血清學(xué)檢驗(yàn)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

《動(dòng)物微生物專項(xiàng)技能訓(xùn)練》

血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗ㄊ夏?、馬立克傳染病的相關(guān)知識(shí)掌握瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的原理掌握瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢驗(yàn)技術(shù)法氏囊

（InfectiousBursulDisease,IBD）法氏囊病是由法氏囊病毒引起的急性高度接觸性傳染病，又稱為甘布羅病。本病的危害除了使雞減重或發(fā)病死亡外，更重要的是會(huì)引起體液免疫中樞器官—法氏囊的損害，從而導(dǎo)致新城疫、馬立克等疫苗接種后免疫應(yīng)答差或失敗。該病以法氏囊、腎臟病變以及腿肌、胸肌出血，腺胃與肌胃交界處出血為特征。病原IBDV：呼腸孤病毒科雙股RNA病毒屬，無(wú)囊膜；血清1型（雞源）：有致病性，6個(gè)亞型，一個(gè)亞型包括所有的變異株；超強(qiáng)毒株；血清2型（火雞源）：無(wú)毒力，雞、火雞中的抗體均普遍存在4種病毒蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4，VP2是主要保護(hù)性抗原；抵抗力強(qiáng),碘化物0.5%的氯化銨，0.05%氫氯化鈉能滅活。病原形態(tài)病毒粒子呈20面體對(duì)稱病毒可在雞胚中繁殖，以CAM（絨毛尿囊膜）途徑最好（次為卵黃囊尿囊腔最差）。接種72小時(shí)后，胚體、CAM、AAF（尿囊液）病毒濃度達(dá)高峰，雞胚3-7天死亡（5天最多）。死亡雞胚全身水腫，頭部和趾部充血和小點(diǎn)出血，肝有斑駁狀壞死。由變異株引起的病變僅見(jiàn)肝壞死和脾臟腫大，不致死雞胚。培養(yǎng)馬立克（Marek'sDisease,MD）馬立克氏病又名多發(fā)性神經(jīng)炎、皮膚白血病等。是由馬立克氏病毒引起雞的一種多型性的、高度接觸性的，以淋巴組織細(xì)胞增生為特征的腫瘤性傳染病。其特征是外周神經(jīng)、性腺、虹膜、各個(gè)臟器、肌肉和皮膚發(fā)生淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)和形成腫瘤。病原MDV屬于皰疹病毒科、B亞群皰疹病毒屬。在雞體內(nèi)以細(xì)胞結(jié)合和游離于細(xì)胞外兩種狀態(tài)存在：1、裸體粒子：無(wú)囊膜，存在于腫瘤的病變中,與細(xì)胞的結(jié)合性最強(qiáng)(細(xì)胞結(jié)合性病毒)，一旦脫離細(xì)胞很快失去活力和致病力，在馬立克氏病的傳播中意義不大2、完全病毒：外面有很厚的囊膜，存在于羽毛囊上皮細(xì)胞，可以脫離細(xì)胞而生存(非細(xì)胞結(jié)合性病毒)，對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，在疾病的傳播上有重要意義。血清1型：致瘤的MDV血清2型：自然無(wú)毒株血清3型：火雞皰疹病毒，(簡(jiǎn)稱HVT)。HVT與MDV有明顯區(qū)別，對(duì)雞無(wú)致病性，但可作為預(yù)防MD的有效疫苗。病原形態(tài)結(jié)構(gòu)馬立克氏病病毒（MDV），在感染了的雞胚成纖維細(xì)胞胞核的空泡中，可見(jiàn)到成熟的小囊膜MDV粒子（雙箭頭）在胞核基質(zhì)內(nèi)可觀察到未成熟的MDV核衣殼（箭頭），超薄切片。法氏囊與馬立克主要診斷依據(jù)流行病學(xué)臨床癥狀病理組織學(xué)檢查病毒分離鑒定血清學(xué)試驗(yàn)：1、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)器材平皿、打孔器、微量移液器、酒精燈、燒杯、玻璃棒、電子天平、96孔板等。瓊脂粉、氯化鈉、生理鹽水、馬立克標(biāo)準(zhǔn)抗原、法氏囊標(biāo)準(zhǔn)抗原、待檢血清等實(shí)驗(yàn)原理

可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體凝膠(瓊脂或瓊脂糖)中可以自由擴(kuò)散。

若抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，且比例合適，在擴(kuò)散相遇處可形成白色沉淀線。一種抗原、抗體系統(tǒng)只出現(xiàn)一條沉淀線，復(fù)合物中的多種抗原抗體系統(tǒng)可根據(jù)濃度、擴(kuò)散系數(shù)、最適比等因素形成不同的沉淀線。實(shí)驗(yàn)原理

沉淀線的位置與抗原、抗體的濃度、分子大小等有關(guān)。如：抗原濃度高，則沉淀線偏向抗體孔。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)步驟1、瓊脂板的制備稱量瓊脂粉1.0g于燒杯中，加入100mLPBS溶液，加熱充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1mL，攪拌均勻。待溶液冷至45℃～50℃后，向平皿中加入18～20mL瓊脂液，加蓋待凝固。2、打孔在瓊脂板上按7孔一組的梅花形打孔（中間1孔，周圍6孔），孔徑5mm，孔距2-5mm，將孔內(nèi)的瓊脂用針頭斜面向上輕輕將瓊脂挑出，勿傷邊緣或使瓊脂層脫離皿低。3、封底用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂板底部剛剛要溶化（手背感覺(jué)微燙手）為止，封閉孔底部，以防側(cè)漏。

4、加樣用微量移液器吸取馬立克或法氏囊標(biāo)準(zhǔn)抗原滴加于中間孔內(nèi)，將陽(yáng)性對(duì)照血清與待檢血清分別滴加在外周孔內(nèi)。加樣量以“滿而不溢”為原則。（中間孔加已知，外周孔加對(duì)照和未知）5、反應(yīng)

加樣完畢后，靜置5-10min，然后將平皿輕輕放入濕盒內(nèi)，37℃溫箱中反應(yīng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)加樣時(shí)、注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度反應(yīng)時(shí)間要適度，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，沉淀線可能解離導(dǎo)致假陰性。每加完不同的樣后要更換槍頭，防止造成污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

24-48小時(shí)后，將瓊脂板置日光燈或側(cè)強(qiáng)光下觀察，若