(高清版)GBT 42821-2023 貝類包納米蟲病診斷方法

貝類包納米蟲病診斷方法Diagnosticmethodsforbonamiosisofmolluscs2023-08-06發(fā)布國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會I 12規(guī)范性引用文件 l3術(shù)語與定義 14縮略語 15試劑和材料 16器材和設備 27臨床癥狀 38采樣 39組織印片檢查 310組織病理檢查 311PCR檢測 412熒光PCR檢測 513綜合判定 6附錄A(規(guī)范性)組織印片、組織病理檢查及DNA提取相關溶液配制 7附錄B(資料性)貝類包納米蟲病 附錄C(資料性)目標擴增序列及引物、探針的位置 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國水產(chǎn)標準化技術(shù)委員會(SAC/TC156)歸口。本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學研究院、中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所、全國水產(chǎn)技術(shù)柏建山。1貝類包納米蟲病診斷方法1范圍本文件給出了貝類包納米蟲病(bonamiosis)診斷的縮略語、試劑和材料、器材和設備，描述了臨床本文件適用于牡蠣包納米蟲(Bonamiaostreae)和殺蠣包納米蟲(Bonamiaexitiosa)引起的貝類包納米蟲病的流行病學調(diào)查、診斷、檢疫和監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T18088出入境動物檢疫采樣GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求3術(shù)語與定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。bp:堿基對(basepair)Ct:擴增循環(huán)數(shù)(cyclethreshold)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:羧基熒光素(carboxyfluorescein)PCR:聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate)Taq:水生棲熱菌(Thermusaquaticus)TE:Tris鹽酸和EDTA緩沖溶液(EDTATris·HCl)Tris:三羥甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)5試劑和材料本文件中所有化學試劑，除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。25.5生理鹽水(0.9%):常溫保存。5.610×PCR緩沖液(無Mg2+):-20℃保存。5.13乙酸銨(10mol/L):按A.5.14酚/三氯甲烷/異戊醇混合液：配制比例25:24:1。5.15乙醇溶液(75%):按A.6配制。5.21引物BonF:5.22引物BonR:5'-CTGATCGTCT5.24引物BonqR:5'-CATAAGTTAG5.25探針BonqP:5'-FAM-TCTGGCCCGGCGATACTAGCACCC-Eclipse-3'(10μmol/L),-20℃5.27核酸染料：4℃保存。6器材和設備6.6勻漿研磨器。6.7冷凍高速離心機。6.8二級生物安全柜。36.9普通PCR儀。6.10熒光PCR儀。6.11水平電泳儀。6.12凝膠成像儀。6.13水浴鍋。6.14微量移液器。6.15電子天平。7臨床癥狀患病貝類雙殼閉合不全，嚴重時死亡，輕則無明顯癥狀，見附錄B。8采樣8.1采樣對象優(yōu)先采集2齡及以上瀕死的貝類。8.2采樣部位8.3采集數(shù)量臨床無癥狀貝類樣品每個批次采集150個以上，臨床有癥狀貝類樣品每個批次采集30個以上。進口貝類樣品的采樣數(shù)量應符合GB/T18088的規(guī)定。8.4保存及運送取樣應加貼標簽，標簽上清楚標明樣品編號、采樣時間、采樣地點、采樣人員和養(yǎng)殖背景，樣品應24h內(nèi)冷鏈送達實驗室，立即檢測或保存于一80℃冰箱待檢。9組織印片檢查將鰓或心臟組織用吸水紙吸去多余水分后，用鑷子將組織在載玻片上輕輕擠壓涂片，使其形成薄層膜，自然晾干，丙酮或甲醇固定1min,滴加姬姆薩染液4滴～5滴，染色5min～10min,流水沖洗，晾干后置于400倍～1000倍顯微鏡下觀察。