第五章核酸的分子雜交12.3.2

第五章核酸的分子雜交與基因芯片nucleicacidhybridizationandGenechip

生物化學與分子生物學教研室宋方洲2012.3.22一、核酸分子雜交的概念二、核酸分子雜交的用途三、核酸分子雜交的原理四、核酸分子雜交的過程五、影響核酸分子雜交的因素六、核酸分子雜交的基本方法七、探針的標記八、熒光原位雜交（FISH）技術及其應用九、基因芯的概念與原理十、基因芯片的種類與應用主要內容：第一部分核酸分子雜交1.雜交(hybridization）

從遺傳的角度來說,雜交指基因型不同的個體之間進行的交配。遺傳學中經典的也是常用的實驗方法。通過不同的基因型的個體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個體的方法。一般情況下，把通過生殖細胞相互融合而達到這一目的過程稱為雜交；而把由體細胞相互融合達到這一結果的過程稱為體細胞雜交。一、核酸分子雜交的概念2.核酸分子雜交（nucleicacidmoleucular

hybridization）是指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。雜交的雙方分別稱為探針與待測核酸，雜交后形成的異源雙鏈分子稱為雜交分子。

DNA—DNA雜交分子DNA—RNA雜交分子

DNA分子DNA分子復性RNADNA核酸分子雜交技術是目前生命科學研究領域中應用最廣泛的技術之一。用途：1.是定性或定量檢測特異DNA或RNA序列片段的有力工具；2.在基因工程技術中，用放射性標記或非放射性標記的寡核苷酸或cDNA探針進行菌落雜交，可從cDNA文庫或基因組文庫中篩選出特定的克隆，獲得某一重組體；3.用克隆化的DNA片段作探針進行Southern雜交，可確定基因組DNA上特定區(qū)域的核苷酸同源順序；二、核酸分子雜交的用途4.用S1核酸酶或RNA酶消化DNA/RNA或者RNA/RNA雜交體是分析基因轉錄或RNA加工的重要方法；5.對某一已知基因或已克隆測序的基因可利用核酸雜交技術進行染色體定位；6.可用于遺傳病的基因診斷，用于限制性片段長度多態(tài)性作疾病的相關分析，基因連鎖分析，法醫(yī)學上的性別分析和親子鑒定。7.在人類學研究中也有應用價值。核酸分子雜交的基本原理是：具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）堿基互補配對結合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經歷了變性和復性的變化，以及復性過程中分子間鍵的形成和斷裂等。雜交的雙方是待測核酸序列和已知核酸序列。在雜交體系中已知的核酸序列稱作探針（probe

），探針通常用于進行核素或非核素示蹤標記。三、核酸分子雜交的原理探針的意義：要檢測某一樣品或基因組DNA中特定的DNA順序或基因片段，首先必須獲得相應的探針，即已知順序的DNA或RNA片段，并使它帶上可檢測到的示蹤標記。ATCGGTACATTAGCCATGTA

探針序列待測樣本序列分子雜交的形式：

⑴固—液相雜交

一般在進行某一核酸順序的檢測時，先將待測的單鏈靶核酸固定在適當?shù)妮d體上，然后置于含相應單鏈核酸探針的雜交反應體系中，通過堿基互補配對原則，兩條單鏈的同源順序通過氫鍵互相結合，形成雙鏈結構。經過對標記探針的檢測可以判斷待檢測樣品中相應順序的存在與否及分子量大小。

⑵液相雜交有時也將待測核酸和已知核酸同時放在液體中進行雜交反應。兩種雜交形式的基本原理都是一樣的。

1.變性：在物理或化學因素作用下，例如加熱、酸堿或紫外線照射，可以導致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中的所有共價鍵（如磷酸二酯鍵、糖苷鍵等）則不受影響，稱為DNA變性（DNAdenaturation）。四、核酸分子雜交的過程—DNA的變性與復性導致DNA變性的常用方法有三種：⑴熱變性⑵堿變性⑶化學試劑變性。變性的情況：a.T<700C，DNA幾乎不變性；b.700C<T<900C，DNA部分變性；c.T>900C，DNA變性使雙鏈打開，成為單鏈分子；d.T>1000C，DNA雙鏈分離。所以，一般核酸變性的溫度都選在90～1000C之間。

