上海生科院實驗生物學酶工程2012-11-29

上海生科院實驗生物學酶工程2012-11-29酶工程定義將酶所具有的生物催化功能,借助工程手段應用于社會生活的一門科學技術；利用酶催化的作用,在一定的生物反應器中,將相應的原料轉化為所需要的產(chǎn)品；利用酶、細胞器或細胞的特異催化功能，通過適當?shù)姆磻鞴I(yè)化生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品或達到某種特殊目的的一門技術科學。(大唐搜索)“工程”的定義(Webster)“酶工程”的定義運用酶學知識結合數(shù)學和/或其他系統(tǒng)性知識設計有實用價值的新酶(生物催化劑，固定化生物催化劑，生物催化反應體系,生物催化反應器。。。)超越常規(guī)實踐技巧運用數(shù)學或系統(tǒng)性知識設計有實用價值的復雜體系教學目標在具備生物化學/酶學/微生物學等基本知識的前提下了解蛋白質重組表達和改造的基本概念，方法在文獻調研基礎上能獨立設計蛋白質重組表達和改造的實驗技術路線。課程基礎張惠展 重組DNA技術與基因工程

鐘揚 基因組學與生物信息學丁建平 蛋白質結構技術生物化學(氨基酸，酶學)蛋白質化學(蛋白質純化，蛋白質結構)微生物學參考資料ColinRatledge《BasicBiotechnology》2001MartinChaplin《EnzymeTechnology》1990http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.htmlAndreasS.Bommarius《Biocatalysis》2004內容安排

(約45分鐘休息10分鐘)復習與簡介復習酶的基本概念酶工程發(fā)展概況基礎學習酶的生產(chǎn)方法重組表達酶的分離提取酶的固定化技術酶反應器提高酶的改造提問？酶學知識復習王鏡巖《生物化學》第3版第8章酶通論酶是什么？有催化活力的蛋白質蛋白質一般不穩(wěn)定,反應條件溫和催化能力高效性,專一性化學選擇性，區(qū)域選擇性，立體選擇性TheMechanismofEnzymeCatalysis酶與過渡態(tài)中間物的緊密結合，穩(wěn)定了底物的過渡態(tài)結構，從而降低了底物形成其過渡態(tài)所需克服的能壘，提高了反應的速度酶學相關定義U酶活力單位

1分鐘內轉化1umol底物所需酶量Vmax最大反應速度酶分子所有的活性部位都被底物占據(jù)時的反應速度Km米氏常數(shù)反應速度達到Vmax一半時的底物濃度Kcat酶轉換數(shù)

以每分鐘每酶分子形成的產(chǎn)物的分子數(shù)表示的Vmax米氏方程HowAnEnzyme'sECNumberIsAssigned

FirstE.C.NumberSecondE.C.NumberMeans:ThirdE.C.NumberMeans:1:OxidoreductasesIndicatestheH+ore-donorthatundergoesoxidationIndicatestheacceptor2:TransferasesIndicatesthegrouptransferredFurtherinformationonthegrouptransferred3:HydrolasesIndicatesthenatureofthebondhydrolysedIndicatesthenatureofthesubstrate4:LyasesIndicatesthenatureofthebrokenbondFurtherinformationontheeliminatedgroup5:IsomerasesIndicatesthetypeofisomerismIndicatesthetypeofsubstrates6:LigasesIndicatesthetypeofbondformedOnlyusedinC-NligasesInallcases,thefourthECnumberisspecifictoaparticularreaction.酶的命名

EC編號規(guī)則

第一位第二位第三位氧化還原酶

氧化反應的供體是

H+還是

e-受體類型轉移酶發(fā)生轉移的基團種類發(fā)生轉移的基團細分水解酶

水解的化學鍵種類天然底物類型裂合酶斷裂的化學鍵種類脫去的基團種類異構酶同分異構體的種類

底物類型連接酶

形成的化學鍵種類僅限于C-N化學鍵連接E.C.number第四位取決于具體的反應過程國際酶學委員會EnzymeCommission(EC)酶的命名

氧、轉、水、裂、異、合(連)

Oxidoreductases 氧化還原酶Transferases 轉移酶Hydrolases 水解酶Lyases 裂合酶Isomerases 異構酶Ligases 連接酶ATP水解偶聯(lián)國際酶學委員會EnzymeCommission(EC)酶知識復習小結酶是有催化活力的蛋白質酶與過渡態(tài)中間物的緊密結合，穩(wěn)定了底物的過渡態(tài)結構，從而降低了底物形成其過渡態(tài)所需克服的能壘，提高了反應的速度酶分為6大類，酶的命名可以在上查詢基礎篇學習酶的生產(chǎn)方法重組表達系統(tǒng)酶的分離提取酶的固定化技術酶反應器酶工程的歷史酶的歷史在麥芽中發(fā)現(xiàn)淀粉酶 1833在胃中發(fā)現(xiàn)消化酶--胃蛋白酶 1836