9.2結(jié)果判定印片組織中發(fā)現(xiàn)蟲體判為陽性。蟲體呈球形或卵圓形，大小為2μm～5μm。蟲體細胞質(zhì)呈淺藍色，細胞核呈紅色。常見干血細胞內(nèi)，感染嚴重時，血細胞外也可觀察到蟲體。染色后蟲體形態(tài)見圖B.1和圖B.2。10組織病理檢查用戴維森氏固定液固定樣品，固定液與組織塊的體積比為(15:1)～(20:1),固定24h～48h。4按A.13的要求采用組織切片機制備石蠟切片，封片后置于400倍～1000倍顯微鏡下觀察。切片組織中發(fā)現(xiàn)蟲體即判為陽性。蟲體呈球形或卵圓形，大小為2μm～5μm。蟲體細胞質(zhì)呈淺藍色，細胞核呈紅色，常見于血細胞內(nèi)，感染嚴重時，血細胞外也可觀察到蟲體。染色后蟲體形態(tài)見圖B.3。11.1實驗室技術(shù)要求檢測實驗室的分區(qū)要求、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證應符合GB/T19495.2的規(guī)定。11.2.1.1利用電子天平稱取30mg～50mg組織樣品，置于0℃~4℃的生理鹽水(4℃冰箱預冷)中反復沖洗，濾紙吸干表面水分后置于勻漿研磨器中并加入0℃~4℃(4℃冰箱預冷)的生理鹽水，充分勻漿研磨。提取過程同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照。11.2.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K至終濃度100μg/mL,再加10%SDS至終濃度為1%(質(zhì)量分數(shù)),上下顛倒混勻后置于50℃水浴鍋中水浴3h,不時旋動。向勻漿液中按1:1體積比加入酚/三氯甲烷/異戊醇混合液(25:24:1),輕輕震蕩混勻5min,置于冷凍高速離心機中，12000r/min離心5min。11.2.1.4吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mL滅菌離心管中，加入等體積酚/三氯甲烷/異戊醇混合液，輕輕震蕩混勻5min,置于冷凍高速離心機中，12000r/min離心5min。11.2.1.5吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mL滅菌離心管中，加入100μL10mol/L乙酸銨，混勻后，再加入兩倍體積預冷無水乙醇(一20℃冰箱預冷)混勻，置于一20℃冰箱放置2h。11.2.1.6采用冷凍高速離心機12000r/min離心10min,沉淀DNA,傾去上清液。11.2.1.7向沉淀中加入75%乙醇溶液500μL,輕輕混勻后采用冷凍高速離心機12000r/min離心5min,傾去上清液，室溫晾干。11.2.1.9可采用同等抽提效果的其他方法或商品化DNA提取試劑盒。在二級生物安全柜中用微量移液器向PCR管內(nèi)加入10×PCR緩沖液(無Mg2+)2.5μL、MgCl?溶液(25mmol/L)2.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL、10μmol/L引物BonF和引物BonR各1.0μL、dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μL,加入模板DNA2.0μL,補充雙蒸水至25.0μL。利用普通PCR儀進行PCR擴增，設置擴增程序如下：94℃預變性5min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,35個循環(huán)；72℃延伸10min,4℃保溫。5GB/T42821—202311.2.4瓊脂糖電泳配制1%～2%的瓊脂糖凝膠并加入核酸染料，待膠凝固后置于含有1×電泳緩沖液的水平電泳儀中，取5μLPCR擴增產(chǎn)物與1μL6×上樣緩沖液混勻后加入加樣孔中，同時取5μLDNA分子質(zhì)量標準溶液加入加樣孔中，進行電泳，電泳結(jié)束，在凝膠成像儀下觀察。11.3結(jié)果判定11.3.1檢測成立的條件陽性對照在300bp處有擴增條帶，陰性對照300bp處無擴增條帶，空白對照無任何條帶，檢測有效。11.3.2PCR檢測結(jié)果判定若待檢樣品在300bp處無條帶，則判為PCR檢測核酸陰性。若待檢樣品在300bp處有條帶，則判為PCR檢測核酸陽性。