工業(yè)微生物接種技術(shù)課件

項(xiàng)目二微生物無(wú)菌操作及接種技術(shù)工業(yè)微生物接種技術(shù)無(wú)菌操作技術(shù)：指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。工業(yè)微生物接種技術(shù)物品：高壓濕熱滅菌操作者：無(wú)菌工作服、鞋、帽、口罩環(huán)境操作一、防污染措施污染途徑工業(yè)微生物接種技術(shù)（一）操作者人的體表、皮膚和粘膜上長(zhǎng)期寄居一些微生物，這種正常的微生物有一定的種類和數(shù)量，和宿主、體外環(huán)境三者之間保持動(dòng)態(tài)平衡，有益于宿主健康，所以這類微生物我們稱為正常菌群，他們保持了人體的微生態(tài)平衡。工業(yè)微生物接種技術(shù)對(duì)于我們制藥工業(yè)來(lái)說(shuō)，在口服藥和局部藥制備過(guò)程中，要求操作人員清洗和消毒雙手，穿上專用工作衣帽進(jìn)行操作，既可減少微生物污染。但在制備無(wú)菌要求高的注射劑和眼用、耳用溶液時(shí)要求操作人員操作前穿上全套的工作衣帽包括操作衣、褲、靴子、帽、面罩和手套。此外不允許帶菌者操作。工業(yè)微生物接種技術(shù)空氣中的微生物（細(xì)菌芽孢和霉菌孢子）主要來(lái)自灰塵，或者人的皮膚、衣服，或者由我們談話、咳嗽、打噴嚏時(shí)飛沫中帶的微生物，人越多的地方，相對(duì)微生物數(shù)量就多一些，灰塵多的房間比干凈的房間微生物多。（二）環(huán)境工業(yè)微生物接種技術(shù)工業(yè)微生物接種技術(shù)無(wú)菌環(huán)境無(wú)菌室超凈工作臺(tái)無(wú)菌環(huán)境的要求與保持工業(yè)微生物接種技術(shù)（1）無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：密封、避光，設(shè)百葉通氣窗，側(cè)面底部設(shè)進(jìn)氣孔應(yīng)有緩沖間(外間)、操作間安裝拉門1、無(wú)菌室無(wú)菌環(huán)境的要求與保持工業(yè)微生物接種技術(shù)（2）無(wú)菌室內(nèi)的設(shè)備緩沖間、操作間安裝日光燈和紫外燈，紫外燈距地高度2.0-2.2m;緩沖間內(nèi)放置工作服、鞋、帽、口罩，消毒用藥物；超凈工作臺(tái)，內(nèi)備接種用常用器具;酒精燈、接種環(huán)、打火機(jī)或火柴、記號(hào)筆、鑷子、酒精棉球瓶工業(yè)微生物接種技術(shù)（3）無(wú)菌室的消毒和防污染無(wú)菌室內(nèi)空氣測(cè)試應(yīng)基本達(dá)到無(wú)菌。使用前后紫外線照射均照射30min每周用甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。工業(yè)微生物接種技術(shù)（4）無(wú)菌室空氣污染情況的檢驗(yàn)