（1）熱變性：當升高核酸溶液的溫度時，核酸雙鏈間的氫鍵發(fā)生斷裂，核酸的雙鏈逐漸打開。（2）酸堿變性：當核酸溶液的pH低于3或高于10時，核酸的雙鏈可以完全打開成為單鏈核酸分子。在分子雜交中，最常用的核酸變性方法是堿變性。因通常需要的核酸的載體如凝膠或膜對熱都不穩(wěn)定。（3）化學試劑變性：當核酸溶液中含有一定濃度的化學試劑如尿素、甲醛等時，兩條鏈之間的氫鍵可以斷裂而形成單鏈核酸分子。除物理、化學因素外，DNA分子的組成也影響變性。最主要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易變性，而AT含量高的DNA容易變性。另外,環(huán)狀DNA比線性DNA難于變性.

DNA的變性是可逆的，即兩條互補的單鏈DNA分子在變性條件除去后重新按堿基互補原則以氫鍵相連形成雙鏈DNA分子，這一過程稱作DNA復性（DNArenaturation）

。如果是異源雙鏈分子的結合則稱為雜交(hybridization)

。相似的復性或雜交反應可以發(fā)生在任何具有互補核苷酸順序的兩條單股核酸鏈之間，如DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA或人工合成的寡核苷酸片段與DNA、RNA等。2.復性1.核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復性速度越快；分子量越大，復性速度越慢。一般情況下：探針濃度為0.1～0.5μg；長度為50～300bp2.溫度：適宜溫度為比Tm值低250C

Tm—雙鏈DNA變性一半所需要的溫度(DNA的溶解溫度，melting

temperature,Tm）3.離子強度：低離子（Na+）強度下，核酸雜交非常緩慢，離子強度增加，雜交反應率增提高。所以，必須維持較高的雜交反應液和洗膜液的鹽濃度五、影響核酸分子雜交的因素核酸分子雜交實際上就是兩條互補的單鏈核酸分子通過復性重新締合形成雙鏈的過程。這一過程受到諸多因素的影響。4.雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，從而使得：（1）在低溫下探針更穩(wěn)定；（2）能更好地保留非共價結合的核酸。一般是：50%甲酰胺35～420C5.核酸分子的復雜性：不同順序的總長度(堿基數(shù)）6.非特異性雜交反應：

須在雜交前封閉非特異性雜交位點，以減少其對探針的非特異性吸附作用1.Southern印跡雜交（Southernblot）

——鑒別DNA靶分子（待測核酸是DNA）六、核酸分子雜交的基本方法3.斑點雜交、4.原位雜交、5.核酸酶保護實驗等。2.Northern印跡雜交（Northernblot）

——鑒別RNA靶分子（待測核酸是RNA）根據其用途可將核酸分子雜交分為幾種基本類型：Southern印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉印并結合到一定的固相支持物上，然后用標記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。這是1975年英國愛丁堡大學的Southern建立的方法，因此而得名。

基本步驟：（一）Southern印跡雜交

1.待測核酸樣品的制備（1）制備待測DNA：從樣本的細胞或組織中制備DNA（2）DNA的限制酶消化：將DNA切割成大小不同的片段

2.待測DNA樣品的電泳分離：將DNA樣品在0.8～1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以對DNA片段進行分離（瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖形成的網狀物質，具有分子篩的作用，DNA因其分子大小而在瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同達到分離）。

3.凝膠中核酸的變性：對凝膠中的DNA進行堿變性，使其形成較短的單鏈片段。

4.Southern轉膜：將凝膠中的DNA片段轉移到硝酸纖維膜（NC）等固相支持物上。各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置是一樣的，故稱為印跡（blot）。（1）毛細管虹吸印跡法：利用濃鹽轉移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉移到固相支持物上。（見下頁圖）（2）電轉印法：通過電泳作用將凝膠中的DNA轉移到濾膜上。（3）真空轉移法：其原理與毛細管虹吸印跡法相同。Southern轉膜的方法重物濕濾紙吸水紙玻璃板膠膜濕濾紙濕濾紙橋支持平臺玻璃容器20×SSC毛細管虹吸法Southern轉膜示意圖5.探針的制備：用缺口平移或隨機引物標記的方法制備探針、標記。7.