11.3.3序列分析及包納米蟲種類鑒定對PCR檢測為核酸陽性的樣品PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果同參考序列比對分析(見附錄C中C.1、C.2),若序列中同時存在HaeⅡ和BglI兩個酶切位點(見C.1),可判定樣品為Bonamiaostreae核酸陽性。若序列中只存在HaeⅡ酶切位點(見C.2),則判定樣品為Bonamiaexitiosa核酸陽性。12熒光PCR檢測12.1實驗室技術(shù)要求檢測實驗室的分區(qū)要求、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證應符合GB/T19495.2的規(guī)定。12.2操作步驟按11.2.1規(guī)定執(zhí)行。在二級生物安全柜中用微量移液器向PCR管內(nèi)加入10×PCR緩沖液(無Mg2+)2.5μL、MgCl?溶1.0μL、10μmol/L探針BonqP0.5μL、dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μL,加入模板DNA2.0μL,補充雙利用熒光PCR儀進行熒光PCR擴增反應，設置擴增程序如下：95℃預變性4min;95℃變性15s,55℃退火30s,45個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光數(shù)據(jù)。12.3結(jié)果判定12.3.1檢測成立條件陽性對照Ct值≤35,且出現(xiàn)特異性擴增曲線；陰性對照無Ct值或者Ct值>40且無特異性擴增曲6GB/T42821—2023線，檢測有效，否則應重新進行檢測。12.3.2熒光PCR檢測結(jié)果判定若樣品Ct值≤35,則判定熒光PCR檢測核酸陽性。若樣品無擴增曲線或者Ct值>40,則判定熒光PCR檢測核酸陰性。若35<Ct≤40,判定為疑似，此時可調(diào)整模板濃度后對樣品重新進行熒光PCR檢測，如果樣品重復檢測時的Ct值≤40,則判定熒光PCR檢測核酸陽性；如果樣品重復檢測時無擴增曲線或者Ct值>40,則判為熒光PCR檢測核酸陰性(熒光PCR擴增序列及引物、探針的位置見C.3)。13綜合判定13.1疑似判定貝類組織通過組織印片檢查、組織病理檢查、PCR檢測、熒光PCR檢測，其中任一種檢測結(jié)果為陽性，則判定為疑似包納米蟲病。13.2確診判定13.2.1已知貝類包納米蟲病流行區(qū)內(nèi)的貝類樣品組織印片檢查和組織病理檢查一種或兩種方法檢測為陽性，且PCR檢測或者熒光PCR檢測為陽性的，則確診為貝類包納米蟲病。13.2.2已知貝類包納米蟲病流行區(qū)外的貝類樣品組織印片檢查和組織病理檢查一種或兩種方法檢測為陽性，且PCR檢測或者熒光PCR檢測為陽性的，需將樣品送至參考實驗室進行最后的確診。7(規(guī)范性)組織印片、組織病理檢查及DNA提取相關溶液配制A.1姬姆薩染液續(xù)研磨，最后加入甲醇，在56℃放置24h或者室溫放置3d～5d后即可使用。A.1.2工作液：取貯存液采用蒸餾水10倍稀釋即可，臨用時配制。A.2戴維森氏固定液海水335mL95%乙醇330mL37%甲醛220mL冰乙酸115mL蛋白酶K20mg溶解后分裝于1.5mL離心管中(0.25mL/管),-20℃下保存。水90mL加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.2,加水定容至100mL。室溫貯存。若溶液有結(jié)晶形成，用前加熱溶解即可。SDS微細晶粒易于擴散，稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作臺區(qū)和電子天平上乙酸銨77g加水定容至100mL,經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。4℃貯存。A.675%乙醇無水乙醇加水25mL,混勻，定容至A.7TE緩沖液(pH8.0)1mol/LTris·HCl(pH8.0)80.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至高壓蒸汽滅菌，4℃貯存。2mLA.850×電泳緩沖液冰乙酸0.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至室溫貯存。A.91×電泳緩沖液50×電泳緩沖液加水定容至室溫貯存。A.10蘇木精染液的配制方法蘇木精無水乙醇硫酸鋁鉀蒸餾水氧化汞冰乙酸分別用無水乙醇溶解蘇木精，蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，然后兩液混合并煮沸，加入氧化汞，繼續(xù)加熱和攪拌至溶液為深紫色，立即用冰水冷卻，恢復至室溫后過濾備用。