使用前或操作后檢查，應(yīng)無(wú)雜菌；若雜菌多為霉菌時(shí)，應(yīng)通風(fēng)干燥；雜菌多為細(xì)菌時(shí)，乳酸熏蒸效果較好。工業(yè)微生物接種技術(shù)（5）無(wú)菌室操作規(guī)則操作前打開(kāi)緩沖間和操作間的紫外燈30min;器材和用品一次性全部放入無(wú)菌室，避免在操作過(guò)程中進(jìn)出無(wú)菌室或傳遞物品.進(jìn)入緩沖間，換好工作服、鞋、帽、口罩，手消毒無(wú)菌操作操作后收拾臺(tái)面，紫外燈照射。工業(yè)微生物接種技術(shù)2、超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)是為實(shí)驗(yàn)室工作提供無(wú)菌操作環(huán)境的設(shè)施，以保護(hù)實(shí)驗(yàn)免受外部環(huán)境的影響，同時(shí)為外部環(huán)境提供某些程度的保護(hù)以防污染并保護(hù)操作者。原理：超凈工作臺(tái)的潔凈環(huán)境是在特定的空間內(nèi)，潔凈空氣(進(jìn)濾空氣)按設(shè)定的方向流動(dòng)而形成的。以氣流方向來(lái)分，現(xiàn)有的超凈工作臺(tái)可分為垂直式，由內(nèi)向外式以及側(cè)向式。工業(yè)微生物接種技術(shù)垂直流超凈工作臺(tái)水平流超凈工作臺(tái)垂直流超凈工作臺(tái)工業(yè)微生物接種技術(shù)超凈臺(tái)的使用與維護(hù)風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒使用前打開(kāi)紫外燈照射30-60min開(kāi)啟超凈工作臺(tái)工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用75%的酒精或0.5%過(guò)氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺(tái)面。使用中，有機(jī)玻璃罩受到污染，嚴(yán)禁用酒精棉球擦拭，請(qǐng)用含水棉布檫拭；請(qǐng)保持超凈臺(tái)整潔、干燥，不要堆積雜物；使用完畢，關(guān)閉酒精燈；使用完畢后，用消毒液擦拭工作臺(tái)面，關(guān)閉工作電源，重新開(kāi)啟紫外燈照射15min.定期做無(wú)菌試驗(yàn)，以測(cè)定凈化臺(tái)是否符合無(wú)菌要求。工業(yè)微生物接種技術(shù)（1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作；（2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。（3）在火焰上方操作；（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5）在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5%來(lái)蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。（三）無(wú)菌操作要求工業(yè)微生物接種技術(shù)接種：將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程。二、微生物接種技術(shù)接種的基本程序常用接種方法斜面接種劃線接種液體接種穿刺接種工業(yè)微生物接種技術(shù)（一）接種的基本程序滅菌接種環(huán)沾取標(biāo)本接種滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境操作需在無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)使用前后需進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌工業(yè)微生物接種技術(shù)斜面接種液體接種穿刺接種平板接種（二）接種的操作方法工業(yè)微生物接種技術(shù)1.斜面接種從已生長(zhǎng)好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮斜面培養(yǎng)基上的接種方法。用于好氣性微生物的接種，可進(jìn)行好氧微生物的形態(tài)觀察或菌種保藏工業(yè)微生物接種技術(shù)1.消毒：

手和臺(tái)面用75%酒精棉消毒2.標(biāo)記：

接種前在距離試管口2-3cm位置注明菌名、接種日期、接種人姓名3.整理臺(tái)面：左手用的物品放左手邊，右手用的物品放右手邊，酒精燈位于中央；無(wú)菌物品左手邊，用過(guò)的放右手邊。4.點(diǎn)燃酒精燈。工業(yè)微生物接種技術(shù)5.接種：（1）手持試管將菌種管和待接斜面管用大姆指和其他四指握在左手中，中指位于兩管之間。斜面向上，盡量放平。（2）旋松管塞（3）接種環(huán)灼燒滅菌：見(jiàn)圖4-13，三步。工業(yè)微生物接種技術(shù)（4）拔管塞：用右手的無(wú)名指、小指和手掌邊先后取下菌種管和待接試管的管塞，讓試管口緩緩過(guò)火滅菌(切勿燒得過(guò)燙)工業(yè)微生物接種技術(shù)（5）取菌:接種環(huán)冷卻，輕沾取少量菌體或胞子，然后將接種環(huán)移出菌種管，注意不要使接種環(huán)碰到管壁，取出后帶菌接種環(huán)不可通過(guò)火焰。工業(yè)微生物接種技術(shù)（6）接種:在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入待接斜面管。從斜面培養(yǎng)基底部向上作“Z”形來(lái)回密集劃線，勿劃破培養(yǎng)基。有時(shí)也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央拉一條直線作斜面接種，直線接種可觀察不同菌種的生長(zhǎng)特點(diǎn)。工業(yè)微生物接種技術(shù)

(7)塞管塞：取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動(dòng)時(shí)納入不潔空氣。