1873

從小牛胃提取凝乳酶用于制酪Enzyme定名--意為"在酵母中" 1878鑰匙-鎖理論提出

1894

以米曲霉生產(chǎn)淀粉酶作為消化酶中間產(chǎn)物學說

米氏方程 1913獲得脲酶結晶

酶是蛋白質 1926 1949液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細菌α-淀粉酶固定化酶 1953操縱子學說酶生物合成機制 1960

1969

固定化氨基?；干a(chǎn)L-氨基酸

1973基因工程技術

1978定點突變技術

1984TyrRS的蛋白質工程

1986重組酶生產(chǎn)

1993定向進化

1994DNAshuffling

酶的生產(chǎn)植物來源來源 酶 應用刀豆 脲酶 診斷木瓜 木瓜蛋白酶 烘焙，制酪，制革，

嫩肉粉，啤酒澄清無花果 無花果蛋白酶 嫩肉粉菠蘿 菠蘿蛋白酶 烘焙辣根 辣根過氧化物酶 診斷檸檬 β-糖苷酶 科研小麥 酯酶 酯水解與合成大麥 β-淀粉酶 烘焙，麥芽糖漿大豆 β-淀粉酶 烘焙，麥芽糖漿動物來源的工業(yè)用酶來源酶工業(yè)用途肝過氧化氫酶食品胰腺胰凝乳蛋白酶制革胰腺脂肪酶食品皺胃凝乳酶制酪胰腺胰蛋白酶皮革微生物來源的工業(yè)用酶EnzymeECnumberSourceIntra/extra-cellular

ScaleofproductionIndustrialuseBacterialenzymesa-AmylaseBacillusE+++Starchb-AmylaseBacillusE+StarchAsparaginaseEscherichiacoliI-HealthGlucoseisomeraseBacillusI++FructosesyrupPenicillinamidase1BacillusE-PharmaceuticalProtease4BacillusE+++DetergentPullulanase1KlebsiellaE-StarchFungalenzymesa-AmylaseAspergillusE++BakingAminoacylase4AspergillusI-PharmaceuticalGlucoamylaseAspergillusE+++StarchCatalaseAspergillusI-FoodCellulaseTrichodermaE-WasteDextranase1PenicilliumE-FoodGlucoseoxidaseAspergillusI-FoodLactase3AspergillusE-DairyLipaseRhizopusE-FoodRennetMucormieheiE++CheesePectinase5AspergillusE++DrinksPectinlyase0AspergillusE-DrinksProteaseAspergillusE+BakingRaffinase2MortierellaI-FoodYeastenzymes

Invertase6SaccharomycesI/E

-ConfectioneryLactase3KluyveromycesI/E-DairyLipaseCandidaE-FoodRaffinase2SaccharomycesI-Food微生物酶生產(chǎn)率提高的手段菌種選育 －－誘變育種發(fā)酵工藝優(yōu)化－－發(fā)酵工程重組表達－－基因工程在張惠展教授課程基礎上進一步提高分子生物學知識復習理論中心法則操縱子理論工具PCR限制性內切酶連接酶分子生物學知識復習

