豬病毒性腹瀉滅活疫苗對(duì)仔豬保護(hù)力研究

自2011年底，由豬流行性腹瀉病毒（porcinediarrheavirus，PEDV）GⅡ群引起的豬流行性腹瀉（PED）在我國(guó)河南暴發(fā)以來(lái)，PEDVGⅡ快速蔓延至全國(guó)各大小豬場(chǎng)，目前已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染?。ˋSF、PRRS、PED）之一。該病主要危害新生仔豬，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水、消瘦、死亡，以7日齡內(nèi)仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重，發(fā)病率與死亡率可高達(dá)100%。生長(zhǎng)育肥豬感染后偶有發(fā)病，死亡率低，但可能長(zhǎng)期排毒，是豬場(chǎng)發(fā)病的病毒來(lái)源之一。對(duì)于PED的防控，疫苗免疫是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的手段。豬流行性腹瀉病毒屬冠狀病毒科（coronaviridae）冠狀病毒屬（coronavirus），核酸為線性單股正鏈RNA，基因組約為28kb，病毒粒子大小約為90～195nm。PEDV基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。纖突蛋白（S）為主要的免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)高水平的保護(hù)性抗體。為了給客戶提供更加安全高效的產(chǎn)品，本研究小組堅(jiān)持持續(xù)對(duì)豬病毒性腹瀉滅活疫苗產(chǎn)品進(jìn)行改進(jìn)升級(jí)。目前通過(guò)提升抗原含量、保存抗原完整免疫原性及優(yōu)化佐劑等，并評(píng)價(jià)其對(duì)仔豬的保護(hù)效力，結(jié)果表明其免疫效力顯著提升，表明大華農(nóng)公司將為客戶提供更加優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料1）疫苗：競(jìng)品1與競(jìng)品2是從市場(chǎng)購(gòu)買的同類產(chǎn)品；止瀉威1、止瀉威2由廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司提供。2）細(xì)胞及主要試劑：Vero細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清公司為Gibco產(chǎn)品。3）試劑盒：IgA試劑盒為IDEXX產(chǎn)品。

4）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：懷孕70日齡一胎母豬（二元雜），從新興某種豬場(chǎng)購(gòu)得。5）攻毒毒株：MJ毒株，P5代，由廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司提供。1.2方法1）試驗(yàn)分組：試驗(yàn)分組與免疫方案如表1。2）攻毒方案：對(duì)止瀉威1、競(jìng)品1、競(jìng)品2免疫組及對(duì)照組所產(chǎn)5～7日齡哺乳仔豬進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為105.0TCID50/頭，攻毒方式為口服。3）中和試驗(yàn)：①生長(zhǎng)良好的Vero細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用DMEM生長(zhǎng)液分散后，稀釋至5～8×105個(gè)/mL，最后將細(xì)胞加入96孔板中，0.1mL/孔，96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)；②待96孔板中Vero細(xì)胞生長(zhǎng)至致密，用DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，200μL/孔/次，最后加入含適量胰蛋白酶DMEM培養(yǎng)液，100μL/孔；③用DMEM2倍系列稀釋血清或乳汁至210，分別取100μL與100μL病毒液（1000TCID50/mL）混合，置于37℃、5%CO2孵育1h，每個(gè)稀釋度重復(fù)4次；④去除步驟②中96孔板中培養(yǎng)液，每孔加入200μL血清或乳汁稀釋液與病毒混合液，置于37℃、5%CO2孵育1h后，棄除，用DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，200μL/孔/次，最后加入含適量胰蛋白酶DMEM培養(yǎng)液，200μL/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)5～7d；⑤同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和陰性血清對(duì)照；⑥每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）；⑦50%血清中和終點(diǎn)的計(jì)算：50%細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）的血清稀釋度。根據(jù)細(xì)胞病變程度，用Reed-Muench法計(jì)算50%血清中和滴度。4）抗體檢測(cè)：IgG抗體與IgA抗體檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。2

結(jié)果2.1抗體檢測(cè)結(jié)果1）血清中和抗體：該批母豬為一胎母豬，免疫前抗體小部分母豬為陽(yáng)性（見圖1中免疫前中和抗體結(jié)果）。將母豬隨機(jī)分組進(jìn)行2次免疫后，在二免后2周，從誘導(dǎo)血清中和抗體水平（見圖2）來(lái)看，止瀉威誘導(dǎo)中和抗體高于400，最高達(dá)512，且離散度低（小于10%），顯著優(yōu)于同時(shí)對(duì)比的兩個(gè)競(jìng)品。2）初乳中SIgA抗體：采集產(chǎn)仔當(dāng)天的乳汁（初乳），用IDEXX試劑盒檢測(cè)其中的SIgA抗體，從檢測(cè)結(jié)果（見圖2）可以看出，止瀉威誘導(dǎo)了高水平SIgA抗體，顯著高于兩個(gè)競(jìng)品。3）初乳中和抗體：通過(guò)檢測(cè)初乳中和抗體（見圖3）發(fā)現(xiàn)，止瀉威免疫后誘導(dǎo)的中和抗體平均值達(dá)400以上，最高可達(dá)512，顯著高于兩個(gè)競(jìng)品。2.2哺乳仔豬被動(dòng)保護(hù)在仔豬哺乳5～7d，采用野毒MJ株對(duì)其進(jìn)行攻擊，每頭仔豬口服105

TCID50。在攻毒后24～48h，對(duì)照組、競(jìng)品1組、競(jìng)品2組仔豬均出現(xiàn)不同程度嘔吐、腹瀉，止瀉威組在攻毒后3～5d僅個(gè)別仔豬出現(xiàn)輕微腹瀉，各組仔豬腹瀉率、存活率及存活弱仔率見表2。綜合腹瀉發(fā)病率、存活率及存活弱仔率，止瀉威的保護(hù)效果顯著高于兩個(gè)競(jìng)品。3討論與結(jié)論目前市售的疫苗主要有豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗及豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗兩類疫苗，近幾年為PED的防控做出了巨大的貢獻(xiàn)。但是活疫苗免疫后能不同程度地排毒，排毒時(shí)間不一，增加豬場(chǎng)環(huán)境中的病毒載量，且活疫苗免疫后，豬只帶毒時(shí)間長(zhǎng)，雖然在配懷舍，不排毒，但進(jìn)入產(chǎn)房后可能迅速排毒，導(dǎo)致初生仔豬感染發(fā)病。采用傳統(tǒng)工藝制備的病毒性腹瀉滅活疫苗，抗原含量有限（108.0~9.0

TCID50/mL），且常用的滅活劑能一定程度地破壞抗原表位，導(dǎo)致免疫原性降低（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此，病毒性腹瀉滅活疫苗的免疫效力仍有提升的空間。本研究小組通過(guò)工藝改進(jìn)有效提高了PEDV有效抗原含量，達(dá)200μg/mL，且篩選到能完整保留病毒結(jié)構(gòu)的滅活劑，以此制備的疫苗經(jīng)本研究評(píng)估驗(yàn)證，無(wú)論從二免疫