(8)將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。工業(yè)微生物接種技術(shù)斜面接種示意圖工業(yè)微生物接種技術(shù)由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。操作方法：與斜面法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時(shí)使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上棉塞再輕輕搖勻。如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一般用移液管或滴管接種2.液體接種工業(yè)微生物接種技術(shù)用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法。用于厭氣性細(xì)菌培養(yǎng)、檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力、保藏菌種只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng)3.穿刺接種工業(yè)微生物接種技術(shù)穿刺接種方法：（1）消毒（2）標(biāo)記（3）整理臺(tái)面（4）點(diǎn)燃酒精燈（5）接種

1）手持試管

2）旋松棉塞

3）接種針灼燒滅菌，把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也灼燒滅菌工業(yè)微生物接種技術(shù)4）拔出棉塞5）取菌：用冷卻接種針的針尖沾取少量菌種6）穿刺：水平法和垂直法。將接種針自培養(yǎng)基中心平穩(wěn)、快速垂直刺入培養(yǎng)基，至接近試管底部，然后沿接種線拔出7）塞上棉塞8）接種針灼燒滅菌工業(yè)微生物接種技術(shù)（1）劃線接種目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長(zhǎng)，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌。4.平板接種工業(yè)微生物接種技術(shù)分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)※適用于含菌量較多的標(biāo)本工業(yè)微生物接種技術(shù)工業(yè)微生物接種技術(shù)連續(xù)劃線法※適用于含菌量較少的標(biāo)本工業(yè)微生物接種技術(shù)稀釋法：微生物分離、純化稀釋倒平板法:菌懸液稀釋—不同梯度的稀釋液少許與培養(yǎng)基混合—搖勻—倒培養(yǎng)皿中稀釋混合平板法（傾注法）：稀釋—培養(yǎng)皿中加入不同梯度的菌懸液1mL—加45℃左右的培養(yǎng)基—搖勻稀釋涂布平板法：倒平板----稀釋----接種0.1mL—涂布工業(yè)微生物接種技術(shù)各種接種方法的用途1.斜面接種法用于鑒定和保存菌種。2.液體培養(yǎng)基接種法可觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象或用作生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)3.半固體培養(yǎng)基接種法穿刺接種法，用于保存菌種或觀察細(xì)菌動(dòng)力工業(yè)微生物接種技術(shù)

4.平板劃線接種法目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長(zhǎng)，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌。方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本。連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本。工業(yè)微生物接種技術(shù)5.涂布接種法：用于分離、測(cè)定標(biāo)本中活菌數(shù)和藥敏實(shí)驗(yàn)細(xì)菌接種6.傾注培養(yǎng)法：用于活細(xì)菌計(jì)數(shù)。工業(yè)微生物接種技術(shù)是將需要的某種微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)，得到只含有一種微生物的培養(yǎng)物。是由一個(gè)單細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖得到的后代稱純培養(yǎng)。菌種的分離微生物的純培養(yǎng)

三、菌種的分離方法工業(yè)微生物接種技術(shù)

獲得純培養(yǎng)的方法：

平板劃線分離法12單細(xì)胞挑取法3組織分離法4選擇培養(yǎng)基分離5三、菌種的分離方法稀釋平板分離法工業(yè)微生物接種技術(shù)3、單細(xì)胞挑取法用顯微挑取器，從待分離材料中挑取一個(gè)細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)的方法。毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體，適于較大微生物顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子小液滴法：將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個(gè)細(xì)胞的液滴來(lái)進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。工業(yè)微生物接種技術(shù)4、組織分離法分離步驟⑴制作培養(yǎng)基并對(duì)培養(yǎng)基滅菌。⑵對(duì)組織塊進(jìn)行消毒處理：在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌刀片切取小塊受病組織，放入0.1%的升汞水中浸泡2-3min，再用無(wú)菌水沖洗數(shù)次。是用感病的生物體組織來(lái)分離微生物得到純培養(yǎng)物的方法。工業(yè)微生物接種技術(shù)⑶接種：把組織塊分割成小塊，放到平板培養(yǎng)基表面。每個(gè)平皿中放入3-5個(gè)小組織塊⑷培養(yǎng):適溫培養(yǎng)到組織塊周圍長(zhǎng)出單菌落⑸轉(zhuǎn)管純化：將需要的單菌落轉(zhuǎn)接到斜面試管培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后得到純培養(yǎng)物。此種方法適合于病原微生物的分離。工業(yè)微生物接種技術(shù)5.選擇培養(yǎng)分離法使待分離微生物生長(zhǎng)特征“突出”；抑制大多數(shù)其它微生物的生長(zhǎng)；使待分離微生物生長(zhǎng)更快。微生物群落中數(shù)量占少數(shù)的微生物得到分離純化：工業(yè)微生物接種技術(shù)顏色反應(yīng)：分離特定的菌株牛奶平板：分離蛋白酶產(chǎn)生菌使待分離微生物生長(zhǎng)特征“突出”工業(yè)微生物接種技術(shù)高溫下培養(yǎng)：分離嗜熱細(xì)菌培養(yǎng)基中不含N：分離固氮菌培養(yǎng)基加抗生素：分離抗性菌抑制大多數(shù)其它微生物的生長(zhǎng)工業(yè)微生物接種技術(shù)富集培養(yǎng):

