酶活力測(cè)定課件

第十一章、酶活力測(cè)定

11/1/20221第一節(jié)、α-淀粉酶活力測(cè)定

1、作用2、分類3、測(cè)定方法11/1/20222一、分光光度法

１.原理α-淀粉酶廣泛存在于植物、哺乳類動(dòng)物和微生物中。能將淀粉分子鏈中的α-１,４葡萄糖甘鍵隨機(jī)切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對(duì)碘呈籃紫色的特異性反應(yīng)迅速逐漸變紅棕色直至消失，其顏色消失的速度與酶活力有關(guān)，故可通過(guò)測(cè)定反應(yīng)后吸光度計(jì)算其酶活力．11/1/20223３.測(cè)定步驟待測(cè)酶液的制備：稱取酶粉1.000g（或吸取液體酶1.00ml），先用少量的pH6.0緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，將上清液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此反復(fù)搗研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度（將酶液稀釋至被測(cè)試液吸光度在0.12-0.36范圍內(nèi)），搖勻。同過(guò)四層紗布過(guò)濾，濾液為待測(cè)酶液。11/1/20225酶活力測(cè)定：吸取可溶性淀粉溶液20ml與試管中，加入pH6.0緩沖液5ml，搖勻后于60℃恒溫水浴中預(yù)熱10min。加入稀釋好的待測(cè)酶液1ml。立刻計(jì)時(shí)，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min。立刻吸取反映液1ml于稀碘液作空白波長(zhǎng)660nm，1cm比色皿，迅速測(cè)定吸光度（A）根據(jù)吸光度查表，求得測(cè)定酶液的濃度（c）。11/1/20226

４.計(jì)算酶活單位定義：在60℃，pH6.0條件下，1h液化1g可溶性淀粉的酶量為1個(gè)酶活力單位。α-淀粉酶活力（u/g或u/mL）=c×n式中c----測(cè)試酶液的濃度（u/ml）；n----樣品的稀釋倍數(shù)。以結(jié)果表示至整數(shù)。11/1/20227二、目視比色法

１.原理α-淀粉酶水解淀粉為小相對(duì)分子質(zhì)量的糊精和少量的麥牙糖及葡萄糖，使淀粉與碘呈藍(lán)紫色反映逐漸變紅棕色直至消失，觀察并測(cè)定顏色的消失速度可以衡量酶活力的大小。11/1/20228３.測(cè)定步驟：待測(cè)酶液的制備：同“分光光度法”測(cè)定：取2ml標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色溶液于白瓷板孔穴內(nèi)，作為比較顏色的標(biāo)準(zhǔn)，其余孔穴各加1.5ml稀碘液。吸取可溶性淀粉溶液和5mLpH6.0緩沖液于試管中。在60℃恒溫水浴中預(yù)熱10min。然后準(zhǔn)備加入0.5mL稀釋酶液，立即記時(shí)。充分搖勻。定時(shí)用滴管取出約0.5mL反應(yīng)液，滴入盛有稀碘液的白瓷板空穴內(nèi)，當(dāng)孔穴內(nèi)顏色由藍(lán)紫色逐漸變?yōu)榕c標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色（紅棕色）相同時(shí)即為反應(yīng)終點(diǎn)，記錄反應(yīng)時(shí)間t（min）。11/1/202210５.討論（1）商品α-淀粉酶粉劑活力為1500～2500u/g，稀釋倍數(shù)一般為100～200倍。（2）可溶性淀粉的質(zhì)量對(duì)α-淀粉酶活力有一定影響，為統(tǒng)一起見，可溶性淀粉采用浙江菱湖淀粉廠產(chǎn)的酶制劑專用可溶性淀粉。。

