星期天局限性:1.由于抗原抗體反應(yīng)的專一性,每種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品都要開發(fā)和建立專門的檢測試劑和方法,而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類繁多,要建立所有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的蛋白質(zhì)檢測法工作量很大。

2.只能定性和半定量檢測外源蛋白質(zhì)檢測方法第28頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

3.對于加工過的轉(zhuǎn)基因食品,其蛋白質(zhì)很容易被破壞,從而影響檢測結(jié)果的準確性。

4.有些插入基因根本不表達或表達量很低，無法檢測。外源蛋白質(zhì)檢測方法第29頁,共71頁，2024年2月25日，星期天載體目的基因調(diào)控元件（啟動子、終止子、增強子）標記基因報告基因PCR檢測外源DNA外源DNA第30頁,共71頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)檢測目的和檢測結(jié)果特異性水平的不同，外源DNA的檢測方法有：初篩試驗：對通用元件的檢測局限性：只能鑒別產(chǎn)品是否含有基因重組體，不能鑒定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類基因特異性試驗?zāi)軝z測不同的目的基因、標記基因或報告基因，區(qū)別不同的植物品系PCR檢測外源DNA第31頁,共71頁，2024年2月25日，星期天組成結(jié)構(gòu)特異性試驗檢測目的基因與調(diào)控基因連接處的核苷酸序列區(qū)段區(qū)別某類植物的各種轉(zhuǎn)基因株系插入位點構(gòu)成特異性試驗區(qū)別同一插入序列在基因組中的不同重組狀態(tài)第32頁,共71頁，2024年2月25日，星期天聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增。步驟

DNA的提取

DNA純化設(shè)計并合成引物探針制備

PCR檢測PCR檢測外源DNA定性、定量第33頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共71頁，2024年2月25日，星期天植物細胞中DNA主要存在于細胞核內(nèi)細胞質(zhì)中的DNA主要存在于線粒體和葉綠體中細胞內(nèi)各種DNA總稱為總DNA進行轉(zhuǎn)基因檢測需要提取的是總DNA95%以上的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA的提取和純化第35頁,共71頁，2024年2月25日，星期天基本原理是：從樣品中釋放DNA，去除其他雜質(zhì)：①去污劑或有機試劑破壞細胞膜，釋放游離DNA②蛋白質(zhì)：蛋白酶或有機試劑去除；③多糖（如果膠、纖維素、淀粉等），以相應(yīng)的酶或有機溶劑（CTAB/氯仿等）去除④脂類：酶或溶劑（如正己烷）去除⑤RNA：RNA酶去除⑥鹽類（提取/裂解緩沖液或沉淀液的殘留物）DNA的提取和純化第36頁,共71頁，2024年2月25日，星期天沉淀法：乙醇和異丙醇等沉淀DNA固體介質(zhì)吸附法：采用陰離子交換樹脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。DNA的提取和純化方法植物總DNA的提取方法苯酚－氯仿法CTAB法SDS法二氧化硅法胍鹽第37頁,共71頁，2024年2月25日，星期天DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑CTAB溶解細胞膜，使蛋白質(zhì)變性，與DNA形成復(fù)合物CTAB與DNA的復(fù)合物在高鹽溶液中可溶，而蛋白質(zhì)、多糖、多酚溶解性降低會沉淀CTAB法提取和純化DNA原理十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)第38頁,共71頁，2024年2月25日，星期天CTAB與DNA的復(fù)合物低鹽溶液中沉淀；而多糖、色素等不沉淀使沉淀物溶于高鹽溶液，加入乙醇和異丙醇沉淀DNACTAB法提取和純化DNA原理兩個關(guān)鍵試劑：CTAB緩沖液——高鹽溶液CTAB沉淀液——低鹽溶液適合糖類和酚類含量較高的樣品第39頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

加入CTAB緩沖液加入氯仿反復(fù)顛倒試管離心取上清加入CTAB沉淀液離心取沉淀CTAB法提取和純化DNA步驟第40頁,共71頁，2024年2月25日，星期天CTAB法提取和純化DNA步驟加入高濃度NaCl溶液加入氯仿離心、取上清液加入異丙醇離心、取沉淀反復(fù)加入乙醇離心、取沉淀自然晾干去離子水或TE緩沖液溶解第41頁,共71頁，2024年2月25日，星期天提純DNA質(zhì)量的檢測電泳原理：

DNA分子在高于等電點的PH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。其遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。第42頁,共71頁，2024年2月25日，星期天260nm、280nm處測定吸光度

A260nm/A280nm在1.6~1.9：純度高，可用A260nm/A280nm＜1.6：蛋白質(zhì)或溶劑污染A260nm/A280nm＞1.9：RNA污染提純DNA純度的檢測用RNA酶或苯酚－氯仿法進一步純化第43頁,共71頁，2024年2月25日，星期天PCR技術(shù)的原理

PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程。在適宜的條件下，人工合成寡核苷酸引物與模板DNA單鏈互補結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，以四種脫氧核苷酸(dNTP)為底物，不斷延伸，使被擴增的基因片斷以幾何倍數(shù)增長。定性PCR的檢測方法第44頁,共71頁，2024年2月25日，星期天變性－退火－延伸模板DNA的變性：加熱至93-95℃，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA離解成為單鏈；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；PCR過程的基本步驟第45頁,共71頁，2024年2月25日，星期天③引物的延伸：溫度升至72℃左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，合成一條與模板DNA單鏈互補鏈。

