植物源性產(chǎn)品物種鑒別方法 Sanger測序法

1植物源性產(chǎn)品物種鑒別基因條碼技術(shù)Sanger測序法驗步驟、質(zhì)量控制、結(jié)果判定與表述、檢驗過程中防止交叉感染的措本文件適用于植物源性食品、農(nóng)產(chǎn)品、化妝品、中藥材等產(chǎn)品的植物物種定性檢凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格GB/T27403-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生3.1指生物體一段公認(rèn)的能夠代表該物種的標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DN23.2用于基因測序的雙脫氧鏈末端終止法,在鏈延伸過程中利用熒光標(biāo)記雙脫氧堿基隨機(jī)阻斷，產(chǎn)生以3.3采用基因測序技術(shù)對物種的基因條碼進(jìn)行識別，利用其種內(nèi)特異性和種間多樣性實現(xiàn)對物種的快3.44縮略語BOLD：生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（TheBarcodeofLifeDataSystem）bp：堿基對（Basepair）CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（CetyltrithylammoniumDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacdNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleosidetriphosphddNTP：雙脫氧核糖核苷三磷酸（DideoxyribonucleosidetriphosphEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticNCBI：美國國立生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）36.3分子量標(biāo)準(zhǔn)品（最小片段≥20bp，最6.4瓊脂糖。6.7異丙醇。6.11無菌雙蒸水。47.2凝膠成像儀。7.5核酸蛋白分析儀。7.7組織研磨器。7.8渦旋混勻儀。8.2制備59檢驗步驟9.2DNA提?。?.3DNA濃度和純度的測定使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和度按照式（1）計算，每個樣品重復(fù)測三次，取平均值。通過A260/A280比值判斷提取出的DNA的純度。若A260/A280值在1.7～2.1之間，說明DNA純度較高。C——DNA濃度，單位為微克每微升(μg/μLA——260nm處的吸光值；9.4PCR擴(kuò)增9.4.2反應(yīng)體系采用TaqDNA聚合酶擴(kuò)增，酶及擴(kuò)增體系見附錄C9.4.3反應(yīng)參數(shù)69.5克隆純化（適用于多組分和未知樣品）9.6測序9.7序列分析7使用序列拼接軟件對雙向序列進(jìn)行拼接，去除標(biāo)簽序列和低質(zhì)量區(qū)。將拼接后的序列在BOLD或NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，根據(jù)相似度判定物種。注1：BOLD網(wǎng)址：http://www.boldsys注3：使用BOLD具體步驟：BOLD數(shù)據(jù)庫→點擊“鑒別”（IdentiIdentification）→選擇數(shù)據(jù)庫（SearchDatabases建議選擇AllBarcodeRecordsonBOLD）→粘貼fa使用NCBI數(shù)據(jù)庫具體步驟：NCBI數(shù)據(jù)庫→選擇“BLAST”檢索（BLAST）→選擇“核酸比對”10.1總體要求2)psbA基因條碼片段電泳長度450bp左右3)ITS基因條碼片段電泳長度500bp左右；810.4.3psbA基因條碼片段經(jīng)雙向序列拼接后，保證測序峰圖的長度≥300bp。10.4.5matK基因條碼片段經(jīng)雙向序列拼接后，保證11.1結(jié)果判定——樣品序列與數(shù)據(jù)庫相似度≥95%，檢測結(jié)果為相似度最高的物種。在樣品序列與數(shù)據(jù)庫相似度≥95%，為相似度最高的物種時，其檢測的結(jié)果應(yīng)表述為樣品中含有xx9F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGCAGCATTCCGAR:CAGGAAACAGCTATGACAGTAAACATGTTAGTpsbA-trnH-fwdF:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATGCATGAACGTAATGpsbApsbA-trnH-revR:CAGGAAACAGCTATGACCGCGCATGGTGGATTCITS-2FF:TGTAAAACGACGGCCAGTATGCGATACTTGGTGTITSITS-3RR:CAGGAAACAGCTATGACGACGCTTCTCCAGACTACmatK3F-KIMF:TGTAAAACGACGGCCAGTCGTACAGTACTTTTGTGTTTmatKR:CAGGAAACAGCTATGACACCCAGTCCATCTGGAAATCTT引物序列5’–3’M13R(-27)C1MaluspumilaMill.2梨PyrusL.3CrataeguspinnatifidaRubuscorchorifoliusL.f.4Eriobotryajaponica(Thunb.)MorusalbaL.5RibesnigrumL.67棗ZiziphusjujubaMill.PunicagranatumL.89DimocarpuslonganLour.FragariaananassaDuch.Duchesneaindica(Andr.)F桃AmygdaluspersicaL.MusananaLour.杏ArmeniacavulgarisLam.AnanascomosusCerasuspseudocerasus(Lindl.)表B.2植物基因條碼可鑒別的藥食同源17Panaxnotoginseng2Liliummartagon8Paeonialactiflora3Sesamumindicum94Prunussibirica5LyciumchinenseLeonurusjaponicus6Lyciumchinensevoucher7Poriacocos(Fr.)Wolf.Rheumofficinale8EuryaleferoxAngelicasinensis9DioscoreapersimilisLigusticumsinenseAngelicadahuricaAtractylodes1PuerariamontanaBletillastriata2ZiziphusjujubaAmpelopsisjaponica3LiriopespicataVincetoxicumatratum4AstragalusRosarugosa5SophoraflavescensPapaversomniferumL.6Panaxginseng11Anacardiumoccidentale2Avenasativa2Juglansnigra3344Arachishypogaea55HelianthusannuusL.6Extract-N-AmpPCRreactionmix（PCR聚~100ng/μL），用無菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25μL。1)Extract-N-AmpTMBloodPCRkit和Extract-N-AmpPCRreactionmi?SVGelandPCRClean-UpSystem)2為例。XmL的膜結(jié)合液（即：若凝膠的重量為0.2g，則加入膜結(jié)合液0.2mL)；置于50°C~65°C溫浴104）重復(fù)加入700μL膜洗脫液，室溫下，14000g離心5min，棄濾出液；14000g再次離心1min2)Wizard?SVGelandPCRClea本方法適用于多組分和未知樣品克隆純化，及所有樣品D.2.2LB：大腸桿菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Lur5×T4DNA連接反應(yīng)緩沖