內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

（凝膠法）

蘇州大學(xué)衛(wèi)生與環(huán)境技術(shù)研究所

5/8/20241內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法內(nèi)容基本概念實(shí)驗(yàn)方法操作注意事項(xiàng)5/8/20242內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物,它主要化學(xué)成分是脂多糖。細(xì)菌在生活狀態(tài)下不會釋放出來，只有當(dāng)細(xì)菌死亡后才會表現(xiàn)出毒性。5/8/20243內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法一、概念及相關(guān)知識熱原反應(yīng)：病人在靜脈給藥15分鐘后發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。熱原：任何可以導(dǎo)致肌體發(fā)熱的物質(zhì)。機(jī)理：外源性熱原質(zhì)通過內(nèi)源性熱原質(zhì)起作用。外源性熱原質(zhì)吞噬性白細(xì)胞內(nèi)源性熱原質(zhì)體溫調(diào)節(jié)中心發(fā)熱新蛋白合成新mRNA翻譯5/8/20244內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法1942年，美國藥典首次收載熱原檢查法，中國藥典自第一版（1953年版）起收載。所有注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經(jīng)過熱原檢查。熱原檢查法的局限性：1、重現(xiàn)性差。2、對藥物引起的增加、抑制作用無法控制。3、不同細(xì)菌產(chǎn)生的熱原質(zhì)的致熱域有差別。4、非定量反應(yīng)。雖然不排除有其他熱原物質(zhì)存在，但細(xì)菌內(nèi)毒素是最主要的熱原物質(zhì)。5/8/20245內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)：肽聚糖脂蛋白革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌外膜磷壁酸脂多糖細(xì)菌內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。當(dāng)細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)完整時(shí)不具備生物活性，只有當(dāng)細(xì)菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內(nèi)毒素活性。脂多糖結(jié)構(gòu)：多糖O抗原＋核心多糖＋類脂A致熱活性部分5/8/20246內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性

1、致熱性。2、致死性毒性。3、白細(xì)胞減少。4、激活凝血系統(tǒng)。5、降低血壓，休克。6、Shwartzman反應(yīng)。7、刺激淋巴細(xì)胞有絲分裂，等等。5/8/20247內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法細(xì)菌內(nèi)毒素的耐熱性細(xì)菌內(nèi)毒素具很強(qiáng)的耐熱性，一般的高壓滅菌不能去除細(xì)菌內(nèi)毒素，需250℃至少30分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活。

5/8/20248內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法實(shí)驗(yàn)用器具的處理

內(nèi)毒素試驗(yàn)中使用的器皿都要經(jīng)過處理去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐高溫的玻璃器皿等置于電熱干烤箱內(nèi)180℃干烤至少2h或者250℃干烤至少30分鐘；塑料器皿置于30％雙氧水中浸泡4h，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水充分沖洗，60℃烘干備用。

5/8/20249內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法細(xì)菌內(nèi)毒素的單位內(nèi)毒素的量值：1、內(nèi)毒素單位（EU）1982年FDA將當(dāng)時(shí)美國代號為EC－2的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)定為5EU/ng。1983年內(nèi)毒素單位（EU）被USP正式引用。2、國際單位（IU）WHO先后兩次組織協(xié)作標(biāo)定，建立內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品，其中第二批內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品適用于所有內(nèi)毒素檢查法，且明確1IU＝1EU。5/8/202410內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法濁度法光度法顯色基質(zhì)法重現(xiàn)性好能定量能控制藥物的增強(qiáng)/抑制干擾操作簡便。節(jié)省時(shí)間方法分類方法特點(diǎn)5/8/202411內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法概念本方法是利用鱟試劑檢測由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，由于凝膠法操作簡單快捷、靈敏度高，并且藥典規(guī)定當(dāng)不同試驗(yàn)方法的結(jié)果存在爭議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準(zhǔn)，所以凝膠法被廣泛應(yīng)用。5/8/202412內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。5/8/202413內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法5/8/202414內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法概念

凝膠法是通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。5/8/202415內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)機(jī)理內(nèi)毒素C因子活化的C因子凝膠B因子凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鱟凝血系統(tǒng)－酶聯(lián)反應(yīng)5/8/202416內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法二、細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法實(shí)驗(yàn)程序1、試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計(jì)算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復(fù)核4、供試品干擾試驗(yàn)（新藥或新方法）5、供試品內(nèi)毒素限量檢查5/8/202417內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法中用到的儀器

1.超凈工作臺

5/8/202418內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法中用到的儀器2.恒溫培養(yǎng)箱

孵育樣品浸提液以及培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果。5/8/202419內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法中用到的儀器3.干烤箱

用于實(shí)驗(yàn)用耐高溫器皿的去熱源，溫度范圍要求至少300℃5/8/202420內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法中用到的儀器4.移液器和無熱源的移液尖（或者去熱源的刻度吸管）