利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，僅使待分離微生物旺盛生長(zhǎng)，在群落中的數(shù)量大大增加，從而更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。使待分離微生物生長(zhǎng)更快。工業(yè)微生物接種技術(shù)幾種分離方法的應(yīng)用范圍劃線：不需稀釋，簡(jiǎn)便，用于分離稀釋混合平板法：分離、活菌計(jì)數(shù)涂布平板法：分離，可得到比較多的單菌落，方便篩選。單細(xì)胞挑取法：高度專業(yè)選擇培養(yǎng)：分離生理類型特殊的微生物工業(yè)微生物接種技術(shù)工業(yè)生產(chǎn)中培養(yǎng)的菌種接入種子罐時(shí)，一般先制成菌懸液。常用的接種方法有壓差法、火焰封口法等。1.火焰封口法種子罐的接種口周圍設(shè)有溝槽，接種時(shí)先在溝槽里注入少量酒精，然后用火焰點(diǎn)燃酒精，使接種口被包圍在一堆火焰之中，接著將菌懸液倒入種子罐中即可。五、工業(yè)生產(chǎn)中的微生物接種工業(yè)微生物接種技術(shù)2、壓差法先用棉花球蘸消毒劑覆蓋在種子罐接種口的橡皮塞上，消毒5～10min，將連接在盛有菌懸液的容器上的接種針頭迅速插入接種口的橡皮小孔中，然后平衡種子罐與盛菌懸液的容器之間的壓力，接著降低種子罐的壓力，菌懸液就會(huì)注入到種子罐里。接種完后，再用消毒劑拭凈接種口的小孔。

工業(yè)生產(chǎn)中的微生物接種工業(yè)微生物接種技術(shù)工業(yè)微生物的培養(yǎng)方法工業(yè)微生物接種技術(shù)①?gòu)纳倭颗囵B(yǎng)→大規(guī)模培養(yǎng)②從淺層培養(yǎng)→厚層（固體制曲）或深層（液體攪拌）培養(yǎng)③從固體培養(yǎng)→液體培養(yǎng)④從靜止式液體培養(yǎng)→通氣攪拌式的液體培養(yǎng)⑤從單批培養(yǎng)→連續(xù)培養(yǎng)→多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)⑥從分散的微生物細(xì)胞→固定化的細(xì)胞集團(tuán)⑦從微生物細(xì)胞→動(dòng)、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)；⑧從野生型菌種→突變株、遺傳工程菌株；⑨從單菌發(fā)酵→多菌發(fā)酵；⑩從低密度培養(yǎng)→高密度培養(yǎng)；?從人工控制的發(fā)酵罐→到多傳感器、計(jì)算機(jī)在線控制的自動(dòng)化發(fā)酵罐等。微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展特點(diǎn)：工業(yè)微生物接種技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法（一）固體培養(yǎng)法（二）液體培養(yǎng)法好氧菌的固體培養(yǎng)厭氧菌的固體培養(yǎng)好氧菌的液體培養(yǎng)厭氧菌的液體培養(yǎng)工業(yè)微生物接種技術(shù)（一）實(shí)驗(yàn)室固體培養(yǎng)法1.好氧菌的固體培養(yǎng)試管斜面:形態(tài)觀察、菌種保藏平板:分離、活菌計(jì)數(shù)工業(yè)微生物接種技術(shù)克氏瓶工業(yè)微生物接種技術(shù)2.厭氧菌的固體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)厭氧菌特殊的培養(yǎng)裝置或器皿配制特殊的培養(yǎng)基六種營(yíng)養(yǎng)要素加入還原劑和氧化還原勢(shì)的指示劑工業(yè)微生物接種技術(shù)①高層瓊脂柱：培養(yǎng)基中加入還原劑，裝入試管中滅菌后，只有表層有一些溶解氧，越是深層，其氧化還原電位勢(shì)越低，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)。如韋榮氏管（Veillontube）：長(zhǎng)25cm，內(nèi)徑1cm，兩端可用橡皮塞封閉的玻璃管。工業(yè)微生物接種技術(shù)②厭氧培養(yǎng)皿：

