枯草芽孢桿菌在生物菌肥中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌在生物菌肥中的應(yīng)用枯草芽孢桿菌在生物菌肥中的應(yīng)用山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)術(shù)論文PAGE20PAGE19枯草芽孢桿菌在生物菌肥中的應(yīng)用作者：2007級(jí)生物工程4班陳聰指導(dǎo)教師：馬傳營技術(shù)員摘要：介紹了生物菌肥的種類和特點(diǎn)，分析了菌肥在提高土壤肥力、協(xié)助營養(yǎng)吸收、促進(jìn)礦質(zhì)營養(yǎng)釋放、改善品質(zhì)及增產(chǎn)和減少病蟲害等方面的作用。分析了生物菌肥相對(duì)于化肥的優(yōu)勢(shì)以及國內(nèi)外對(duì)生物菌肥的研究情況，并對(duì)其發(fā)展進(jìn)行了展望?？莶菅挎邨U菌作為一種具有研究、應(yīng)用和商業(yè)價(jià)值的微生物菌種在生物菌肥的研究中起到了重要作用，近年來國內(nèi)外對(duì)枯草芽孢桿菌的研究應(yīng)用有了很大的進(jìn)展，利用其對(duì)玉米小斑病菌的拮抗作用可研發(fā)生產(chǎn)有效防治玉米小斑病的生物菌劑。關(guān)鍵詞：生物菌肥；枯草芽孢桿菌；玉米小斑病菌；拮抗作用；生物防治TheapplicationofBacillussubtilisinbio-fertilizerAbstract:Describesthetypesandcharacteristicsofbio-fertilizer,analysesthefunctionoffertilizertoimprovesoilfertility,helpnutrientabsorption,promotethereleaseofmineralnutrients,improvecropquality,increasecropproductionandreducepestsanddiseasesetc.AnalysestheadvantagesofthebiologicalfertilizercomparedtothechemicalfertilizersandtheresearchsituationinChinaandabroad,alsodiscusseditsdevelopmentinthefuture.Bacillussubtilisasakindofmicrobialstrainshasplayedanimportantroleinthestudyofbio-fertilizerbecauseofitsresearch,applicationandcommercialvalue,inrecentyears，theresearchandapplicationofBacillussubtilisinChinaandabroadhasgainedagreatprogress,usingitsantagonisticmechanismonBipolarismaydiscanproducenewbiologicalagentstoeffectivelypreventthesouthernleafblightofcorn.Keywords:bio-fertilizer;Bacillussubtilis;Bipolarismaydis;Antagonism;BiologicalControl1引言1.1生物菌肥的發(fā)展長期以來，由于我國在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量使用化學(xué)肥料，使得所施肥料的利用率低，致使土壤板結(jié)、土壤微生物區(qū)系發(fā)生變化、食品質(zhì)量不安全，還造成大量的經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境惡化等一系列的社會(huì)問題，由于化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，使病蟲產(chǎn)生了抗藥性，化肥農(nóng)藥的殘留嚴(yán)重危害了人類健康。在當(dāng)前農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的形勢(shì)下，開辟微生物肥料部分替代化肥日益受到重視[1]。生物菌肥是近年來發(fā)展起來的一種新型肥料，它是一種多元素肥料，主要由固氮菌、解鉀菌及多種微量元素和腐殖酸組成。由于含有大量的微生物，生物菌肥主要以微生物生命活動(dòng)的產(chǎn)物來活化土壤，改善作物營養(yǎng)條件和生長環(huán)境，另外，生物菌肥還具有改良土壤、抗旱、培肥地力、促早熟、抵抗病蟲害等功效，還能解決土壤化肥農(nóng)藥殘留等問題，從而發(fā)揮土壤的潛在肥力，提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種。