黃曲霉毒素試劑盒說明書-

黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用說明書Ⅰ．樣品處理方法食品1、脂肪含量小的固體樣品〔如大米、玉米、小米等〕稱取5.0g樣品〔已粉碎〕于100ml具塞三角瓶中，準確加入25.0ml甲醇水〔1+1〕溶液，振搖15min，過濾，棄去1/4初濾液，收集試樣濾液，依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將濾液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量或限量測定。醬油、醋稱取5.0g樣品于25ml小燒杯中，用5ml蒸餾水將試樣轉移到125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經盛有約5g預先用三氯甲烷濕潤的無水Na2SO4過濾器于100ml蒸發(fā)皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重復振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入25.0ml甲醇水〔1+1〕，將蒸發(fā)皿中的凝結物充分溶解。依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將提取液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量或限量測定。食用油〔如菜油、麻油、色拉油、花生油等〕〔1+1〕溶液，加塞輕輕振搖5min，靜置分層，放出下層甲醇水提取液。依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將提取液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量或限量測定。4、葡萄酒準備稱取5.0g葡萄酒于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經盛有約5g預先用三氯甲烷濕潤的的無水Na2SO4過濾器于100ml蒸發(fā)皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重復振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入25.0ml甲醇水〔1+1〕，將蒸發(fā)皿中的凝結物充分溶解。依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將提取液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量或限量測定。5、啤酒、黃酒準確吸取5.0ml樣品于25ml容量瓶，準確加入12.5ml甲醇，再用蒸餾水定容至25ml。振搖10min，此即為待測樣品液。將待測樣品稀釋液進行定量或限量測定。假設結果為陽性，則采納葡萄酒中AFB1的提取方法進行測定。6、花生樣品去皮粉碎〔刀切或剪切〕，稱取5.0g于100ml具塞三角瓶中。加入25.0ml甲醇水〔1+1〕和20ml正乙烷〔或石油醚〕，振搖10min，過濾于分液漏斗中，靜置分層。放出下層提取液，依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將提取液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量過限量測定。7、月餅、桃酥、花生醬等稱取10.0g試樣于125ml具塞錐形瓶中，加入50.0ml甲醇水〔1+1〕提取液和20ml正乙烷〔或石油醚〕加塞震蕩15min，過濾，收集濾液于分液漏斗中，靜置分層。待下層甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一錐形瓶中。準備吸取10.0ml甲醇水提取液〔相當2.0g樣品〕于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經盛有約5g預先用三氯甲烷濕潤的無水Na2SO4過濾器于100ml蒸發(fā)皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重復振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入10.0ml甲醇水〔1+1〕，將蒸發(fā)皿中的凝結物充分溶解。依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將提取液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量或限量測定。8、面粉稱取10.0g面粉樣于100ml具塞三角瓶中，準確加入50.0ml甲醇水〔1+1〕溶液，震蕩15min,過濾，收集試樣濾液。準確吸取10.0ml濾液〔相當于2.0g樣品〕125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷層，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經盛有約5g預先用三氯甲烷濕潤的無水Na2SO4過濾器于100ml蒸發(fā)皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重復振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入10.0ml甲醇水〔1+1〕，將蒸發(fā)皿中的凝結物充分溶解。