病毒病實(shí)驗(yàn)室診斷-病毒的增殖與人工培養(yǎng)（動(dòng)物微生物課件）

動(dòng)物接種培養(yǎng)的應(yīng)用：尚無(wú)敏感細(xì)胞的病毒培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果易觀察，可建立動(dòng)物模型。缺點(diǎn)：有飼養(yǎng)條件要求，費(fèi)用高，動(dòng)物體內(nèi)常帶有潛伏病毒。動(dòng)物接種培養(yǎng)動(dòng)物的物種進(jìn)化程度在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)應(yīng)該是優(yōu)先考慮的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”原則“敬畏自然，尊重生命”選擇何種微生物等級(jí)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，也應(yīng)根據(jù)各級(jí)動(dòng)物的特點(diǎn)，結(jié)合課題研究的水平、內(nèi)容及目的而定。接種病毒后觀察應(yīng)每日至少2次，根據(jù)試驗(yàn)的目的不同，觀察不同的反應(yīng)情況。例如在進(jìn)行新城疫診斷時(shí)需進(jìn)行ICPI、IVPI。普通動(dòng)物無(wú)特定病原體動(dòng)物悉生動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物雞胚培養(yǎng)采用孵化9～12日齡的雞胚優(yōu)點(diǎn)：易管理，操作簡(jiǎn)單，成本較低。缺點(diǎn)：可能垂直傳播，存在卵黃抗體干擾。

絨毛尿囊膜：痘苗病毒、人類皰疹病毒尿囊腔：流感病毒、腮腺炎病毒接種部位羊膜腔：流感病毒的初次分離

卵黃囊：嗜神經(jīng)病毒

不同病毒對(duì)雞胚敏感性不同。直接法：生長(zhǎng)發(fā)育情況，痘疹、痘斑，MDT。間接法：尿囊液、羊水進(jìn)行HA/HI。1．氣室2．卵殼3．卵黃囊4．卵白5．尿囊腔6．絨毛尿囊7．胚胎8．羊水腔9．胚外體液膜用的雞胚細(xì)胞培養(yǎng)

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

原代細(xì)胞

細(xì)胞種類二倍體細(xì)胞

傳代細(xì)胞系

培養(yǎng)方式優(yōu)點(diǎn)1是離體組織細(xì)胞不受機(jī)體免疫力影響，易于生長(zhǎng)。

2便于人工選擇多種敏感細(xì)胞供病毒生長(zhǎng)。3易于觀察病毒的生長(zhǎng)特征。4便于收集病毒作進(jìn)一步檢查。缺點(diǎn)成本和技術(shù)水平要求較高、操作復(fù)雜。離體的新鮮組織或器官，機(jī)械處理胰蛋白酶消化加入營(yíng)養(yǎng)液

單個(gè)細(xì)胞懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度分裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)成單層細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞。將長(zhǎng)成單層原代細(xì)胞胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶

形成單層細(xì)胞稱次代培養(yǎng)。二倍體細(xì)胞：原代細(xì)胞多次連續(xù)傳代后仍保持二倍體染色體特性（含23對(duì)染色體），稱之為二倍體細(xì)胞。傳代細(xì)胞壽命一般為40~50代，其廣泛用于病毒的分離和疫苗的制備。傳代細(xì)胞系：來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過(guò)程的變異細(xì)胞。細(xì)胞增殖特征和染色體均類似于腫瘤細(xì)胞。不宜用于疫苗的制備，常用于病毒的分離和鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)瓶單層細(xì)胞

病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖所引起的特有的細(xì)胞病變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等（多數(shù)病毒）LOREM在培養(yǎng)細(xì)胞中形成包涵體（狂犬病毒等）ABC形成多核巨細(xì)胞/融合細(xì)胞（麻疹病毒等）一般程序：標(biāo)本無(wú)菌處理動(dòng)物接種雞胚培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)指標(biāo)陽(yáng)性指標(biāo)陰性

病毒鑒定

盲傳2～3代指標(biāo)陰性病毒陰性活細(xì)胞---嚴(yán)格寄生性（缺乏增殖所需的酶系統(tǒng)）敏感細(xì)胞---選擇性（親嗜性）復(fù)制：即自我復(fù)制本身的成分，然后裝配成病毒粒子。有囊膜病毒的復(fù)制穿入吸附脫殼釋放裝配、成熟生物合成病毒復(fù)制的基本過(guò)程吸附穿入脫殼生物合成裝配與釋放吸附穿入有囊膜病毒的穿入

囊膜與細(xì)胞膜融合

吞飲作用

無(wú)囊膜病毒的穿入

直接穿入

吞飲作用

囊膜與細(xì)胞膜融合囊膜與細(xì)胞膜融合吞飲作用脫殼

多數(shù)病毒的脫殼與穿入同時(shí)進(jìn)行的。不同病毒的脫殼又各有特色，例如：新城疫病毒經(jīng)溶酶體酶的作用脫殼。痘病毒的脫殼分為兩個(gè)階段進(jìn)行。呼腸孤病毒只脫去外層衣殼，內(nèi)層衣殼不脫去，形成亞病毒顆粒。小RNA病毒在吸附的同時(shí)，就發(fā)生衣殼蛋白消失，即吸附的同時(shí)就發(fā)生了脫殼。生物合成

生物合成即病毒遺傳信息的控制下合成病毒的各種組成成分。早期:病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成生物合成

有囊膜病毒的生物