是一種好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌，表1我國已注冊(cè)的枯草芽孢桿菌菌劑產(chǎn)品[8]Table1BacillussubtilisbacteriumagentproductsregisteredinChina產(chǎn)品名公司有效成分劑型主要防治對(duì)象文曲寧江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保研究所B.subtilisB916+井岡霉素水劑水稻紋枯病、稻曲病百抗云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)和云南星耀生物制品廠B.subtilisB908可濕性粉劑水稻紋枯病，三七、煙草、花卉、小麥、白菜等土傳病害臺(tái)灣寶光華化工股份有限公司B.subtilis可濕性粉劑白粉病、灰斑病、炭疽病等疾病麥豐靈南京農(nóng)業(yè)大學(xué)B.subtilisB3粉劑小麥紋枯病亞寶香港經(jīng)綸全汛有限公司B.subtilis可濕性粉劑水稻紋枯病、稻瘟病、甘藍(lán)黑斑病枯草芽孢桿菌BS-208殺菌劑武漢天惠生物有限公司B.subtilisBs-208可濕性粉劑，水劑黃瓜白粉病、草莓白粉病和灰霉病、番茄灰霉病、棉花黃萎病、枯萎病和立枯病等增產(chǎn)劑中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生態(tài)工程研究所與上海農(nóng)樂生物工程為制品廠Bacillus.spp可濕性粉劑，水劑活體微生物生長調(diào)節(jié)劑，對(duì)作物具有壯苗、抗病及增產(chǎn)作用威綠達(dá)浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所B.subtilis+綠色木霉+毛殼酶菌肥有效防治猝倒病、根瘤病、立枯病、枯萎病等病害，促進(jìn)作物生長，增加作物產(chǎn)量1.4.3二十世紀(jì)四十年代，枯草芽孢桿菌被證明具有防止植物病害的作用。自此之后，對(duì)枯草芽孢桿菌的研究成為各國的研究熱點(diǎn)?？莶菅挎邨U菌可以防治水稻等作物的多種土傳真菌病害、豌豆根腐病等。迄今為止，已有多種枯草芽孢桿菌制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，例如由美國研發(fā)并登記注冊(cè)的殺菌劑Serenade和SouataAS,可防治蔬菜水果灰霉病、白粉病等真菌和細(xì)菌病害。韓國研制的殺菌劑Mildewide,主要防治霜霉病、白粉病等真菌病害。俄羅斯開發(fā)的可濕性粉劑Alifine-B,主要防治做種作物真菌病害。迄今為止美國己有4株枯草芽抱桿菌(B1subtilis)生防菌株(QST713、MB1600、GB03和FZB24)得到了美國環(huán)保署(EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可。QST713為美國AgraQuest公司開發(fā)出來的活菌制劑,商品名Serenade,不僅通過美國環(huán)保局(EPA)的登記而且還得到食用作物病害應(yīng)用的審批和認(rèn)可,通過葉面施用能防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃多種作物的白粉病、爛根病、霜霉病、疫病、灰霉病等細(xì)菌和真菌引起的病害[9]。下表2詳細(xì)列出了近年來世界各國研發(fā)的主要枯草芽孢桿菌制劑。表2美國已注冊(cè)的防治植物病害的枯草芽孢桿菌生物制劑Table2SelectedB.subtilis-basedplantdiseasebio-controlproductsinAmerican[10]ProductnameCompanyBacilluscomponentFormulationtypePrimarytargetSerenadeAgraQuest.Davis.CAB.subtilisQST713WP.aqueoussuspensionFungi.bacteriaonmultiplevegetable,fruitsEcoGuardNovozmew.Salem.VAB.lichoniformisSB3086HowableSclerotiniahomoeocarpaonturfKodiakGustafson.Plano.TXB.subtilisGB03WP(Conc.)floeableFungi.oncotton.large-seededlegumes.soybeansYieldshieldGustafsonB.pumillusGB34WP(Conc.)FungiinsoybeansBioYieldGustafsonB.amyloliquefaciensGB99+B.subtilisGB122DryflakeFungionbeddingplantsinpottingmixesSubtilexMicrobioLtdB.subtilisMBI600WP(Conc.)Fungioncotton,large-seededlegumes,soybeansHiStickL+SubtilexBekerUnderwoodB.subtilisBI600+rhizobiumFlowableFungionsoybeans,peanuts1.5枯草芽孢桿菌的研發(fā)存在的問題盡管在枯草芽孢桿菌生物菌劑研究中已經(jīng)取得了相當(dāng)矚目的成就，但仍然存在著一些迫于解決的問題?？