雜交結果的檢測（1）放射線標記——放射自顯影，感光膠片，顯出黑色雜交帶；（2）非放射線標記——直接顯出雜交帶，進行檢測。6.Southern雜交（1）預雜交封閉膜上所有能與DNA結合的位點轉印后的膜在預雜交液（不含探針的雜交液）4～6小時（2）雜交（過夜）分子雜交實驗①②③目錄放射自顯影照片目錄分子雜交電泳圖目錄Southern印跡雜交在醫(yī)學中的應用

Southern印跡雜交技術已有30余年的歷史，在核酸的結構和功能研究中作出過重要貢獻。如：發(fā)現(xiàn)成熟B細胞中免疫球蛋白基因重排現(xiàn)象；進行克隆基因的酶切圖譜分析；特定基因的定性和定量；DNA多態(tài)性(RFLP,RAPD,AFLP等)分析……

Northern印跡雜交是指將待測RNA樣品經電泳分離后轉移到固相支持物上，然后與標記的核酸探針進行固—液相雜交，以檢測RNA（主要是mRNA）的方法。其基本原理和基本過程與Southern印跡雜交基本相同。只是在以下幾點有所不同。（二）Northern印跡雜交1.靶核酸——RNA2.RNA電泳——在變性膠中進行（加入變性劑，以維持單鏈線性狀態(tài)）3.轉膜——電泳后不需要再進行變性和中和，直接用毛細管虹吸法等方法轉移。（三）斑點及狹縫印跡雜交特點：簡單、快速，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測；

但不能鑒別分子量，且特異性不高，有一定比例的假陽性。將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維膜和尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量研究，稱為斑點印跡(dotblot)。

如印跡是線狀則為狹縫印跡或狹線印跡(slotblot）（四）原位雜交核酸保持在細胞或組織樣本中，經適當?shù)姆椒ㄌ幚砑毎蚪M織后，將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交（insituhybridization）。這是一種標記DNA與整個染色體雜交并且發(fā)生雜交的區(qū)域可通過顯微鏡觀察的技術。特點：（1）不受組織成分的影響；（2）靈敏度高；（3）可完整保持細胞或組織形態(tài)，準確反映組織細胞的相互關系及功能；（4）可檢測多個探針。核酸原位雜交包括組織細胞的固定、預雜交、雜交、沖洗及信號檢測等基本步驟。1.組織或細胞的固定2.組織細胞雜交前的預處理（預雜交）3.探針的選擇和標記4.雜交5.雜交結果檢測重點介紹熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）概念：液相雜交是指待測核酸分子與核酸探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子。種類：

A.RNA酶保護分析法(RNaseprotectionassay,RPA)

用于mRNA定量、mRNA末端定位及確定內含子在相應基因中的位置等。（五）液相雜交1.制備待測RNA;2.RNA探針的標記3.雜交;4.除去單鏈RNA5.電泳分析B.核酸酶S1保護分析法(nucleaseS1protectionassay)

用于基因轉錄起始位點分析及內含子剪切位點分析。其原理與RNA酶保護分析法類似.

1.cDNA探針：逆轉錄→

cDNA

→克隆于載體→

擴增重組質?！?/p>

提取質?！?/p>

消化重組質粒→

切割cDNA片段

→分離純化→

cDNA探針cDNA探針應用最廣泛2.基因組DNA探針：從基因組文庫→篩選特定基因（或基因片段）→

克隆→

擴增→純化→

切取片段

→

分離純化→

探針3.寡核苷酸探針：一定長度的寡核苷酸片段（十幾個核苷酸以上）4.RNA探針：以RNA作為探針（基因克隆和體外轉錄獲得）七、探針的標記（一）探針的種類1.核素標記物一般用α-32P,但5’末端必須用γ-32P。2.非核素標記物（1）半抗原：生物素(biotin)和地高辛(digoxin,

digacin,DIG)（2）配體：生物素既是半抗原，又是親和素(avidin，

抗生物素蛋白)，故可用生物素-親和素反應進行雜交信號檢測（3）熒光素：異硫氰酸熒光素(FITC)（4）化學發(fā)光探針（二）標記物1.缺口平移法(nicktranslation)(見圖)

2.隨機引物法(randonprimer)（見圖）3.PCR標記法4.末端標記法（三）標記方法缺口平移法標記DNA探針DNaseⅠ；Mg2+5'3'

模板DNA3'5'5'3'3'