中心法則操縱子理論重組蛋白質表達載體必需元件選擇標記啟動子核糖體結合位點轉錄終止信號復制起點

(自主復制質粒必需)編碼(c)DNA重組蛋白質的表達獲取基因選擇表達系統(tǒng)選擇表達載體

基因克隆至表達載體

轉化至表達宿主細胞篩選轉化子

生長表達蛋白質克隆酶基因已知序列從文庫中亞克隆(RT)PCR直接擴增化學合成未知序列聯(lián)配同類酶的已發(fā)表序列，根據(jù)保守氨基酸序列設計簡并引物擴增基因純化酶，測定部分氨基酸序列，設計簡并引物擴增基因以方法1，2設計DNA探針進行southern雜交和/或菌落雜交，篩選文庫建立表達文庫利用能表達酶活性的宿主菌的表型不同進行篩選純化酶，制備抗體，用免疫印跡的方法篩選陽性克隆ModelPCRproductsshowingcombinationsofproteinexpressionmotifsrelativetothecloningsitesusedtoinsertthegeneintoanexpressionvector.PCRproductencodingaproteinwithaC-terminalepitope(forantibodydetectionorpurification)ortag(forpurification).PCRproductencodingaproteinwithanupstreamproteasesite(forremovalofanN-terminaltagderivedfromtheexpressionvector)andaC-terminalepitopeortag.PCRproductencodingaproteinsecretionsignalandaC-terminalepitopeortag.PCRproductencodingaproteinwithoutastopcodon,sothatavarietyofC-terminaltagscanbeaddedbytheexpressionvector.PCRproductencodingaproteinthatrequirestheexpressionvectortosupplyboththetranslationstartandstop(i.e.theproteinwillhaveextraaminoacidsfromtheexpressionvectoratboththeNandCtermini).Kz,Kozak;SD,Shine–Dalgarnosequence.CurrentOpinioninBiotechnology2006,17:359–366Typicalcombinationsofproteinexpressionelementsinexpressionvectors.AllexpressionvectorssupplyapromoterupstreamoftheN-terminalcloningsite,whichmayormaynotbecontrollable.TheN-andC-terminalcloningsitescanbeasinglesite.(a)ProvidesaC-terminalepitopetag.(b)ProvidesanN-terminaltranslationstartandaffinitytag.(c)Avectorsimilarto(b)butwiththepresenceofatoxicgenebetweenthecloningsitesforselectionagainstemptyvectormolecules(i.e.vectorsthatdonotcontainthegeneofinterest).(d)VectorcontainingaC-terminalfluorescentproteintag(e.g.greenfluorescentprotein)formakingfluorescentfusionproteins.drugR,drugresistancegene;ori,originofreplication.CurrentOpinioninBiotechnology2006,17:359–366

重組表達系統(tǒng)E.coli(T7,tac/trc,T5,ara…)BacillusPichiapastoris(aox1,gap)Aspergillusniger……BaculovirusCHO體外翻譯系統(tǒng)蛋白質產(chǎn)量翻譯后修飾加工，

折疊

(二硫鍵)和糖基化蛋白質純化經(jīng)濟性可用設備表達系統(tǒng)選擇考慮因素:首選重組蛋白質表達系統(tǒng)－－大腸桿菌生長最快

實驗操作最方便可高密度發(fā)酵遺傳背景清楚

容易獲得各種載體和宿主FactorsinfluencingrecombinantproteinproductioninE.coliMergulhaoetalJournalMicrobiolBiotechnology2004

E.coli表達系統(tǒng)可用啟動子列表常用大腸桿菌表達系統(tǒng)trc啟動子pTrcHIS(Invitrogen)pKK223,pTrc99(Pharmacia)T7啟動子pET(Novagen)pRSET,pCRT7(Invitrogen)araBAD啟動子pBAD(Invitrogen)T5啟動子pQE系列(Qiagen)首選中的首選--pET系統(tǒng)T7表達系統(tǒng)工作原理pET表達流程pETVectorCharacteristicsTable以pET24開始

利用增溶標簽

進行蛋白質

重組表達和純化MBP作為增溶標簽的優(yōu)越性KataevaI,ChangJ,XuH,LuanCH,ZhouJ,UverskyVN,LinD,HoranyiP,LiuZJ,LjungdahlLGetal.:ImprovingsolubilityofShewanellaoneidensisMR-1andClostridiumthermocellumJW-20proteinsexpressedintoEscherichiacoli.JProteomeRes2005,4:1942-1951. Resultsfromahigh-throughputstructuralgenomicsprojectcomparingMBP,GST,NusAandHis6solubilitytags.Thestudyof152proteinsfrommesophilicandthermophilicbacteriasuggestedthatMBPwasthebesttagformakingsolublefusions,andalsoshowedthepositiveeffectofloweredexpressiontemperatureonsolubility.Theauthorsdiscussalgorithmsforpredictingthesolubilityofproteins.DysonMR,ShadboltSP,VincentKJ,PereraRL,McCaffertyJ:ProductionofsolublemammalianproteinsinEscherichiacoli:identificationofproteinfeaturesthatcorrelatewithsuccessfulexpression.BMCBiotechnol2004,4:32. Theauthorschose30diversehumangenesandcomparedexpressionwithsixdifferentN-terminalandeightdifferentC-terminalsolubilityfusions.ResultsshowedthatMBPandTrxwerethebesttagsandthatMBPalsoworkedasaC-terminalfusion,contrarytopreviousresults.Theauthorsnicelyhighlighttheproteinfeaturesthatseemtocorrelatewithsolubility:molecularweight,numberofhydrophobicresidues,andlowcomplexityregions.BussoD,Delagoutte-BussoB,MorasD:Constructionofasetgateway-baseddestinationvectorsforhigh-throughputcloningandexpressionscreeninginEscherichiacoli.AnalBiochem2005,343:313-321. Thisarticledescribestheconstructionof10recombinationalcloningvectorsandtheiruseforcomparingexpressionandsolubilityofasmallnumberofgenesfromBacillussubtilis.MethodsforgeneratingandtestingnewvectorsareclearlydiscussedandtheresultsofthesolubilityanalysissuggestthatMBPandNusAaremuchbetterthanGSTorTrxinthecaseofthesepartnerproteins.大腸桿菌表達實驗策略首選pET系統(tǒng),如pET24/BL21(DE3)1mMIPTG誘導無表達?