莶菅挎邨U菌作為一種生防微生物，在對(duì)農(nóng)作物施用過程中易受到土壤PH、溫度、土壤微環(huán)境及作物生長狀況等因素的影響，從而使得生物防治效果不穩(wěn)定，還不能夠適用于大范圍的作物施用。大多數(shù)的枯草芽孢桿菌制劑還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，沒有進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用。1.5.1在衡量農(nóng)藥產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)中，只把側(cè)重點(diǎn)放在藥效上而忽略了有害雜質(zhì)的含量，沒有明確要求對(duì)對(duì)有害雜質(zhì)進(jìn)行限量導(dǎo)致一些農(nóng)藥產(chǎn)品產(chǎn)生副作用。2004年國家工商總局組織遼寧地區(qū)市場(chǎng)抽查，共抽查了38個(gè)經(jīng)銷單位的60個(gè)產(chǎn)點(diǎn)，殺菌劑的合格率僅為3.7%[11]?，F(xiàn)在國內(nèi)沒有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來衡量枯草芽孢桿菌的有效成分，有些以有效殺菌成分為標(biāo)準(zhǔn)，有些以活芽孢數(shù)位標(biāo)準(zhǔn)，而且國家統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行有效殺菌成分的檢測(cè)。1.5.2生產(chǎn)成本在枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中分泌的有效殺菌物質(zhì)較低，而且在生產(chǎn)發(fā)酵過程中容易感染雜菌，種種因素使得發(fā)酵操作要求的成本過高，研究開發(fā)一種新產(chǎn)品所花費(fèi)的時(shí)間較長，應(yīng)用于農(nóng)作物后效果不明顯，防治對(duì)象單一等等問題都提高了生產(chǎn)成本。1.5.3枯草芽孢桿菌菌劑從實(shí)驗(yàn)室研發(fā)到走向田間是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要問題是菌劑的貨架儲(chǔ)存期短。另外，關(guān)于枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)理論研究不夠多，在實(shí)際應(yīng)用過程中，往往要考慮多方面的因素，而不單單是菌劑的作用機(jī)理，例如，土壤的溫度、濕度、pH等都可能對(duì)枯草芽孢桿菌的活性造成影響，從而使枯草芽孢桿菌活性降低或者使其產(chǎn)生的有效殺菌物質(zhì)降解，因此防治效果不理想。另外，由于菌劑的價(jià)格問題，使得許多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者不會(huì)選擇這類制劑。1.6立題依據(jù)玉米小斑病是由Bipolarismaydis所引起的一種真菌病害，是甜玉米生育期的常發(fā)性病害。病菌以菌絲和分生孢子在病株殘?bào)w上越冬，第二年產(chǎn)生分生孢子，成為初次侵染源。分生孢子靠風(fēng)力和雨水的飛濺傳播，在田間形成再次侵染。其發(fā)病輕重，和品種、氣候、菌源量、栽培條件等密切相關(guān)。一般，抗病力弱的品種，生長期中露日多、露期長、露溫高、田間悶熱潮濕以及地勢(shì)低洼、施肥不足等情況下，發(fā)病較重。近年來隨著種植面積的逐年擴(kuò)大和感病品種的擴(kuò)種，發(fā)病有加重趨勢(shì)，已成為甜玉米的嚴(yán)重病害之一。目前生產(chǎn)上用于防治玉米小斑病的化學(xué)試劑主要是常用的殺菌劑，玉米小斑病主要用40%克瘟散，50%多菌靈，75%代森錳鋅等藥劑500-800倍進(jìn)行頁面噴霧防治[12]。但效果不是很理想，由于枯草芽孢桿菌對(duì)玉米小斑病菌的生長具有抑制作用，因此探討玉米小斑病的生物防治具有重要意義。2.