依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將提取液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量或限量測定。二、飼料1、一般飼料及原料稱取5.0g樣品于100ml具塞三角瓶中，準確加入25.0ml甲醇水〔1+1〕溶液，振蕩15min，過濾，棄去初濾液。收集濾液。依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將濾液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量或限量測定。2、飼料濃縮料稱取10.0g樣品于100ml具塞三角瓶中，準確加入50.0ml甲醇水〔1+1〕溶液，振蕩15min,過濾，收集試樣過濾。準備吸取10.0ml甲醇水提取液〔相當2.0g樣品〕于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經盛有約5g預先用三氯甲烷濕潤的無水Na2SO4過濾器于100ml蒸發(fā)皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重復振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入10.0ml甲醇水〔1+1〕，將蒸發(fā)皿中的凝結物充分溶解。依據(jù)樣品的國家同意量標準，用A試劑將提取液進行稀釋〔見表1：樣品稀釋表〕。將樣品稀釋液進行定量或限量測定。樣品稀釋表表1樣品稀釋表樣品同意量〔μg/kg〕樣品提取液〔ml〕A試劑〔ml〕樣品稀釋倍數(shù)〔D〕≤5直接量取01≤102≤153≤204≤306≤5010Ⅱ.黃曲霉毒素B1測試盒使用說明書〔定量檢測〕本測試盒利用固相酶聯(lián)免疫吸附〔ELISE〕原理，通過抗黃曲霉毒素B1抗體與酶標抗原、待測抗原的競爭免疫反應以及酶的催化顯色反應相結合來檢測AFB1，適用于食品、飼料及相關原料中AFB1的定量檢測，特點是靈敏度高，特異性好，操作簡便，結果易判讀。測試盒組成1、包被抗體的反應板：48/24/12孔2、A試劑：樣品稀釋液1瓶3、B試劑：AFB1標準溶液1套〔0.1，0.5，1.5，10ng/ml〕4、C試劑：酶標抗原2/1瓶5、D試劑：酶標抗原稀釋液1瓶6、E試劑：濃縮洗滌液1瓶7、F試劑：顯色底物液a1瓶8、G試劑：顯色底物液b1瓶9、H試劑：終止液1瓶10、反應板支架：1塊實驗準備樣品處理：詳見“Ⅰ.樣品處理方法〞試劑的配制=1\*GB2⑴每瓶C試劑中準確加入1.5mlD試劑，充分溶解，配成實驗用酶標抗原溶液，2-8℃儲存。=2\*GB2⑵E試劑用300ml蒸餾水配制成洗滌液。實驗步驟試劑平衡：將測試盒取出，放置15min以上，平衡至室溫。小孔編號：依據(jù)需要截取相當孔數(shù)放置反應板支架上。設定1號孔為儀器調零孔，2號孔為陰性孔，3-7號孔為AFB1標準對照孔，其余孔為樣品孔。洗滌：每孔加入250μl左右洗滌液，洗液不得溢出，放置1min后甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗板一次。4、反應物組成：按以下步驟所示，依次加入配制好的溶液及待測樣品稀釋液。第一步：1號孔和2號孔分別加入50μlA試劑，3-7號控分別加入系列濃度的B試劑〔0.1，0.5，1，5，10ng/ml〕50μl,其余孔分別加入相應的樣品稀釋液。第二步：1號孔加入50μlD試劑，其余各孔均加入50μlC試劑。第三步：輕輕地振搖，使各孔的反應物混勻。表2反應物組成表操作次序加入量孔號12345678910111212350μl50μlAA0.10.51510樣品稀釋液DCCCCCCCCCCC搖勻5、反應：將反應板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min。6、洗滌：取出反應板，用力甩掉反應液，拍手。每孔加入250μl左右洗滌液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗板4次。7、顯色：每孔分別加入顯色低物液a〔F試劑〕和顯色底物液b(G試劑)各50μl,搖勻，將反應板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色15min。8、終止與儀器測定：每孔分別加入終止液〔H試劑〕50μl，然后用酶測定儀〔或黃曲霉毒素B1專用測定儀〕在450nm波長處測定各孔的吸光度A值。9、定量測定：將濃度為0，0.1，1，5，10ng/ml的AFB1系列標準工作溶液，按上述實驗步驟測定相應的吸光度A值，并繪制成標準曲線〔見圖一〕。橫坐標為標準液濃度的常用對數(shù)值〔1gC〕，縱坐標為各標準液孔A值與標準液為0ng/ml的A值的比值〔A標準液/A〔0ng/ml〕〕。計算樣品孔A值與A(0ng/ml)(A樣品/A(0ng/ml))，查標準線，可得到相應樣品稀釋濃度〔C〕的常用對數(shù)值lgC，對其求反對數(shù)，可求得樣品稀釋液的AFB1濃度C。