11/1/202212２.試劑（1）pH4.60.1mol/LHAc緩沖液；（2）0.05mol/LNa2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱取13gNa2S2O3·5H2O和0.2gNa2CO2，用新鮮煮沸過(guò)的冷水溶液并稀釋至1000mL配制一周后以碘酸鉀（或重鉻酸鉀）標(biāo)定。（3）0.1mol/L碘溶液，棕色瓶保存。（4）1mol/L硫酸溶液。（5）0.1mol/LNaOH溶液。（6）20g/L可溶性淀粉溶液。（7）200g/LNaOH溶液。（8）10g/L淀粉指示劑。11/1/202214二、物理化學(xué)分析法３.測(cè)定步驟待測(cè)酶液的配制，稱取酶粉，準(zhǔn)確至0.0002g（或吸取液體酶1.00mL），先用少量的乙酸緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，將上清夜小心傾入適當(dāng)?shù)娜萘科恐?。沉渣部分再加入少量緩沖液，如此搗研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度，搖勻。通過(guò)四層紗布過(guò)濾，濾液供測(cè)定用。11/1/202215酶活力測(cè)定：于甲、乙兩支比色管中，分別加入可溶性淀粉溶液25ml和PH4.6乙酸緩沖液5ml，搖勻后至40℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。在甲管（樣品）中加入待測(cè)酶液2ml，立刻搖勻，在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min,立刻各加NaOH溶液0.2ml，搖勻。將兩管取出迅速冷卻，并于乙管（空白）中補(bǔ)加待測(cè)酶液2ml。吸取上述反應(yīng)液各5ml，分別置于碘量瓶中，準(zhǔn)確加入碘溶液10ml，再加0.1mol/LNaOH溶液15ml，搖勻，密塞，于暗處反應(yīng)15min。取出，加1mol/L硫酸溶液2ml，立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至藍(lán)色剛好消失為其終點(diǎn)。不同稀釋倍數(shù)，應(yīng)做相應(yīng)的空白試驗(yàn)。11/1/202216４.計(jì)算酶活單位定義：在上述條件（40℃、PH4.6）下，1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。糖化酶活力（u/g或u/ml)=(V1-V2)×c×90.05×32.2/5)×(1/2)×n×211/1/202217式中V1—空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；V2—樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；C—Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）；90.05—與1.00mL1mol/LNa2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)囊詆表示的葡萄糖的質(zhì)量；32.2—反應(yīng)液的總體積（ml）；

11/1/202218第三節(jié)蛋白酶活力測(cè)定

１.原理蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解底物酪蛋白，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。在堿性條件下，F(xiàn)olin-酚試劑極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，在一定范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與酪氨酸的濃度成正比。這樣，可以利用測(cè)定蛋白酶在單位時(shí)間內(nèi)催化酪蛋白產(chǎn)生的酪氨酸的量求得蛋白酶的活力。11/1/202220２.試劑Folin-酚試劑見“蛋白質(zhì)含量測(cè)定”。0.4mol/L碳酸鈉溶液。0.4mol/L三氯乙酸溶液。緩沖溶液①PH7.5磷酸緩沖液，適用于中性蛋白酶。②pH3.0乳酸緩沖液，適用于酸性蛋白酶。③pH10.5硼酸緩沖溶液，適用于堿性蛋白酶。上述各種緩沖溶液，均須用pH計(jì)校正。

11/1/202221３.測(cè)定步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取9支干燥試管，分別加入酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1，2，3，4，5，6，7，8mL,補(bǔ)水至10mL,混勻后，從中分別取溶液1mL,各加0.4mol/L碳酸鈉溶液5mL、（1+2）Folin-酚試劑使用溶液1mL,置于40℃水浴中顯色20min，取出，于680nm波長(zhǎng)，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0號(hào)管為空白，分別測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。11/1/202223（2）待測(cè)酶液的制備稱取酶粉1-2g，準(zhǔn)確至0.0002g（或吸取液體酶1ml），用少量該酶的緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，然后將上清夜小心傾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述緩沖爺，如此溶解、搗研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容刻度，搖勻。用四層紗布過(guò)濾，濾液根據(jù)酶活力再一次用緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，供測(cè)試用（稀釋至被測(cè)試液吸光度在0.25-0.40范圍內(nèi)）。11/1/202224試管A（空白）試管B（酶樣試劑，需作加酶液1ml加酶液1ml40℃，2min40℃，2min加三氯乙酸2mL（搖勻）加酪蛋白1mL（搖勻）40℃，10min40℃，10min加酪蛋白1mL（搖勻）三氯乙酸2mL（搖勻）取出靜置10min,過(guò)濾；取1mL濾液；加碳酸鈉溶液5mL；加Folin-酚試劑使用液1mL；40℃，顯色20min；于680nm波長(zhǎng)，比色皿測(cè)其吸光度11/1/202226４.計(jì)算酶活力單位定義：在上述條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1ug酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位蛋白酶活力（u/g或u/mL）=A×K×4/10×n式中A—樣品平行實(shí)驗(yàn)的平均吸廣度；K—吸光常數(shù)；4—反應(yīng)液的總體積（mL）；10—反應(yīng)時(shí)間10min，以1min計(jì)；n—稀釋倍數(shù)。11/1/202227５.討論（1）酪蛋白配制應(yīng)嚴(yán)格按操作方法，否則影響測(cè)定結(jié)果。（2）若測(cè)定固體曲霉時(shí)，一般稀釋200～500倍；酶液則要稀釋500倍為宜。11/1/202228２.試劑（1）底物溶液的制備①稱取聚乙烯醇②量取40g/LPVA溶液150mL，加橄欖油50mL用高速組織，搗碎機(jī)攪動(dòng)6min（分2次攪動(dòng)，每次3min，中間休息5min），即成乳白色PVA乳化液。該溶液宜現(xiàn)用現(xiàn)配。如貯存在冰箱中，有效期為1周。（2）pH7.5、0.025mol/L磷酸緩沖液11/1/202230（3）0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。（4）5g/L酚酞