材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料與器材2.1.1實(shí)驗(yàn)材料蔗糖，馬鈴薯，麥芽糖，酵母膏，瓊脂，燕麥片，胰蛋白胨，牛肉膏，硫酸銨，K2HPO4,5%孔雀綠溶液，0.05%堿性復(fù)紅溶液，香柏油，擦鏡液，無菌水2.1.2實(shí)驗(yàn)菌種枯草芽孢桿菌A16（BacillussubtilisA16）玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器顯微鏡，酒精燈，載玻片，蓋玻片，吸水紙，膠頭滴管，試管，試管夾，培養(yǎng)皿，三角瓶，燒杯，控溫?fù)u床，移液槍，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平，PH測(cè)試儀，接種環(huán)，直尺，無菌操作臺(tái)2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1發(fā)酵種子培養(yǎng)配制LB培養(yǎng)基①用燒杯稱取32g馬鈴薯，32gNaCl,16g酵母膏放至鍋中，燒杯用水沖洗，加入部分水，使藥品溶解②用30%NaOH調(diào)pH,至7，補(bǔ)齊3200ml水③分裝至6個(gè)三角瓶中，每個(gè)500ml④121℃滅菌23min。得6×500mlLB培養(yǎng)基,待用（以下實(shí)驗(yàn)部分需用不同容量及數(shù)量的LB培養(yǎng)基，按照比例重新配置即可）活化菌種①將裝有BacillussubtilisA16的種子瓶拿入無菌操作室，同時(shí)將200ml的LB培養(yǎng)基拿進(jìn)超凈工作臺(tái)，紫外滅菌20min.②按1:1000比例，每瓶培養(yǎng)基中加入200μl種子③將接種完的LB培養(yǎng)基放入搖床內(nèi)36℃,200r/min培養(yǎng)過夜④將種子瓶放回冰箱4℃保存菌種擴(kuò)大培養(yǎng)①將上步得到的200ml接種枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基，18×500mlLB培養(yǎng)基拿入無菌操作臺(tái)，開紫外燈對(duì)超凈工作臺(tái)滅菌20min左右②把上步試驗(yàn)中接種到200ml培養(yǎng)瓶中的菌種按照3%的接種量接種到500ml的LB培養(yǎng)基中，共有9L×18個(gè)大瓶③36℃,200r/min搖床培養(yǎng)，預(yù)得上罐前種子2.2.2發(fā)酵生產(chǎn)監(jiān)測(cè)（對(duì)0004,0005,0006罐進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐模擬實(shí)驗(yàn)）取樣從0004,0005,0006三罐中分別取樣壓片復(fù)染①制作菌種常規(guī)涂片：取潔凈載玻片，滴一滴取樣液于玻片中央，室溫自然干燥，涂面朝上，通過火焰2-3次進(jìn)行熱固定②于圖片上滴3-5滴孔雀綠溶液；用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)開始計(jì)時(shí)約4-5min；傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止；用0.05%的堿性復(fù)紅溶液進(jìn)行復(fù)染1min，水洗；觀察結(jié)果將制作好的壓片置片干燥后用油鏡觀察2.2.3BacillussubtilisA16與Bipolarismaydis的拮抗實(shí)驗(yàn)各種培養(yǎng)基的配制①酵母浸膏培養(yǎng)液：蔗糖`，酵母浸膏12g，K2HPO44g,無菌水1000ml②酵母浸膏培養(yǎng)基：酵母浸膏培養(yǎng)液+瓊脂20g③燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30g，瓊脂18g，無菌水1000ml玉米小斑病菌（Bipolarismaydis）的培養(yǎng)將玉米葉表面分離的玉米小斑病菌移植于燕麥片培養(yǎng)基上，25-30℃培養(yǎng)7d左右，待菌落表面達(dá)培養(yǎng)皿面積2/3時(shí)，22℃光照培養(yǎng)3d拮抗細(xì)菌（BacillussubtilisA16）的培養(yǎng)將A,B,C三罐的枯草芽孢桿菌分別接種于盛有150ml酵母浸膏培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃，240r/min震蕩培養(yǎng)48h拮抗實(shí)驗(yàn)以玉米小斑病菌為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙法測(cè)定枯草芽孢桿菌對(duì)玉米小斑病菌的拮抗作用。