融合表達，T5,pBAD系統(tǒng)包涵體？IPTG濃度(1uM,10uM,100uM)，降溫低至18℃LB

TB培養(yǎng)基與MBP融合表達共表達分子伴侶改善可溶性定向進化重組表達制備有功能的蛋白質參考文獻報道改變誘導條件（溫度，誘導劑的量）增溶標簽（MBP)改換表達載體，如不同的啟動子分子伴侶根據(jù)基因來源，考慮所使用的表達宿主及載體包涵體純化定向進化大腸桿菌表達系統(tǒng)小結優(yōu)點最方便，最有效缺點分泌表達能力弱二硫鍵形成困難無翻譯后修飾酵母表達系統(tǒng)(Invitrogen)PichiaExpressionKitsPichiapastoris

簡介BuddingPichiapastoris醇氧化酶的催化場所––––過氧化物酶體可占到細胞總體積的80%無快速碳源而含有甲醇，產(chǎn)生醇氧化酶能占到細胞總蛋白的30%Pichiapastoris表達體系的優(yōu)點外源基因穩(wěn)定整合醇氧化酶基因的啟動子強，且可用甲醇嚴格調控表達重組蛋白質可以以胞內或胞外形式表達含有真核表達系統(tǒng)共有的翻譯后修飾功能有商品化宿主/載體，操作簡便放大方便，發(fā)酵密度極高TypicalPichiapastorisexpressionvector

5’AOX1:AOX15’regionincludingpromoterMCS:MultiplecloningsiteTT:AOX1terminatorHIS4:histidinoldehydrogenase3’AOX1:AOX13’regionAmp:Ampicillin-resistancemarkerfiori:f1bacteriophageorigin.Sig:signalsequencesSacI,SalI,StuIandBglIIcuttingsiteareusedtolinearizethevectorbeforetransformationPromotoraox1啟動子：強啟動子甲醇誘導葡萄糖，甘油等快速碳源阻遏表達調控技術較成熟gap啟動子組成型強啟動子葡萄糖 強啟動子甘油 中等強啟動子甲醇 弱啟動子Pichiapastorisstrains

StrainGenotypeApplicationX33Wild-typeSelectionofZeocin-resistantexpressionvectorsGS115his4SelectionofHIS4expressionvectorsKM71his4,aox1::ARG4;arg4SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithMutSphenotypeKM71Haox1::ARG4;arg4SelectionofZeocin-resistantexpressionvectorstogeneratestrainswithMutSphenotypeSMD1165his4prB1SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteinBactivitySMD1168his4pep4SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseAactivitySMD1163his4pep4prB1SelectionofHIS4expressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseAandproteaseBactivitySMD1168Hpep4SelectionofZeocin-resistantexpressionvectorstogeneratestrainswithoutproteaseAPichiapastoris表達實驗流程電轉化GS115初篩(50ml離心管)

有表達

復篩(250ml搖瓶)