11/1/202231３.測(cè)定步驟（1）待測(cè)酶液的制備：根據(jù)估測(cè)酶粉活力再進(jìn)行稀釋，一般是酶活力4000、5000、6000u/g，稀釋倍數(shù)分別為600、750、900倍。酶液容度應(yīng)控制在樣品與對(duì)照消耗堿量之差在2～5mL范圍內(nèi)。11/1/202232（2）酶活力的測(cè)定取兩個(gè)100mL燒杯，于第一個(gè)空白杯和第二個(gè)樣品杯中各加底物溶液4mL和0.025mol/LpH7.5磷酸緩沖液5mL，再于空白杯中加入95%乙醇15ml，于40℃水浴中預(yù)熱5min，然后于兩杯中，各加待測(cè)酶液1ml，立即混勻計(jì)時(shí)，在40℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，于樣品中立即補(bǔ)加95%乙醇15ml終止反應(yīng)，取出。在燒杯中放一枚轉(zhuǎn)子，置于電磁攪拌器上，在攪拌下，用0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至PH10.3，為起終點(diǎn)，記錄消耗0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。11/1/202233②指示劑滴定法：取兩個(gè)100ml三角瓶，分別于空白瓶和樣品瓶中各加底物溶液4ml和磷酸緩沖液5ml，再于空白瓶加入95%乙醇15ml，于40℃水浴預(yù)熱5min。然后，在兩瓶中各加待測(cè)酶液1ml，立即混勻計(jì)時(shí)，在40℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，在樣品瓶中立即補(bǔ)加95%乙醇15ml終止反應(yīng)，取出于空白瓶和樣品瓶中各加酚酞指示液2滴，用0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。用0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,直至微紅并保持30s不退為其終點(diǎn),記錄消耗0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積.11/1/202234４.計(jì)算酶活力定義：在上述條件（40℃，pH7.5）下，1min催化脂肪水解產(chǎn)生1umol脂肪酸的酶量為一個(gè)酶活力單位。脂肪酶活力（u/g或u/mL）=（V1-V2）×c×1/0.05×50×1/15×n×（V1-V2）×c×n×200/311/1/202235５.討論用不同聚合度的聚乙烯醇測(cè)出的數(shù)據(jù)不同，故應(yīng)使用同一聚合度的聚乙烯醇才能進(jìn)行比較。貯放的乳化液若上層有油析出，應(yīng)重新攪動(dòng)呈乳化狀才能使用，否則不容易被脂肪酶水解。