重復(fù)變性－退火－延伸三個過程，目的基因被擴增放大幾百萬倍。每個循環(huán)需2-4min，整個PCR反應(yīng)需要2-3h。第46頁,共71頁，2024年2月25日，星期天PCR原理示意圖PCR引物與模板結(jié)合示意圖

第47頁,共71頁，2024年2月25日，星期天模板、引物、酶、dNTP和Mg2+是PCR反應(yīng)的五個重要因素，決定了PCR反應(yīng)的成敗。模板DNA：抽提的DNA溶液中含有氯仿、乙醇等有機溶劑、Taq酶抑制劑和雜蛋白等會影響PCR擴增，產(chǎn)生假陰性。PCR反應(yīng)的主要因素第48頁,共71頁，2024年2月25日，星期天②引物：PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度，引物的設(shè)計和合成對PCR結(jié)果起著決定性作用。引物的設(shè)計方法：參考文獻報道常用的效果最佳的引物采用計算機軟件，例如PermierPrimer、Oligo等。在軟件的基礎(chǔ)上輔以人工分析，以達到最佳效果。第49頁,共71頁，2024年2月25日，星期天③TaqDNA聚合酶：是一種耐熱的DNA聚合酶，由于發(fā)現(xiàn)于水生棲熱菌（Thermusaquaticus）內(nèi)，故命名為Taq聚合酶，也稱為TaqDNA聚合酶其活力的高低決定了PCR擴增是否成功最適溫度很高（79℃），使引物在高溫下進行退火和延伸，增加了反應(yīng)的特異性和擴增效率。第50頁,共71頁，2024年2月25日，星期天④dNTP三磷酸脫氧核糖核苷酸的縮寫N代表A、G、C、T等中的一種，是它們的混合物在PCR中起原料作用濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量；濃度過高會導(dǎo)致錯配DNA聚合酶水解下來兩個磷酸后把脫氧單磷酸核苷酸連在DNA模板鏈上第51頁,共71頁，2024年2月25日，星期天⑤Mg2+濃度

Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，直接影響著酶的活性和可靠性Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴增濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少DNA模板、引物和dNTP可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實際濃度第52頁,共71頁，2024年2月25日，星期天假陽性、假陰性引起假陽性現(xiàn)象的原因極微量的目標DNA污染都有可能出現(xiàn)擴增條帶。引物設(shè)計不合適也會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象PCR檢測常見問題第53頁,共71頁，2024年2月25日，星期天引起假陰性現(xiàn)象的原因模板中含有雜蛋白質(zhì)，Taq酶抑制劑，酚、氯仿、乙醇等有機溶劑

DNA量不足

Taq酶失活、酶活降低或量不足引物設(shè)計不合理變性溫度低，時間短退火溫度不適合等等PCR檢測常見問題第54頁,共71頁，2024年2月25日，星期天非特異性擴增：引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體涂抹帶、片狀帶、地毯樣帶（Smear現(xiàn)象）。原因：酶過多或酶質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低等。PCR檢測常見問題第55頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

DNA的提取純化設(shè)置陽性對照、陰性對照確定待測目標序列引物設(shè)計

PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建

PCR擴增電泳及結(jié)果分析轉(zhuǎn)基因成分的PCR檢測一般程序第56頁,共71頁，2024年2月25日，星期天原理通過PCR擴增和凝膠電泳分離可得到大小為170bp的DNA片段，包括花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子和玉米基因組的DNA序列。PCR定性檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系第57頁,共71頁，2024年2月25日，星期天設(shè)計引物正向引物：玉米基因，5ˊ-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG-3ˊ反向引物：CaMV35S啟動子（GeneBank編號：V000141，J02048），5ˊ-TCCATCTTTGGGACCACTGTCG-3ˊ注釋：GeneBank是美國國立衛(wèi)生研究院維護的基因序列數(shù)據(jù)庫，匯集并注釋了所有公開的核酸序列。第58頁,共71頁，2024年2月25日，星期天PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建試劑終濃度加樣體積/μl模板DNA10-50ng2水14.810×PCR緩沖液（不含MgCl2）1×2.5MgCl2溶液2mmol/L2.0dNTP溶液0.4mmol/L1.0正向引物0.5μmol/L1.25反向引物0.5μmol/L1.25Taq酶（5IU/ml）1IU0.2第59頁,共71頁，2024年2月25日，星期天PCR擴增預(yù)變性10min，95℃20s，95℃擴增40s，64℃40s，72℃循環(huán)數(shù)40最終延伸3min，72℃第60頁,共71頁，2024年2月25日，星期天電泳及結(jié)果分析方法：取PCR產(chǎn)物在含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上進行電泳，用紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄PCR產(chǎn)物電泳條帶。結(jié)果：陰性：無電泳條帶陽性：有電泳條帶待測樣品有電泳條帶：含轉(zhuǎn)基因成分無電泳條帶：不含轉(zhuǎn)基因成分170bpM1234

第61頁,共71頁，2024年2月25日，星期天原理特異性強、自動化程度高、不使用溴化乙錠、不污染環(huán)境等特點指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線（標準品）對未知模板進行定量分析的方法。使用的化學物質(zhì)：熒光探針和熒光染料實時熒光定量PCR第62頁,共71頁，2024年2月25日，星期天TaqMan熒光探針PCR擴增時，加入一對引物，同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記了一個報告熒