發(fā)酵罐無表達

以pPIC3.5K嘗試胞內表達外源基因克隆到pPIC9的alpha信號肽序列之后Pichiapastoris表達系統(tǒng)小結優(yōu)點有商品化宿主/載體，操作簡便真核表達系統(tǒng)重組蛋白質可以以胞內或胞外形式表達高密度發(fā)酵方便有翻譯后加工缺點翻譯后加工形式有獨特性重組酶表達小結首選文獻報道表達系統(tǒng)次選大腸桿菌大腸桿菌中無活性選用酵母系統(tǒng)根據(jù)基因來源定表達系統(tǒng)芽孢桿菌放線菌酵母霉菌基因加親和標簽便于純化酶制備流程圖細胞破碎手段超聲波目前只用于實驗室或小規(guī)模高壓勻漿機(highpressurehomogenizer)珠磨機(beadmills)freeze-presses小規(guī)模滲透壓沖擊法自發(fā)分解(yeast,Bacillus)酶裂解(溶菌酶，Lyticase,Zymolase,蝸牛酶)細胞破碎需考慮因素HeatAllmechanicalmethodsrequirealargeinputofenergy,generatingheat.Coolingisessentialformostenzymes.Thepresenceofsubstrates,substrateanaloguesorpolyolsmayalsohelpstabilisetheenzyme.ShearShearforcesareneededtodisruptcellsandmaydamageenzymes,particularlyinthepresenceofheavymetalionsand/oranairinterface.ProteasesDisruptionofcellswillinevitablyreleasedegradativeenzymeswhichmaycauseseriouslossofenzymeactivity.Suchactionmaybeminimisedbyincreasedspeedofprocessingwithasmuchcoolingaspossible.Thismaybeimprovedbythepresenceofanexcessofalternativesubstrates(e.g.inexpensiveprotein)orinhibitorsintheextractionmedium.pHBufferedsolutionsmaybenecessary.Thepresenceofsubstrates,substrateanaloguesorpolyolsmayalsohelpstabilisetheenzyme.ChemicalSomeenzymesmaysufferconformationalchangesinthepresenceofdetergentand/orsolvents.Polyphenolicsderivedfromplantsarepotentinhibitorsofenzymes.Thisproblemmaybeovercomebytheuseofadsorbents,suchaspolyvinylpyrrolidone,andbytheuseofascorbicacidtoreducepolyphenoloxidaseaction.OxidationReducingagents(e.g.ascorbicacid,mercaptoethanolanddithiothreitol)maybenecessary.Foaming

Thegas-liquidphaseinterfacespresentinfoamsmaydisruptenzymeconformation.

Heavy-metaltoxicityHeavymetalions(e.g.iron,copperandnickel)maybeintroducedbyleachingfromthehomogenisationapparatus.Enzymesmaybeprotectedfromirreversibleinactivationbytheuseofchelatingreagents,suchasEDTA.Manton-Gaulin勻漿機從澄清液中提取酶超濾硫酸銨沉淀有機溶劑沉淀熱處理濃縮去不耐熱的雜蛋白胞內酶純化

去除核酸非特異性

硫酸銨沉淀特異性帶正電荷材料

(與核酸帶負電的磷酸基團作用形成復合物)聚乙烯亞胺，陰離子洗滌劑十六烷基三乙基溴化銨，硫酸鏈霉素，硫酸魚精蛋白牛胰核酸酶色譜（層析）離子交換色譜吸附色譜親和色譜疏水色譜凝膠排阻色譜（分子篩）酶制劑使用添加劑共價修飾固定化小結酶的來源很多，但主要來源于微生物發(fā)酵酶的工業(yè)化應用取決于他們的效果，成本和安全性離心一般用于收集含酶固體

過濾更多用于液體酶回收

雙水相體系將會在酶回收操作中得到更多應用制備工業(yè)用酶需盡量壓縮分離提取步驟酶制劑必須穩(wěn)定，使用安全固定化酶優(yōu)點便于從反應體系中分離從而易于控制反應時間，減少酶失活可反復使用降低用酶成本提高酶穩(wěn)定性缺點傳質限制動力學性質發(fā)生變化固定化增加額外成本

a.吸附

b.共價連接

c.包埋

d.膜限制

酶的固定化方法多點作用使酶穩(wěn)定化固定化酶方法比較Characteristics

Adsorption

Covalent

bindingEntrapmentMembraneconfinementPreparation

Simple

Difficult

Difficult

SimpleCost

Low

High

Moderate

HighBindingforce

VariableStrong

Weak

StrongEnzymeleakage

Yes

No

Yes

NoApplicability

Wide

Selective

Wide

VerywideRunningProblems

High

Low

High

HighMatrixeffects

Yes

Yes

Yes

NoLargediffusionalbarriers

No

No

Yes

YesMicrobialprotection

No

No

Yes

Yes

固定化載體EupergitC?Sepabeads?series新型固定化方法—無載體固定化Thedifferentapproachestotheproductionofcarrier-freeimmobilisedenzymes:crystallization;(b)aggregation;(c)spray-drying;(d)directcross-linking.AGG,aggregates;CRY,crystals;SDE,spray-driedenzyme.固定化酶小結酶的固定化使得它們能高效和連續(xù)使用酶的固定化形式有4種酶的固定化影響動力學性質酶的固定化一般可提高其使用的經(jīng)濟性酶的固定化新技術－－無載體固定化酶反應器圖解基礎篇小結重組微生物是酶的最重要來源工業(yè)用酶的分離提取對成本敏感固定化酶是工業(yè)用酶制劑的重要形式酶反應器對于發(fā)揮酶的催化作用也很重要提高篇酶的改造獲得新酶的途徑自然界中獲取有理設計新酶隨機方法篩選新酶酶的設計方法無理設計天然設計有理設計基于功能--生物多樣性與新酶的發(fā)現(xiàn)嗜熱菌（Thermophiles)嗜冷菌（Phyphophiles)嗜酸菌（Acidophiles)嗜堿菌（Alkaliphiles)嗜鹽菌（Halophiles)嗜壓菌（Barophiles)