5.計(jì)時(shí)器、漩渦混合器、電子天平等5/8/202421內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法中用到的器皿器具分類器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑10×75mm）、試管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭其他酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號筆5/8/202422內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法中用到的試劑

1）鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號2）細(xì)菌內(nèi)毒素工作品3）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的無菌水）

4）75％乙醇5/8/202423內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。

5/8/202424內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ）,將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘,然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。5/8/202425內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

取復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管各加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

5/8/202426內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果觀察

將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，若管內(nèi)形成凝膠，且不從管壁滑脫者為陽性；若不形成凝膠，或形成凝膠但倒轉(zhuǎn)180°后從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。

5/8/202427內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

若最大濃度2.0λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc），計(jì)算方法見中國藥典。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

5/8/202428內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法的試驗(yàn)步驟

下面我們結(jié)合中國藥典2010、GB14233.2醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法以及GB15810一次性無菌注射器來學(xué)習(xí)具體試驗(yàn)方法。

5/8/202429內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法實(shí)驗(yàn)步驟

浸提介質(zhì)（細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）體積計(jì)算公示：V－－浸提介質(zhì)體積，單位為（ml）；L－－產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（該產(chǎn)品允許含有的細(xì)菌內(nèi)毒素的量），單位為EU/件；λ－－鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值，單位為EU/ml。5/8/202430內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理方法：

a）管類和容器類器具用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水浸泡器具內(nèi)腔，在（37±1）℃恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進(jìn)行試驗(yàn)；b）小型配件或?qū)嶓w類樣品置無熱源玻璃器皿內(nèi)，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水振蕩數(shù)次，在（37±1）℃恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進(jìn)行試驗(yàn)。制備的供試液儲存不應(yīng)該超過2h。一般要求供試液的PH值在6.0~8.0之間，如不在該范圍內(nèi)，可用鱟試劑廠家提供的PH緩沖液調(diào)節(jié)浸提液的PH值。5/8/202431內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法實(shí)驗(yàn)步驟5/8/202432內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法結(jié)果觀察

B、C溶液的反應(yīng)管必須要陽性，就是輕輕倒轉(zhuǎn)180度過來，鱟試劑安瓿里的反應(yīng)溶液形成了凝膠體，不滑落。而D溶液，就是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水那2管，必須要陰性，3個(gè)條件都滿足，就說明試驗(yàn)結(jié)果是可信的。最后看A溶液的反應(yīng)情況：陽性就說明原套器具每件大于20EU，判定為不合格；陰性就說明小于20EU,結(jié)果是合格的；1管陽性、1管陰性則要重新復(fù)查，復(fù)試時(shí)，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性則判斷合格；否則判斷為不合格。5/8/202433內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法注意事項(xiàng)1.每批鱟試劑在用于試驗(yàn)前首先要進(jìn)行靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)；2.安瓿開啟前應(yīng)先用砂石劃痕(不管是色點(diǎn)或包環(huán)易折安瓿)，用手半拉半掰將頸部折斷，千萬不能用鑷子敲擊，防止碎玻屑掉入安瓿。3.在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時(shí)，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確，緩緩加入避免氣泡。

4.保溫過程中不可隨時(shí)取出觀察，防止形成的凝膠受到振動后變形而誤判為陰性。

5/8/202434內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法注意事項(xiàng)5.凍干的鱟試劑應(yīng)存放在2-8℃下；避免長時(shí)間放置在高于25℃的溫度條件下。已復(fù)溶的鱟試劑在間歇使用過程中最好放在2-8℃的冰箱里，可存放24小時(shí)，在-20℃以下，可存放四個(gè)星期，鱟試劑只能凍融一次。

5/8/202435內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法三、操作注意事項(xiàng)試驗(yàn)前準(zhǔn)備：1、玻璃器具應(yīng)規(guī)范化，便于除熱原、計(jì)量準(zhǔn)確、清洗操作方便。洗凈去污去內(nèi)毒素去洗滌劑精洗除外源性熱原：250

℃干烤至少1小時(shí)。2、盡量用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后250

℃干烤至少1小時(shí)。3、用于內(nèi)毒素檢測的稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且保證無內(nèi)毒素。5/8/202436內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法實(shí)驗(yàn)環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，保證環(huán)境溫度、濕度及通風(fēng)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)人員：用適宜的洗滌劑洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。實(shí)驗(yàn)過程：1、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)嚴(yán)格按要求低溫保存；工作標(biāo)準(zhǔn)品開封后盡快使用且應(yīng)一次性用完，不再保存。2、溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；進(jìn)一步稀釋時(shí)每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s。5/8/202437內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法5/8/202438內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法振蕩前振蕩后內(nèi)毒素分子在水溶液中的狀態(tài)5/8/202439內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法3、每一步稀釋液所用的移液器不能反復(fù)、交叉使用。4、鱟試劑復(fù)溶時(shí)應(yīng)將檢查用水順著瓶壁加入，避免產(chǎn)生氣泡。5、操作時(shí)間的長短。環(huán)境溫度變化都會影響實(shí)驗(yàn)