Brewer皿：利用凹形皿蓋制造狹窄空間，加上還原性培養(yǎng)基達(dá)到厭氧環(huán)境。

Spray或Bray皿：利用焦性沒(méi)食子酸+NaOH反應(yīng)造成無(wú)氧環(huán)境。工業(yè)微生物接種技術(shù)③厭氧罐：

常規(guī)的不很嚴(yán)格的厭氧技術(shù)；對(duì)厭氧罐反復(fù)抽真空、灌氮?dú)?，剩余氧在鈀催化劑的催化下，與灌入混合氣體中的氫氣還原成水而除去，從而形成良好的無(wú)氧環(huán)境。

工業(yè)微生物接種技術(shù)④

Hungate滾管技術(shù)：嚴(yán)格厭氧技術(shù)利用除氧銅柱在350℃下與氧反應(yīng)來(lái)制備高純度氮，再用此高純度氮去驅(qū)除培養(yǎng)基配制、分裝過(guò)程中各種容器和小環(huán)境中的空氣，使培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌和貯存，以及接種、稀釋、培養(yǎng)、觀察、分離、移種和保藏等操作的全過(guò)程始終處于高度無(wú)氧的環(huán)境。從而保證了嚴(yán)格厭氧菌的存活。工業(yè)微生物接種技術(shù)⑤厭氧手套箱：嚴(yán)格厭氧條件箱內(nèi)始終充滿成分為N2：CO2：H2＝85：5：10（V/V）的氣體，并有鈀催化劑保證箱內(nèi)處于高度無(wú)氧狀態(tài)。通過(guò)塑料手套進(jìn)行操作，外界物體進(jìn)出通過(guò)交換室。

工業(yè)微生物接種技術(shù)（二）實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)法：好氧菌：確保培養(yǎng)液中含有較高的溶解氧濃度是關(guān)鍵。

試管液體培養(yǎng)；

三角瓶淺層液體培養(yǎng)：僅適用于兼性厭氧菌搖瓶培養(yǎng)：又稱振蕩培養(yǎng)；臺(tái)式發(fā)酵罐：幾升至幾十升，使用方便厭氧菌：放入?yún)捬豕藁騾捬跏痔紫渲?；培養(yǎng)基中加入巰基乙酸、半胱氨酸等有機(jī)還原劑。工業(yè)微生物接種技術(shù)

一般情況下（1.013×105Pa，20℃），氧在水中的溶解度僅為6.2mL／L（0.28mmol／L），這些氧只能保證氧化8.3mg（即0.046mmol／L）葡萄糖，僅相當(dāng)培養(yǎng)基中常用葡萄糖濃度的1‰。氧的供應(yīng)是好氧菌生長(zhǎng)、繁殖中的限制因子。工業(yè)微生物接種技術(shù)提高溶氧速率的具體措施：①淺層液體靜止培養(yǎng)；②利用往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床作搖瓶培養(yǎng)；③在發(fā)酵罐的底部通入加壓空氣，并用氣體分布器使其產(chǎn)生均勻、密集的微小氣泡；④對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行機(jī)械攪拌，并在發(fā)酵罐的壁上設(shè)置阻擋裝置等。工業(yè)微生物接種技術(shù)厭氧罐或厭氧手套箱液體培養(yǎng)厭氧菌不必提供額外的培養(yǎng)措施單獨(dú)放在有氧