基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳

生物技術(shù)專業(yè)核心課程基因工程5/8/20241基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳F基因的化學(xué)合成D分子雜交技術(shù)

A核酸的分離和純化B核酸電泳3.基因工程的主要技術(shù)及原理CPCR技術(shù)EDNA核苷酸序列分析5/8/20242基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳第一節(jié)核酸的分離和純化一、DNA的分離、檢測和純化DNA的來源及用途

染色體DNA:分子巨大，1000Kb-106Kb。是分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的主要材料；也可用于構(gòu)建染色體載體和染色體基因整合平臺。(IsolationandPurificationofnucleicacid)5/8/20243基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳人3x106kb植物2x105~1x108kb果蠅1.28x105kb酵母15,000kb細(xì)菌3300~4200kb天花病毒288kb痘病毒196kb質(zhì)體幾~100以上kb染色體DNA比較5/8/20244基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳細(xì)胞器DNA:主要指線粒體DNA和葉綠體DNA,是真核生物所特有的染色體外遺傳物質(zhì)，分別含有與呼吸作用和光合作用相關(guān)的基因?？捎糜诜蛛x目的基因和構(gòu)建克隆載體。雙子葉植物121（菠菜）-154kb（豌豆）單子葉植物151（玉米）-182kb（浮萍）藻類132（裸藻）-191kb（衣藻）葉綠體DNA比較5/8/20245基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳藻類線狀15kb酵母環(huán)狀19-78kb植物環(huán)狀100-150kb動(dòng)物(扁蟲到人)環(huán)狀15-18kb錐蟲網(wǎng)狀6000kb(幼體)短膜蟲網(wǎng)狀30,000kb(幼體)線粒體DNA比較5/8/20246基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳病毒和噬菌體DNA:主要用于構(gòu)建基因克隆載體，可承載較大片段的外源DNA。質(zhì)粒DNA:為染色體外遺傳物質(zhì)；分子大小1Kb-幾百Kb不等，具有復(fù)制起始位點(diǎn)，可自我復(fù)制。主要用于構(gòu)建基因克隆載體。5/8/20247基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳DNA提取的一般程序供體細(xì)胞培養(yǎng)收集(菌體)細(xì)胞細(xì)胞破碎分離總DNA細(xì)胞器DNA的分離、純化總DNA的抽提、純化分離細(xì)胞器5/8/20248基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳1.化學(xué)法

：細(xì)胞裂解方法酶解:利用酶在溫和的條件下，有選擇性地破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)。溶菌酶、溶壁酶、纖維素酶、果膠酶等。2)增溶：利用表面活性劑的增溶作用破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)。常用的表面活性劑有十二烷基磺酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。5/8/20249基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳2.機(jī)械法：1)壓力剪切法：French壓力機(jī)，酵母細(xì)胞，細(xì)菌2)勻漿法：攪切器(blender)，混合器(mixer)，3)固體研磨法：將待破碎細(xì)胞與玻璃球同時(shí)致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末4)超聲波法：利用頻率高、波長短的超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎，效率更高5/8/202410基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳3.其它方法：1)煮沸法：2)凍融法：3)干燥法：5/8/202411基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳植物總DNA的提取一般地說，總DNA主要是指基因組DNA(genomicDNA),即細(xì)胞核內(nèi)的染色體DNA分子。核DNA分子呈極不對稱的線狀結(jié)構(gòu),一條染色體為一個(gè)DNA分子。高等植物核DNA大約含有109bp，其長度與直徑的比例極不對稱，使其對機(jī)械力十分敏感。很難分離出它的完整分子。分離純化過程中，DNA分子的斷裂是很難避免的。5/8/202412基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳為了盡可能獲得大分子量的DNA，一般采用去污劑溫和處理法，對于細(xì)胞破碎較困難的植物材料，可以輔加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎細(xì)胞。植物總的提取方法從提取原理上主要有以下兩種：對于基因組文庫的構(gòu)建及Southern雜交，應(yīng)盡量使用片段較長的DNA分子。

CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)SDS法(十二烷基磺酸鈉)5/8/202413基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳1.CTAB法原理CTAB高鹽溶液(0.7mol/LNaCl)CTABCTABCTAB核酸蛋白質(zhì)多糖低鹽溶液(0.3mol/LNaCl)CTAB蛋白質(zhì)CTAB多糖上清液沉淀CTAB核酸CTAB核酸CTAB核酸CTAB核酸核酸核酸核酸核酸乙醇或異丙醇溶液核酸上清液沉淀5/8/202414基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，能與核酸形成復(fù)合物；然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶于乙醇。在高鹽溶液（0.7mol/LNaCl）中是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí)從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開；1.CTAB法原理5/8/202415基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳2.SDS法原理其原理是利用高濃度的SDS（十二烷基硫酸鈉在較高溫度（55-650C）條件下裂解細(xì)胞，使染色體離析、蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸；在低溫、高鹽條件下，使蛋白質(zhì)及多糖沉淀(常是加入5mol/L的乙酸鉀冰浴，使乙酸鉀與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物)。離心除去沉淀后。上清液中的DNA進(jìn)行反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)，用乙醇沉淀水相中的DNA。5/8/202416基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳SDS法操作簡單、溫和，也可提取到高分子量的DNA，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多。CTAB法的最大優(yōu)點(diǎn)是能很好地去除糖類雜質(zhì)，對于含糖較高的材料可優(yōu)先使用。3.CTAB與SDS5/8/202417基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳4.基因組總DNA法提取程序1)液氮研磨材料成粉末，置于離心管中再加入適量2×CTAB提取液，充分混勻，65℃水浴1hr；2)4℃，12000r/m，離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管；3)加入等體積的酚/氯仿，充分混勻，靜置5min后于4℃、12000r/min，離心10min；裂解細(xì)胞膜沉淀材料殘?jiān)冃浴⒊恋淼鞍踪|(zhì)5/8/202418基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳5)將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，加入等體積異丙醇（或兩倍體積冷乙醇），混勻，冰浴20-30min，沉淀DNA；6)挑出絮狀DNA沉淀，70%乙醇中洗滌2次；7)無水乙醇洗滌1次；8)風(fēng)干后，加適量TE緩沖液或無菌雙蒸水溶解DNA，-20℃貯存?zhèn)溆谩?)將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，加入等體積氯仿，充分混勻，4℃、12000r/min，離心10min；進(jìn)一步變性、沉淀蛋白質(zhì)，清除殘余苯酚沉淀DNA洗滌、干燥DNA溶解、保存5/8/202419基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳DNA電泳結(jié)果5/8/202420基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取克隆載體分子及裝載于載體中的克隆化基因，大多是以質(zhì)粒的形式保存在大腸桿菌中，因此，許多基因操作都離不開大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取，其步驟主要有3個(gè)：細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)菌的收集和裂解質(zhì)粒DNA的分離和純化5/8/202421基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳堿裂解法提取E.coli質(zhì)粒DNA程序及原理1.將菌落轉(zhuǎn)接入約5ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫振搖，培養(yǎng)過夜(12hr)；2.取1.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管中，4℃，12000r/min離心30sec，倒掉培養(yǎng)液，盡可能清除殘余液(可重復(fù)2-3次)；3.棄培養(yǎng)液，使細(xì)菌盡可能干燥；細(xì)菌的培養(yǎng)菌體的收集5/8/202422基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳4.將細(xì)菌沉淀重懸于200μl冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩；5.加入400μl新配置的溶液II，快速顛倒離心管數(shù)次，混勻后，將離心管置于冰上3-5min；溶液I：

50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；懸浮菌體溶液II：

0.2NNaOH/1%SDS；裂解菌體細(xì)胞充分懸浮，避免結(jié)塊?？刂茣r(shí)間；操作柔和。5/8/202423基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳6.加入300μl冰預(yù)冷的溶液III，后溫和振蕩10秒鐘，混勻后，置于冰上3-5min；溶液III：

3M醋酸鉀/2M醋酸

質(zhì)粒DNA的分離中和NaOH；沉淀蛋白質(zhì)和基因組DNA。7.4℃，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中；8.加入等體積的酚/氯仿，振蕩混勻，4℃，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中；9.加入等體積的氯仿混勻，4℃，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中；進(jìn)一步變性、沉淀蛋白質(zhì)5/8/202424基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳14.風(fēng)干后，溶于20-50μlTE緩沖液或無菌雙蒸水中；15.加入適量無DNA酶的RNase(20μg/ml)，37℃處理30min；16.瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃貯存?zhèn)溆谩３恋?、洗滌DNA也可用等體積異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA；10.加入2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，置于冰上沉淀DNA；11.4℃，12000r/min離心15min；12.小心吸去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使所有液體流出；13.70%乙醇洗滌DNA沉淀；溶解備用消化RNA適度干燥；5/8/202425基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳質(zhì)粒DNA電泳結(jié)果1.共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋(covalentlyclosedcircularDNA,ccc-DNA)超螺旋線狀分子3.開環(huán)螺旋(opencircularDNA,oc-DNA)2.線狀DNA(linearDNA,l-DNA)開環(huán)螺旋5/8/202426基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳二、RNA的分離和純化一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5ugRNA，其中，80-85%為rRNA(28S、18S和5S三種)；其余15-20%為各種低相對分子量RNA，如tRNA、核內(nèi)小分子RNA等，而mRNA只占1-5%。mRNA是單鏈的，極易受到核酸酶的攻擊而導(dǎo)致降解。對RNA的操作要求比DNA更為嚴(yán)格。5/8/202427基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（一）控制潛在的RNA酶活性