極端微生物的特殊生長環(huán)境及代謝產(chǎn)物，使酶在“惡劣”環(huán)境下能夠發(fā)揮高效催化作用?；谛蛄?-目前已經(jīng)有無數(shù)的基因組被測序/sites/genomeSαIβDistributionforpenicillinGacylasePGAprecursorstructure天然酶化學

-轉化天然底物物理 -耐受差生物 -代謝調控和高轉換數(shù)環(huán)境不同要求不同自然進化中天然酶的結構功能對應于其活細胞的生理功能而進化的天然酶往往不適用于生物技術應用改造目的高專一性

只催化所需反應

減少甚至沒有副產(chǎn)物高活性高生產(chǎn)率不易受抑制高穩(wěn)定性

存放時間長操作穩(wěn)定性高生物催化劑應用依賴于天然酶改造或重新設計方法酶的改造蛋白質工程－－理性設計

通過蛋白質化學、蛋白質晶體學和動力學的研究獲取關于蛋白質物理、化學等方面的信息，在此基礎上對編碼該蛋白的基因進行有目的的設計改造，并通過基因工程等手段將其進行表達和分離純化，最終將其投入實際應用。基因工程，結構生物學和生物信息學化學修飾固定化誘變篩選－－無理設計Timeline|20yearsofproteinengineeringJamesA.BranniganandAnthonyJ.Wilkinson.Proteinengineering20yearson.

NatureReviewsMolecularCellBiology2002,3,964-70CDR,complementarity-determiningregions:TyrRS,tyrosyl-tRNAsynthetase分子生物學知識復習

中心法則蛋白質功能＝f(蛋白質序列)

改變序列影響蛋白質功能(c)DNA序列蛋白質序列立體結構功能蛋白質序列空間a表示最小蛋白質的氨基酸殘基數(shù)，b表示最大蛋白質的氨基酸殘基數(shù)。n個氨基酸殘基組成的線性長鏈的序列空間為20n所有蛋白質都可以表示為這個b維空間的唯一一點，比如枯草芽孢桿菌蛋白酶BPN’坐標為（A,Q,S,V,P,Y,G,V,S,Q,I,K,A,…,A,Q,0,…,0,0,0）。小至100個氨基酸殘基組成的酶的序列空間也大至20100序列空間蛋白質特性序列空間距離近蛋白質性質接近PAM250氨基酸相對突變率矩陣

和

基本氨基酸性質關系venn圖有理設計根據(jù)詳盡的結構功能關系知識結構一級結構 氨基酸順序二級結構 a-螺旋,b-折疊,轉角,無規(guī)卷曲三級結構 3D折疊(結晶，NMR)功能活性位點 氨基酸殘基和輔因子催化 機理,

特異性和動力學調節(jié) 競爭性抑制和變構控制

怎么獲得這些信息？經(jīng)典途徑純化目標酶，分析氨基酸序列分離基因并重組表達結晶目標酶，X射線分析Copyrightrestrictionsmayapply.Chang,A.etal.Nucl.AcidsRes.200937:D588-D592;doi:10.1093/nar/gkn820Inputdataandtheirsourcedatabasesusedfortheco-occurencebasedtext-miningapproachthatgeneratestheBRENDAsupplementsFRENDAandAMENDA序列與結構分析多重聯(lián)配 序列保守性信息結晶/同源模建 獲得立體結構三維結構分析 分子圖像分析多重聯(lián)配

ClustalWCrystals:18%PEG6K,0.1MBicine,pH8.5,0.01MCdCl2.StructuralstudiesofD-hydantoinasefromBurkholderiapickettiiSummaryofpurificationofDHasefromE.coliBL21(DE3)/pXZPH2PurificationstepSamplevol(ml)Totalprotein(mg)Totalactivity(U)Spact(U/mg)PurificationfactorActivityyield(%)Cellextract25.060030.80.051.0100Ni2+chelateaffinitycolumn