按以下公式計算出樣品中AFB1的含量：AFB1含量〔ng/g〕=C×(V/M)×D式中：C:稀釋后樣品提取液中AFB1含量〔ng/ml〕V:樣品提取液體積〔ml〕M:樣品質量〔g〕D:樣品稀釋倍數(shù)四、測試盒貯存1、2-8℃貯存，忌0℃以下凍存。2、有效期6個月。五、樣品同意量標準請參閱〔GB2671-81，GB8381-87〕六、批號：見測試盒Ⅲ.黃曲霉毒素B1測試盒使用說明書〔限量檢測〕測試盒組成包被抗體的反應板：48/24/12孔A試劑：樣品稀釋液1瓶B試劑：AFB1標準溶液1瓶C試劑：酶標抗原2/1瓶D試劑：酶標抗原稀釋液1瓶E試劑：濃縮洗滌液1瓶F試劑：顯色底物液a1瓶G試劑：顯色底物液b1瓶H試劑：終止液1瓶反應板支架：1塊實驗準備樣品處理：祥見“Ⅰ.樣品處理方法〞試劑的配制每瓶C試劑中準確加入1.5ml試劑，充分溶解，配成實驗用酶標抗原溶液，2-8℃儲存。E試劑用300ml蒸餾水配制成洗滌液。實驗步驟試劑平衡：將測試盒取出，放置15min以上，平衡至室溫。小孔編號：依據(jù)需要截取相當孔數(shù)放置反應板支架上。設定1號孔為儀器調零孔，2號孔為陰性對照孔，3號孔為陽性對照孔，其余孔為樣品孔。洗滌：每孔加入250μl左右洗滌液，洗液不得溢出，放置1min后，甩掉洗液，在吸水紙上拍干，重復洗板一次。4、反應物組成：按以下步驟所示，依次加入配制好的溶液及待測樣品稀釋液。第1步：1號孔和2號孔分別加入50μlA試劑，3號孔加入50μlB試劑，其余孔加入相應的樣品稀釋液。第2步：1號孔加入50μlD試劑，其余各孔均加入50μlC試劑。第3步：輕輕地振搖，使各孔中的反應物混勻。表3反應物組成表操作次序加入量孔號12345678910111212350μl50μllAAB….………樣品稀釋液……..DCCCCCCCCCCC搖勻5、反應：將反應板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min。6、洗滌：取出反應板，用力甩掉反應液，拍干。每孔加入250μl左右洗滌液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗板4次。7、顯色：每孔分別加入顯色低物液a〔F試劑〕和顯色底物液b(G試劑)各50μl,搖勻，將反應板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色15min，目視法測定?！沧ⅲ嚎蛇m當延長顯色時間，使顏色加深，以利目視?！?、限量推斷目視法測定：先比較1-3號孔顏色。假設2號孔〔陰性孔〕顏色最深，3號孔〔陽性孔〕次之，1號孔〔空白孔〕接近無色，說明試劑有效及操作無誤。比較樣品孔與3號孔〔陽性孔〕顏色，假設淺者，則為陽性，假設深者，則為陰性，假設顏色接近，則用儀器法或國標法驗證。儀器法測定：每孔分別加入終止液〔H試劑〕50μl,然后用酶測定儀〔或黃曲霉素B1專用測定儀〕在450nm波長處測定各孔的吸光度A值，假設A樣品孔〈A陽性孔為陽性，假設A樣品孔≥A陽性孔為陰性.假設樣品顯陽性,則其AFB1含量可推斷為:AFB1含量(ng/g)＞l.0ng/ml×(V/M×D)V:樣品提取液體積〔ml〕M:樣品質量〔g〕D:樣品稀釋倍數(shù)四、測試盒貯存1、2-8℃貯存，忌0℃以下凍存。2、有效期6個月。五、樣品同意量標準請參閱〔GB2671-81，GB8381-87〕六、批號：見測試盒Ⅳ.實驗操作流程圖及注意事項實驗操作流程圖適當稀釋加樣37℃，30min樣品提取———→試劑準備———→免疫反應————→37℃，15min目測、儀器測量顯色反應————→結果判定—————→計算含量注意事項洗滌時要迅速，洗滌液不可溢出，以防交叉污染；加樣時要準確，直接加到小孔底部，不可有氣泡，不要加到孔壁上；試劑使用前搖勻；整個加樣過程要快，確保前后反應時間一致；加樣后要輕請震搖整板，使反應液混勻；每次洗滌要先用力甩干后再拍干，最后要擦干板底，以利于儀器檢測；不同批次測試盒的試劑不能混用；每次測試時應盡量使用新配制的洗滌液；雖AFB1標準濃度很低，但是嚴格規(guī)范的實驗操作不可忽視，凡接觸到標樣的器皿都要用5%NaCIO浸泡半天后再清洗備用。Ⅴ.主要技術指標及參數(shù)測試盒分三種規(guī)格：12孔、24孔、48孔。反應孔可拆卸，可測單份樣品，亦可測多份樣品，定量測定每次需要6個標準孔，假設半定量測定只需3個標準孔。測試盒的主要技術指標及參數(shù)：最低檢出濃度：0.1ng/ml;回收率：87%-95%；交叉反應系數(shù)：0-0.21；檢測范圍：0.1-10ng/ml;重復性：條內＜10%，條間＜15%。Ⅵ.實驗室基本配置酶標儀〔內置450nm濾光片〕或黃曲霉素B1專用測定儀50ul微量移液器及配套吸頭恒溫培養(yǎng)箱〔0℃-50℃〕冰箱〔4℃-8℃〕玻璃器皿：錐形瓶，燒杯，分液漏斗，蒸發(fā)皿。量筒，具塞試管，滴管，移液管等小型粉碎機或碾缽其他：濾紙，吸水紙等Ⅶ.相關文獻飼料中黃曲霉毒素B1的測定方法〔GB/T17480-1998〕食品中黃曲霉毒素B1的測定方法〔GB/T5009.22-1996〕，食品衛(wèi)生標準使用手冊理化檢驗方法[M]，1998〔第一輯〕；137-161。國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局。關于印發(fā)小麥粉等5類食品生產許可證實施細則的通知。國質檢監(jiān)[2002]192號[J].糧食與飼料工業(yè)，1994，10：41-43.[J].中