2)

解決辦法：1)

RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴(yán)寒(0-65℃均具活性)；抗變性劑。濕熱滅菌：一次性用品，如微量移液吸頭(tip)、微量離心管(eppendorftube)等，先用0.1%的焦磷酸二乙酯(DEPC)處理過的水浸泡過夜后，121℃濕熱滅菌30min;干熱滅菌：耐熱器皿，如玻璃制品、研缽、鑷子等，可在180-200℃高溫干熱滅菌4hr以上；5/8/202428基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳電泳用具：最好專用；用前洗滌劑清洗干凈，再用3%H2O2和0.1%的DEPC水浸泡后，沖洗干凈方可使用。操作者防護(hù)：實(shí)驗(yàn)過程中必須帶手套，并常換手套，

盡量避免外源RNase的污染；內(nèi)源RNase：采用高溫抽提，提取液中添加強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等。5/8/202429基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（二）RNA的抽提和純化

1)

酚-異硫氰酸胍抽提法：異硫氰酸胍(GIT)與b-巰基乙醇共同作用可抑制RNase活性；GIT與十二烷基肌氨酸鈉共同作用可使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA；在酸性條件下，DNA極少發(fā)生解離，而是同蛋白質(zhì)一起沉淀，RNA則保留在上清液中而得到分離；5/8/202430基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳2)

硅膠膜純化法：RNeasy試劑盒由Qiagen公司設(shè)計(jì)，其設(shè)計(jì)思路與DNA純化思路相似；當(dāng)含有目的RNA的細(xì)胞破碎液通過硅膠膜時(shí)，RNA被吸附在硅膠膜上，從而與其它成分分開；在低鹽濃度條件下，RNA被洗脫液洗脫下來；5/8/202431基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（三）mRNA的純化

Northern雜交可以使用總RNA,而構(gòu)建cDNA文庫時(shí)，則必須得到純化的mRNA；親和層析法分離mRNA:利用真核生物mRNA3‘端的poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纖維素吸附，已開發(fā)出許多用于mRNA純化的層析柱。5/8/202432基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳RNA電泳結(jié)果28SrRNA18SrRNA5/8/202433基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳三、核酸的評價(jià)1.核酸純度評價(jià)：DNA樣品：OD260/OD280=1.8較純；OD260/OD280>1.8可能有RNA污染；OD260/OD280<1.8有蛋白質(zhì)污染；RNA樣品：OD260/OD280=2.0較純；OD260/OD280>2.0可能有異硫氰酸殘存；

OD260/OD280<1.7有蛋白質(zhì)或酚污染

5/8/202434基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳2.核酸濃度估算：當(dāng)OD260＝1時(shí)，

[SSDNA]=37μg/ml[dSDNA]=50μg/ml[SSRNA]=40μg/ml寡核苷酸濃度約為30μg/ml5/8/202435基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳(NucleicAcidGelElectrophoresis)第二節(jié)核酸的凝膠電泳5/8/202436基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳優(yōu)點(diǎn)：（1）便于分離；（2）便于檢測；（3）便于回收。

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；

電泳：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。5/8/202437基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳一、核酸凝膠電泳的基本原理核酸分子骨架中的磷酸基團(tuán)，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場強(qiáng)度的電場中，它們會向正電極方向遷移；因此，可在同一凝膠中、一定電場強(qiáng)度下、在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構(gòu)型有差異的核酸分子。電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大小、介質(zhì)粘度等的函數(shù)；5/8/202438基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳一、瓊脂糖凝膠電泳

Agarosegelelectrophoresis檢測DNA是否真的存在，是否有降解現(xiàn)象，DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后其產(chǎn)物的大小。目前最成熟的檢測DNA的技術(shù)是瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖從海藻中提取的一種線狀高聚物，在0.7%的瓊脂糖濃度下，對0.8-10kb的DNA有最佳的分離效果。