4.04.45.01.1322.616.6ARibbondiagramshowingtheoverallstructureofDHasemonomerandtetramerviewedfromthecatalyticactivesite.XuZetalJournalofBacteriology2003PyMOL:Itcanproducehighquality3DimagesofsmallmoleculesandbiologicalmacromoleculesMVD蛋白質與配體分子對接分析HIV-1proteaseXK263PDBID:1HVR文件格式：PDB、Mol2、SDF等預測活性中心Docking配體與蛋白質間氫鍵有理設計目標催化效率穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性有機溶劑穩(wěn)定性pH曲線提高熱穩(wěn)定性的重要全局性因素環(huán)區(qū)長度減少以及隨之而來的二級結構增加表面電荷相互作用敏感氨基酸殘基減少

(如半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺)芳香環(huán)堆積增加疏水作用增加金屬離子結合能力提高寡聚增加JasonKYanoandThomasLPoulos.Newunderstandingofthermostableandpeizostable

enzymes.CurrentopinioninBiotechnology,2003,14:1-6

常用提高穩(wěn)定性方法 引入二硫鍵和/或鹽橋CCOOCCOOCCOOCCOOCCOOIndex1Index2Index3Index40<OSP<0.150.15<OSP<0.300.30<OSP<0.450.45<OSP<0.600.60<OSP<0.75FullyexposedstateExposedstateBoundarystateBuriedstateWell-buriedstateIndex5氨基酸殘基分布差異高

PRO

低

MET

低極顯著低低SER

（低）低（低）ASN高

TYR高

TRP

低LYS

高極顯著

高

GLU

高

高

ARG

高ILE

低

VAL高極顯著

低極顯著

ALA完全包埋包埋部分包埋/部分暴露暴露完全暴露

對于熱穩(wěn)定性改造的具體指導完全暴露

SER,LYS

ILE

暴露

ALA,VAL,ASN,SER

ARG,GLU

部分包埋/部分暴露SER

?

包埋： MET

ARG,GLU

完全包埋： ?

ALA,TRP,TYR,PRO

pH曲線的改變將蛋白質表面變得更帶負電荷將提高酸性基團的pKa值，因為它們在離子化時丟失質子。反之，將表面變得更帶正電荷則降低所有酸性基團的pKa值。低離子強度時變化將最大如果避免多電荷抗衡離子，當離子強度高至0.1M時會出現(xiàn)明顯的變化。突變設計應避免在活性中心空穴附近聚集抗衡離子。RussellandFersht.Rationalmodificationofenzymecatalysisbyengineeringsurfacecharge.

Nature,1987,328(6),496-500融合蛋白質－－廣義的有理設計組氨酸標簽(Histidine-tag,his-tag)谷胱甘肽合成酶

(glutathionesynthetase,GST)麥芽糖結合蛋白質

(maltosebindingprotein,MBP)內含肽(Intein)各種信號肽改善重組蛋白可溶性，便于親和層析純化。。。PCR原理定向突變

-PCRStratageneMutagenesisKitSelectionGuide兩種定點突變方法的比較有理設計小結工具酶數(shù)據(jù)庫 Brenda序列聯(lián)配 ClustalW同源模建 Swissmodel分子圖像 Rasmol定點突變，序列重組 PCR目標熱穩(wěn)定性，pH曲線 表面氨基酸替換催化效率需了解催化機理底物特異性 需了解催化機理生物催化劑的定向進化高頻隨機突變導入方法DNA聚合酶 堿基錯配率/每輪復制大腸桿菌體內 1 X10-10-10-8Replicase 1.03 X10-4Vent(exo-) 1.9 X10-4Taq 2.0-21 X10-5KlenTaq 5.1 X10-5Vent 2.4-5.7 X10-5Pfu,PfuTurbo 1.6 X10-6

易錯PCRerror-pronePCR(=PCRwithmanyerrors/mutations)

無校對DNA聚合酶 e.g.Taq,Mutazyme

非優(yōu)化條件 e.g.Mn2+代替Mg2+,調整4種dNTP相對濃度RandomMutagenesiskit突變率0.1－1.6%/PCR,相當于1－7個堿基突變/基因高頻隨機突變導入方法以大腸桿菌XL1-Red作為基因復制宿主

MutantsoftheP.furioususAlkalinePhosphataseGene:MorphologyofclonesonLBplatescontainingBCIPindictorsubstrate.A:ParentPfualkalinephosphataseclone.B:Pfu5.C:Pfu5-1.D:Pfu5-2.XL1-Bluestrain:recA1endA1gyrA96thi-1hsdR17supE44relA1lac[F'proABlacIqZΔM15Tn10(Tetr)]

正常菌株XL1-Redstrain:endA1gyrA96thi-1hsdR17supE44relA1lacmutD5mutSmutTTn10(Tetr)

DNA修復缺陷

Greener,A.andCallahan,M.