隨機打開缺口5'DNA聚合酶；[α-32P]-dCTP；dNTPs標記的探針隨機引物法標記DNA探針5'3'模板DNA3'5'5'3'變性5'3'Klenow聚合酶；[α-32P]-dCTP；dNTPs變性標記的探針隨機引物1.乙醇沉淀法2.SephadexG-50柱層析法3.微柱離心法（四）探針的純化

印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡技術

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質定性定量及相互作用研究。

Western

Blot

圖片三種印跡技術的比較八、熒光原位雜交（FISH）技術

及其在醫(yī)學上的應用（一）熒光原位雜交技術的概念

熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization,

FISH)

是一種在放射性原位雜交基礎上發(fā)展起來的非放射性原位雜交技術，是把生物素或地高辛(DIG)等標記物質標記的DNA片段作為探針（probe），與染色體DNA進行分子雜交，利用熒光色素為檢測信號，在熒光顯微鏡下直接檢測探針互補的DNA片段的存在部位。

實際上是分子生物學與細胞生物學交叉結合而形成的一種現(xiàn)代生物技術，屬于分子細胞生物學的范疇。

FISH技術現(xiàn)已成為分子生物學與分子細胞遺傳學研究中的重要手段。（二）FISH的基本原理

依據堿基互補原理，將DNA探針用特殊修飾的核苷酸分子標記（如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP），然后將標記探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再通過直接檢測（熒光素直接標記的探針）或用熒光素分子藕聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結合來間接檢測DNA在染色體或DNA纖維上的定位。

FISH基于免疫組織化學（抗原抗體反應，即與熒光素偶聯(lián)的抗體和抗原結合）與分子雜交原理。（三）用于FISH的探針類型a.著絲粒探針(centromericprobe)

b.全染色體或染色體區(qū)帶特異性探針(wholechromosomeorregion-specificprobe)

c.染色體特異性單一序列探針（uniquesequenceprobe，USP）

d.端粒染色體探針(telomericchromosomeprobes

探針DNA染色體標本切口平移法前處理探針DNA變性染色體DNA變性單鏈DNA單鏈DNA用PI、DAPI對染色體染色（四）熒光原位雜交（FISH）示意圖

探針DNA與染色體DNA分子雜交用抗生物素蛋白—熒光素處理找出雜交信號

用熒光顯微鏡觀察生物素（地高辛）標記（五）FISH衍生技術

隨著分子生物學實驗技術的不斷發(fā)展,FISH技術也在不斷發(fā)展，已形成了一系列衍生技術:1.染色體涂染(chromosomalpainting)技術

2.多彩色熒光原位雜交(multicolor-FISH)又稱多色涂染技術(multiplex-FISH)雙色FISH圖雙色FISH圖多色FISH圖由于FISH具有安全、經濟、靈敏快速和精確等優(yōu)點，它已被廣泛運用于：

9.基因診斷、產前診斷及腫瘤病理學等領域

……1.基因定位2.染色體的同源性、染色體起源與進化的研究3.染色體與基因突變的研究4.異常染色體及染色體病檢測5.外源染色體的鑒定6.轉基因動植物外源基因整合位點的檢測7.比較基因組結構和功能8.DNA分子及基因物理圖譜的構建（六）FISH

技術應用實例楊征等(2000)：以人的ras基因為探針，運用熒光原位雜交技術，首次對ras基因在玉米中同源序列進行了定位。結果表明：ras探針在第2號和第7號染色體上均檢出了雜交信號。A.在第2和第7號染色體長臂

同時檢出ras探針雜交信號；B.在2條第7號染色體長臂同時檢出ras探針雜交信號；Ras基因：促進細胞增殖，抑制細胞凋亡的原癌基因C.ras探針雜交信號在

第7號染色體長臂上；D.ras探針雜交信號在

第2號染色體長臂上；E.同時檢出ras探針2個或1

個雜交信號的間期細胞；F.同時檢出ras探針4個

雜交信號的間期細胞；汪旭等(1999).利用多色熒光原位雜交，分析了2-（4-噻唑））苯丙咪唑（TB）對小鼠精子8號、X及Y染色體分離的影響。a.正常精子8X，8Y；b.88X精子；c.8YY精子；d.88yy精子（紅色：CY3熒光，8號染色體信號。綠色：FITC熒光，Y染色體信號。黃色：CY3+FITC，X染色體信號。蘭色：DAPI，精子染色質）ABC夏薇等（2001）：FISH方法結合G顯帶檢測人E珠蛋白基因在轉基因鼠染色體整合A.轉基因鼠NO.1熒光信號位于15號染色體D區(qū)；B.轉基因鼠NO.2熒光信號位于1號染色體C區(qū)；C.轉基因鼠NO.3熒光信號位于7號染色體C區(qū)；