5/8/202439基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（一）凝膠的制備及電泳瓊脂糖分子式瓊脂糖(Agarose)：是從紅色海藻中提取的一種線狀多糖高聚體。5/8/202440基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳瓊脂糖凝膠制作過程5/8/202441基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳5/8/202442基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳5/8/202443基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳5/8/202444基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（二）DNA的遷移速率決定因素雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比；5001000100005000同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞缺口環(huán)狀。1.DNA分子的大小和構(gòu)象

5/8/202445基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳2.瓊脂糖濃度和種類

濃度越低，相同核酸分子遷移越快；

常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；50005/8/202446基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳

不同類型瓊脂糖的性質(zhì)瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35-3890-95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40-4285-90高強(qiáng)度瓊脂糖34-4385-95修飾的低熔點(diǎn)/凝點(diǎn)瓊脂糖25-3563-653565超低熔點(diǎn)8-1540-45低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖25-3070388530755/8/202447基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃度（%）標(biāo)準(zhǔn)(kb)高強(qiáng)度(kb)低熔點(diǎn)(kb)低黏度低溶點(diǎn)(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.15/8/202448基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳3.凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。5.所用的電壓低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用的電壓成正比；6.電泳緩沖液常用的有TAE、TPE及TBE。5/8/202449基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳緩沖液使用液濃貯存液（每升）tris-乙酸（TAE）1×0.04mol/ltris-乙酸50×242gtris堿

0.001mol/lEDTA57.1ml冰乙酸

100ml0.5mol/lEDTA(ph8.0)tris-磷酸（TPE）1×0.09mol/ltris-磷酸10×10gtris堿

0.002mol/lEDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）

40ml0.5mol/lEDTA(ph8.0)tris-硼酸（TBE）0.5×0.045mol/ltris-硼酸5×54gtris堿

0.001mol/lEDTA5/8/202450基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳TAE、TPE及TBE電泳緩沖液比較1）TAE的緩沖容量最低，如長時(shí)間電泳會被消耗，此時(shí)凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%；4）對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。

5/8/202451基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（三）凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：在上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個(gè)作用：增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；可以指示電泳進(jìn)程。5/8/202452基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳6×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)4℃40%(m/V)蔗糖水溶液5/8/202453基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳指示劑:溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在不同濃度凝膠中，遷移速度基本相同。在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。二甲苯腈的水溶液呈蘭色，攜帶的電荷量比溴酚蘭少，遷移的速度比溴酚蘭慢，它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似。5/8/202454基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（四）瓊脂糖凝膠中DNA的檢測通過染色,紫外燈下檢測。主要染料：溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）SYBRGold5/8/202455基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳1.凝膠的EB染色EB的分子式5/8/202456基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳EB的染色原理溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間5/8/202457基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳使用EB染色注意事項(xiàng)（1）EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸

（3）EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml。（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。5/8/202458基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳2凝膠SYBRGold的染色SYBRGold是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強(qiáng)熒光信號。5/8/202459基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（五）凝膠中DNA的成像可以用透射或入射紫外光對EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。5/8/202460基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳GelDoc2000SystemsandAccessories5/8/202461基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（六）凝膠中DNA的回收現(xiàn)一般采用試劑盒回收。存在的主要問題：不能有效的回收大片段DNA不能有效回收少量DNA

5/8/202462基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

polyacrylamidegelelectrophoresis

PAGE5/8/202463基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳在四甲基乙二胺(TEMED)催化過硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長鏈。（一）聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)在雙功能交聯(lián)劑如N，N′-亞甲雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。5/8/202464基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳CH2=CH-C(O)-NH2

(丙烯酰胺）

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

（N，N`-亞甲雙丙烯酰胺）

5/8/202465基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳種類

1.變性聚丙烯酰胺凝膠用于單鏈DNA片段的分離或純化、DNA測序反應(yīng)等。變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)，只與分子大小有關(guān)。5/8/202466基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳

2.非變性聚丙烯酰胺凝膠遷移率受其堿基組成和序列的影響。用于雙鏈DNA片段的分離和純化、制備高純度的DNA片段。5/8/202467基因工程的主要技術(shù)與原理核酸分離電泳（三）DNA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍（bp）二甲苯氰FF溴酚藍(lán)3.51000~20004601005.0100~500260658.060~400160