(1994),Strategies.

7:32-34

培養(yǎng)到平臺期平均2Kb發(fā)生1個堿基突變逐點飽和突變技術逐點飽和突變技術定向進化提高枯草芽孢桿菌蛋白酶E在DMF水溶液的活力ChenandArnold.PNAS1993YouandArnold.ProteinEng1996進化

逐步過程自然進化

自發(fā)突變

重組

自然選擇達爾文進化理論

生命的復雜性是突變，重組和自然選擇算法的結果人類的作物，花卉和家禽家畜育種實踐有幾千年歷史加速進化

快速改變農(nóng)業(yè)進化

自發(fā)突變

育種

篩選革命

極快改變實驗室進化

加快突變速度 分子育種

篩選實驗室進化不同于自然進化在于其明確的進化目標.在此意義上它是“定向”并且更像育種。此外，它非?？臁＜铀龠M化

快速改變農(nóng)業(yè)進化

自發(fā)突變

育種

篩選革命

極快改變實驗室進化

加快突變速度

分子育種

篩選進化

逐步過程自然進化

自發(fā)突變

重組

自然選擇DNAshufflingscreenandselect*

**

*

**

PCRDNaseI*

**

*

PCR*

**

**

libraryDenature&anneal5’5’***Homo-duplexformation5’5’**5’5’**5’3’3’5’**fillin&lify**Error-pronePCRDNAShufflingDNAshuffling–β-lactamasecaseβ-Lactamase:hydrolysisofbeta-lactamantibioticsβ-lactamaseAmpicillinCefotaximedegrade(Stemmer,W.P.C.Nature1994370:389-391)TEM-1W.T.shuffling-3cycleBackcrossover-2cycleX16,000X32,000MIC=0.02ug/mlMIC=640ug/mlperiplasm定向進化方法比較Accumulationofmutationsbysequentialmutagenesis,

pairwiserecombinationandpoolwiserecombination

單基因Shuffling和多基因Shuffling獲得的突變庫DNAFamilyshufflingParentalSequencesRandomFragmentationDenaturizationAnnealingExtentionFinalLibrarycrossoverRepeatedCyclesofPrimerlessPCR

定向進化的基本過程SinglegeneDNAshufflingMultiplegenesDNAfamilyshufflingExpressionandscreenRepeatedasneededComparisonofsinglesequenceshufflingversussequencefamilyshufflingStaggeredExtensionProcess(StEP)DenaturationAnnealing,

ExtensionDNADNADenaturationAnnealing,

ExtensionRACHITT示意圖兩種野生型基因A和B雙鏈DNA處理成單鏈DNA。DNaseI處理單鏈DNA，形成許多的隨機大小的片段。隨機片段與單鏈模板雜交。通過兩端引物的PCR擴增反應得到具有目的片段大小的雜合基因。14crossovervs1-4crossoverDNAshuffling-efficiencydependsonhomologyHomo-duplexformation5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’Hetero-duplexformation5’3’3’5’PCRPCRResemblessynthesisofsyntheticgene(DirectedMutagenesis)Resemblessynthesisofgenefusions(DirectedMutagenesis)IncrementalTruncationfortheCreationofHYbridenzymes

(ITCHY)

對隨機挑選的混組酶進行測序證明ITCHY比普通混組方法在兩個基因的非同源區(qū)發(fā)生了更多的交叉。而且通過ITCHY發(fā)現(xiàn)的嵌合酶比普通DNA混組方法獲得雜合酶的活性相同或更高。

SequenceHomology-Independent

ProteinRecombination(SHIPREC)應用于膜結合人細胞色素P450和可溶性細菌P450亞鐵血紅素結構域的混組，將混組基因庫和氯霉素乙?；D移酶基因融合，篩選到2個在細菌中可溶性比人P450高的P450雜合酶。

error-pronePCR2-6nucleotidemutations/DNAmolecule1-3aminoacidsubstitutions/proteinmoleculeDNAshufflinghighhomologyatDNAlevel(>60%identity)

-fragmentationbyDNase(multiplerecombination) -restrictionenzymes(multiplerecombination)lowhomologyatDNAlevel

-domainswapping(single-siterecombination;ITCHY) -shufflingof“syntheticgenes”(multiplerecombination)實驗室進化-進化方法比較

高通量篩選－－無理設計的有理部分selection選擇screening篩選ImagingPolarimetryforHighThroughputChiralScreeningPhillipR.Gibbs,ChristianS.Uehara,PeterT.Nguyen,andRichardC.WillsonBiotechnol.Prog.19,13