11/1/202236第五節(jié)葡萄糖異構(gòu)酶活力測(cè)定１.原理葡萄糖異構(gòu)酶正確的名稱是木糖異構(gòu)酶，能將D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等糖可逆轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮糖。異構(gòu)酶的活力尚無(wú)一種統(tǒng)一的測(cè)定方法，通常是以葡萄糖為底物，在一定條件下使之異構(gòu)化，然后測(cè)定生成的果糖?；蛘咭怨菫榈孜铮?jīng)異構(gòu)化反應(yīng)后測(cè)定所生成的葡萄糖。果糖含量可用咔唑法測(cè)定。11/1/202237３.測(cè)定步驟⑴待測(cè)酶液的制備取2.35g濕重的乳酸桿菌細(xì)胞，加入8g氧化鋁和30mLpH7.0的Tris緩沖液于組織搗碎機(jī)上搗碎，定容，離心或過(guò)濾后上清夜為粗酶提取液。⑵酶活力測(cè)定①向小試管中加入pH7.0緩沖液1.3mLLMnSO4溶液0.3mL、CoSO4溶液0.3mL和2mol/L葡萄糖溶液1mL，加入酶提取液0.1mL，反應(yīng)系統(tǒng)中體積為3.0mL，50℃反應(yīng)30min后，0.2ml100g/L三氯醋酸終止反應(yīng)，用咔唑法測(cè)定生成的果糖。另取煮沸滅活酶提取液0.1mL同上操作為空白對(duì)照。11/1/202238②將酶促反應(yīng)液稀釋400倍后吸取1mL（果糖含量在100ug以下）放入試管，于冰浴中冷卻，加入硫酸溶液6mL,激烈振蕩搖勻后，加入半胱氨酸0.2mL，再搖勻后立即加入咔唑乙醇溶液0.2mL，置于40℃水浴中顯色30min,取出后入冰浴中平衡20min，立即在560nm波長(zhǎng)，試劑空白，測(cè)定吸光度Ap。另取空白對(duì)照液和標(biāo)準(zhǔn)果糖各1mL，按以上操作測(cè)其吸光度AB（空白對(duì)照）及As（標(biāo)準(zhǔn)果糖溶液）。11/1/202239第六節(jié)纖維素酶活力測(cè)定１.原理纖維素酶是一種多組分的酶，包括C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶。其中C1酶的作用是將天然纖維素水解成無(wú)定形纖維素；Cx酶的作用是將無(wú)定形纖維素繼續(xù)水解成纖維寡糖；而β-葡萄糖苷酶的作用是將纖維寡糖水解成葡萄糖。纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將3，5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的氨基化合物，用比色法測(cè)定。通常，測(cè)定濾紙酶活力可反映纖維素酶的活力。11/1/202240⑶酶活力測(cè)定①濾紙酶活力的測(cè)定：取4支20mL具塞刻度試管，各加入pH4.5的檸檬酸緩沖液，1號(hào)試管作為空白對(duì)照。2、3、4號(hào)試管中加入0.5mL酶液。各管同時(shí)在50℃水浴中預(yù)熱5min，然后加入50mg濾紙條（新華定量濾紙，1cm×6cm），準(zhǔn)確保溫1h，取出后立即加入1.5mLDNS試劑（動(dòng)作要迅速）以終止酶反應(yīng)，并向1號(hào)管中補(bǔ)加0.5mL酶液。將各管充分搖勻后在沸水浴中加熱5min，取出冷卻后用水定容至20mL。以1號(hào)試管溶液液為空白，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度11/1/202241②C1酶活力的測(cè)定：取4支20mL具塞刻度試管，各加入10mL脫脂棉，加入1.5mLpH5.0、0.05mol/L的檸檬酸緩沖液，1號(hào)試管作為空白對(duì)照。將各管同時(shí)在45℃下預(yù)熱5min，向2、3、4號(hào)試管中加入0.5mL酶液混勻，在45℃下保溫24h。保溫結(jié)束后立即向各管中加入1.5mLDNS試劑以終止酶反應(yīng)，并向1號(hào)管中補(bǔ)加0.5mL酶液。各管充分搖勻后置沸水浴中加入5min，取出冷卻后用水定容至20mL，以1號(hào)試管溶液為空白，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。計(jì)算上述3個(gè)吸光度的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量。

11/1/202242③Cx酶活力的測(cè)定：將酶液稀釋5倍測(cè)定Cx酶活力，以CMC-Na為底物。取4支20mL具塞刻度試管，各加入pH5.0的檸檬酸緩沖液（內(nèi)含0.5%CMC-Na），1號(hào)試管作為空白對(duì)照。將各