重點掌握：一、核酸分子雜交的概念二、原理三、種類：1.Southern印跡雜交

四、探針的種類：1.cDNA探針；2.基因組DNA探針；

3.寡核苷酸探針；4.RNA探針五、標記的方法：1.缺口平移法；2.隨機引物法；

3.PCR標記法；2.Northern印跡雜交3.斑點及狹縫印跡雜交4.原位雜交5.液相雜交4.末端標記法

基因芯片

Genechip

SongFangzhou2012.3第二部分內容提要什么是基因芯片基因芯片的原理基因芯片的種類基因芯片的應用領域基因表達譜數(shù)據分析基因芯片技術的發(fā)展與展望一、概述基因芯片（Genechip）也叫DNA芯片（DNAchip）是指在固相載體（玻璃、硅等）上有序地、高密度地（點間距<500

m）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸（也叫探針）。這些被固定的分子探針在基質上形成高密度的DNA微陣列，因此，DNA芯片又叫DNA微矩陣（DNAMicroarray）。第一塊基因芯片1992年誕生在美國?；蛐酒瑨呙杞Y果圖DNA芯片屬于生物芯片（biochip）的范疇，生物芯片包括：

1.基因（DNA）芯片

2.RNA芯片

3.蛋白質芯片

4.抗體芯片

5.細胞芯片

6.組織芯片

7.其它芯片（元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片、樣品制備芯片、核酸擴增芯片、毛細管電泳芯片等）二、DNA芯片的基本原理1.基因芯片技術是建立在Southernblot基礎之上的，可以說它是Southernblot的改進和發(fā)展，它的原理是：變性DNA加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過堿基互補形成雙鏈雜交分子。2.基因芯片與Southernblot的比較基因芯片的基本原理與Southernblot技術一脈相承，點樣技術和數(shù)據讀取技術的發(fā)展是基因芯片技術對傳統(tǒng)核酸雜交的技術性突破，因此，基因芯片技術是基因功能研究領域的一次革命，是生命科學研究領域中新近出現(xiàn)的一項嶄新技術。通過基因芯片人們可以大規(guī)模、高通量（海量）地對成千上萬個基因進行同時研究，可以說給整個生命科學都將帶來深刻的影響。與Southernblot相比較，基因芯片具有高密度、高通量、并行性、微量化、自動化的特點。GeneChip?:SynthesizingOrderedOligonucleotideArrays3.基因芯片基本操作流程制備總RNA→mRNA經RT-PCR用Cy3（正常對照組）和Cy5（實驗組）熒光標記目的基因，得到cDNA

探針→

混合標記探針→與表達譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交→掃描→分析雜交結果→結論載體+寡核苷酸-探針分子+熒光染料-點樣儀-掃描儀-計算機+專業(yè)軟件三、DNA芯片的種類表達譜芯片診斷芯片檢測芯片

用于基因功能的研究。原理：用不同的熒光染料通過RT-PCR標記不同來源的細胞mRNA制備成探針，將探針混合后與芯片上的基因雜交、洗滌、掃描，得到這些基因在不同組織或個體中的表達譜，再通過計算機分析這些基因在不同組織或個體中的表達差異，得出這些基因表達的重要信息。即：

（1）高表達（2）低表達或不表達1.表達譜基因芯片HBV、HCV、結核桿菌等病原體檢測，商檢等。2.診斷芯片在DNA和/或RNA水平上用于疾病診斷，如肝癌、糖尿病等。3.檢測芯片四、基因芯片的應用基因測序及基因圖繪制檢測基因突變基因表達分析在藥物研究中的應用在微生物菌種鑒定和致病機制研究中的應用在農林業(yè)生產中的應用在軍事、司法領域的應用1.雜交測序和基因作圖雜交測序（SBH）是發(fā)展基因芯片技術的初衷，希望能夠提供一種新的、快速的測序方法。原理：理論上有4