選用水溶性伊紅。配方為：伊紅1g、70%～75%酒精100mL、伊紅用少許蒸餾水調(diào)成耀糊狀，再加入酒精，邊加邊攪拌，直至徹底溶解，此時試劑有些渾濁，取0.1mL冰乙酸，加入試劑中，試劑逐漸轉(zhuǎn)變A.12返藍液的配制取5mL氫氧化氨，加入1000mL蒸餾水中即可。A.13石蠟切片制備取材固定24h,修整組織塊，換固定液重新固定12h,自來水沖洗24h、70%乙醇1h、85%乙醇1h、95%乙醇45min2次，無水乙醇30min3次，二甲苯30min,二甲苯5min～20min2次，放入石蠟二甲苯10min2次，然后依次通過無水乙醇、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2min,再9通過蒸餾水3min后，蘇木精染色5min～20min,自來水洗3min,1%鹽酸酒精8s～15s,自來水洗3min后，返藍液2min～5min,自來水5min,蒸餾水5min,然后依次通過50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇各3min進行脫水，0.5%伊紅染液復染1min～2min,再依次通過95%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇各2min進行二次脫水，二甲苯透明2min2次，最后用封片樹膠封片。(資料性)貝類包納米蟲病B.1疾病描述包納米蟲病是由牡蠣包納米蟲(Bonamiaostreae)、殺蠣包納米蟲(Bonamiaexitiosa)等在宿主血細胞內(nèi)寄生或者游離在結(jié)締組織、鰓、內(nèi)臟或外套膜中而引起的水生動物的一種血液原蟲病，是嚴重危害世界貝類養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病，也是世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)規(guī)定的檢疫性貝類寄生蟲病。B.2病原現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的包納米蟲包括5個種，除主要寄生在歐洲平牡蠣(Ostreaedulis)體內(nèi)的牡蠣包納米蟲(Bonamiaostreae)外，還有寄生在悉尼巖牡蠣(Saccostreaglomerata)體內(nèi)的魯夫來包納米蟲(Bonamiaroughleyi)、歐洲平牡蠣(Ostreaedulis)體內(nèi)的殺蠣包納米蟲(Bonamiaexitiosa)、近江牡蠣(Crassostreaariakensis)體內(nèi)的成孢包納米蟲(Bonamiaperspora)、澳大利亞安加西牡蠣(Ostreaan-gasi)體內(nèi)的包納米蟲未定種(Bonamiasp.)。該病原的感染力較強，含有該病原的懸液具有傳染性，使其在寄主細胞內(nèi)定位接觸30min即可感染牡蠣，其中以顆粒血細胞中的病原感染力最強。造成廣泛危害的主要為牡蠣包納米蟲和殺蠣包納米蟲。B.3易感宿主易感宿主包括歐洲平牡蠣(Ostreaedulis)、安加西牡蠣(Ostreaangasi)、帕爾希牡蠣(Ostreapuel-chana)、智利牡蠣(Ostreachilensis)、近江牡蠣(Crassostreaariakensis)、智利鶉螺(Tiostreachilensis)等貝類。B.4臨床癥狀牡蠣感染包納米蟲病后通常表現(xiàn)為雙殼閉合不全，嚴重時出現(xiàn)鰓絲損傷或死亡，但該癥狀也可能由其他疫病引起，并不能通過癥狀來判定是否感染了包納米蟲病。輕癥則無明顯癥狀。B.5地理分布包納米蟲感染歐洲平牡蠣引起死亡的報道。近十幾年來，牡蠣包納米蟲病的流行趨于緩和，雖未出現(xiàn)重大的流行，但在美國、英國、愛爾蘭、加拿大等地時有發(fā)生，流行率從百分之零點幾到百分之三四十不等。我國目前尚未有水生動物包納米蟲病發(fā)生的報道。B.6組織印片檢查包納米蟲呈球形或卵圓形，蟲體大小為2μm～5μm,細胞核紅染，細胞質(zhì)藍染，多寄生在細胞內(nèi)。包納米蟲見圖B.1中箭頭所指位置。GB/T42821—2023圖B.1組織細胞內(nèi)的包納米蟲在顯微鏡下可觀察到蟲體寄生于血淋巴細胞內(nèi)，呈球形或卵圓形，大小為2μm～5μm,姬姆薩染色后，細胞核紅染，細胞質(zhì)藍染。包納米蟲見圖B.2中箭頭所指位置。圖B.2牡蠣血液中的包納米蟲B.8組織病理學檢查包納米蟲呈球形或卵圓形，蟲體大小為2μm～5μm,細胞核紅染，細胞質(zhì)藍染。包納米蟲見圖B.3中箭頭