鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究

摘

要：目的：對鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行研究。方法：采用鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗、干擾試驗和對比試驗，與家兔熱原檢查法的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液用稀釋劑稀釋4倍后，可使用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，與家兔熱原檢查法結(jié)果一致。結(jié)論：鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液（規(guī)格100mL/瓶：鹽酸尼卡地平10mg、氯化鈉0.9g）用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代熱原檢查法是可行的。關(guān)鍵詞：鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素；檢查法；干擾試驗；復(fù)核試驗

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引言鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液為血管擴(kuò)張藥物，臨床上主要用于不宜或無法口服治療的高血壓病人的短期治療。該藥品為鈣通道阻滯劑，可抑制心肌與血管平滑肌的跨膜鈣離子內(nèi)流而不改變血鈣濃度。該藥品還具有高度的血管選擇性，對血管平滑肌的鈣離子拮抗作用強(qiáng)于對心肌的拮抗作用。在動物實驗中，該藥品可擴(kuò)張冠狀血管平滑肌。鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液。該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項目有：pH值、顏色、有關(guān)物質(zhì)、重金屬、熱原、不溶性微粒、裝量、可見異物、無菌等。其中，熱原項目的檢查使用實驗動物家兔做實驗，系將一定劑量的供試品溶液靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。該檢查方法所用家兔的飼養(yǎng)時間長，操作繁瑣，實驗結(jié)果受家兔的個體差異影響較大。而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有簡便、靈敏、快速、準(zhǔn)確等特點，已被廣泛用于藥品注射劑及其原料藥和臨床醫(yī)療器械中的致熱物質(zhì)檢查。本研究旨在對鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗，并將試驗結(jié)果與熱原檢查法的結(jié)果進(jìn)行對比。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠限度法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。按2015版《中國藥典》四部的要求，在供試品檢測時，可使用上述其中任何一種方法進(jìn)行試驗。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗結(jié)果為準(zhǔn)。為探討采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液熱原的可行性，筆者按實驗方案進(jìn)行了鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗、干擾試驗和對比試驗。

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儀器與材料1.1

儀器XW-80A旋渦混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；TAL-40型恒溫試管儀，湛江安度斯生物有限公司。1.2

材料鱟試劑（批號16051012、16050712，標(biāo)示靈敏度0.125EU/mL）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號160924，規(guī)格10EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號17031202，規(guī)格2mL/支）；鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液（規(guī)格100mL/瓶）：鹽酸尼卡地平10mg、氯化鈉0.9g；家兔（新西蘭兔）。

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方法與結(jié)果2.1

鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗按照2015版《中國藥典》四部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法要求，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在漩渦混合器上混合15min，然后制備成0.25EU/mL、0.125EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一次均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30s，再進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗，結(jié)果如表1所示。表1結(jié)果表明，本研究所用鱟試劑標(biāo)示靈敏度λ為0.125EU/mL，測得靈敏度λc為0.125EU/mL，λc/λ＝1。按照藥典規(guī)定，當(dāng)λc為0.5～2.0λ（包括0.5λ或2.0λ）時，可以用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.2

供試品內(nèi)毒素理論限值的確定鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液的內(nèi)毒素理論限值計算公式：L≤K/M式中

L——鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液的內(nèi)毒素理論限值，EU/mL；K——人用每公斤體重每小時可接受的最大內(nèi)毒素劑量，EU/kg·h，一般注射劑K＝5EU/kg·h；M——人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，mL/kg·h，人均體重按60kg計算。鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液的最大用量為75mL/h，計算得本品內(nèi)毒素理論限值為4.0EU/mL。通常大容量注射劑（≥100mL）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的內(nèi)毒素限值為0.5EU/mL，本著標(biāo)準(zhǔn)從嚴(yán)要求，且參考2015版《中國藥典》二部類似品種鹽酸尼卡地平葡萄糖注射液（規(guī)格100mL/瓶：鹽酸尼卡地平10mg、葡萄糖5.5g）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：取本品，依法檢查（通則1143），每1mL中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5EU。因此，本次研究目標(biāo)確定鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液的內(nèi)毒素理論限值為0.5EU/mL。2.3

干擾試驗鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液的最大有效稀釋倍數(shù)計算公式：MVD＝CL／λ式中

L——供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；C——供試品溶液的濃度；λ——在凝膠限度法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，EU/mL。當(dāng)L以EU/mL為單位時，則C等于1.0mol/mL；當(dāng)L以EU/mg或EU/U為單位時，C的單位為mg/mL或U/mL。通過上述公式，可以計算出鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液的最大有效稀釋倍數(shù)為4倍。取熱原符合規(guī)定的鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液3批（批號：2016070761、2016070762、2016070861），用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋4倍后，將用來溶解細(xì)菌內(nèi)毒素的工作標(biāo)準(zhǔn)品與用水配制的相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素溶液，同時與2個批號的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗，結(jié)果如表2、表3所示。表2、表3結(jié)果表明，B系列溶液的結(jié)果呈陰性，表明鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液用水稀釋4倍后對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有干擾。在查閱相關(guān)資料的基礎(chǔ)上，筆者改用硼砂-氯化鈣緩沖液（pH=8.0）對鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液進(jìn)行4倍稀釋，干擾試驗的結(jié)果如表4、表5所示。表4、表5結(jié)果表明，溶液A和陰性對照D的所有平行管均為陰性，且C系列的結(jié)果與鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果一致，說明試驗結(jié)果有效。B系列溶液的結(jié)果與鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果一致，表明更換稀釋劑稀釋4倍后，鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法無干擾作用。2.4

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與家兔熱原法對比試驗根據(jù)上述干擾試驗結(jié)果和鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液的內(nèi)毒素限值，筆者對10個批次的鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和家兔熱原法的對比試驗，結(jié)果如表6所示。將鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液用硼砂-氯化鈣緩沖液（pH=8.0）稀釋4倍后，采用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑進(jìn)行檢測，標(biāo)準(zhǔn)限度按“每1mL鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.50EU”判定，結(jié)果顯示細(xì)菌內(nèi)毒素檢查全部為陰性，家兔熱原法檢查也全部合格，兩種檢查方法結(jié)果一致。3

結(jié)語本研究證實，鱟試劑靈敏度試驗表明，試驗所用鱟試劑符合規(guī)定要求。干擾試驗表明，用水稀釋鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液4倍，對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法有干擾，更換稀釋劑后，將鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液用硼砂-氯化鈣緩沖液（pH=8.0）稀釋至4倍時，采用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑進(jìn)行檢測，標(biāo)準(zhǔn)限度按“每1mL鹽酸尼卡地平氯化鈉注射液中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.50EU”判定，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果全部為陰性，家兔熱原