將2mm×2mm大小的玉米小斑病菌菌絲塊接在燕麥培養(yǎng)基中央，25℃培養(yǎng)3d，在離接種處25mm處的左右兩邊等距劃線接種枯草芽孢桿菌，對(duì)照組只接種病原菌玉米小斑病菌，25℃培養(yǎng)5d，每組處理3次重復(fù)3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1發(fā)酵生產(chǎn)監(jiān)測(cè)（0004,0005,0006實(shí)驗(yàn)室種子罐）0004罐發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行得比0005,0006罐相對(duì)早一些，比0005和0006提前進(jìn)入發(fā)酵階段，0005和0006罐進(jìn)行同步發(fā)酵試驗(yàn)，以下表格記錄三天內(nèi)三個(gè)罐的發(fā)酵情況表30004，0005,0006罐的發(fā)酵情況記錄Table3Fermentationconditionsrecordoffermentor0004,0005,0006發(fā)酵罐編號(hào)發(fā)酵情況記錄第一天上午0004視野內(nèi)大量菌體，少量芽孢，應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長期末期0005視野內(nèi)菌體量多，無污染，正處于對(duì)數(shù)生長期0006視野內(nèi)菌體量多，無污染，正處于對(duì)數(shù)生長期第一天下午0004視野內(nèi)芽孢占大概65%，處于發(fā)酵生產(chǎn)末期0005視野內(nèi)大量菌體，少量芽孢，處于對(duì)數(shù)生長期末期0006視野內(nèi)大量菌體，少量芽孢，處于對(duì)數(shù)生長期末期第二天上午0004視野內(nèi)大量芽孢，幾乎發(fā)酵結(jié)束0005視野內(nèi)大量桿菌，發(fā)酵正常，與正常發(fā)酵周期相符0006視野內(nèi)大量桿菌，發(fā)酵正常第二天下午0005視野內(nèi)大量桿菌，少量芽孢，發(fā)酵正常0006視野內(nèi)大量桿菌，發(fā)酵正常第三天上午0005視野內(nèi)大量菌體，少量芽孢，發(fā)酵正常0006視野內(nèi)菌體與芽孢數(shù)量都較少，有較多雜質(zhì)第三天下午0005視野內(nèi)大量菌體，芽孢較上午多一些，發(fā)酵正常0006視野內(nèi)大量雜質(zhì)，應(yīng)該已污染3.2拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1菌絲直徑表4菌絲直徑Table4diameterofmycelium組號(hào)直徑天數(shù)123實(shí)驗(yàn)組直徑/mm對(duì)照組直徑/mm實(shí)驗(yàn)組直徑/mm對(duì)照組直徑/mm實(shí)驗(yàn)組直徑/mm對(duì)照組直徑/mm12345153441424217364348511735404040183643495216364042421834444852為了更清楚地顯示枯草芽孢桿菌對(duì)玉米小斑病菌生長的一直情況，將第一組的量組數(shù)據(jù)繪制成折線圖顯示如下圖1菌絲直徑與時(shí)間的關(guān)系Fig.1therelationshipofmyceliumdiameterandtime3.2.2拮抗實(shí)驗(yàn)觀察在拮抗實(shí)驗(yàn)的過程中，無論是對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組，前兩天菌絲的生長都較快，從第三天開始，接種了枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)皿中病原菌的菌絲生長幾乎停滯，而對(duì)照組的病原菌菌絲仍處于繼續(xù)生長狀態(tài)。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3d之后，接種了枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基上已經(jīng)明顯出現(xiàn)了抑菌帶，在菌絲直徑與時(shí)間關(guān)系圖表中也可以明顯地看出沒有接種枯草芽孢桿菌的對(duì)照組菌絲生長狀況比實(shí)驗(yàn)組要好一些。實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示，在接種了枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基上，玉米小斑病菌的菌絲較對(duì)照組所占的培養(yǎng)皿面積少很多，菌體生長受到抑制。4討論4.1實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵生產(chǎn)監(jiān)測(cè)工業(yè)生產(chǎn)之前一般都要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模的發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)發(fā)酵生產(chǎn)監(jiān)測(cè)過程中，實(shí)驗(yàn)室小罐發(fā)酵周期與工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵周期基本相符。在最初階段，菌體處于對(duì)數(shù)生長階段，因?yàn)閷?duì)數(shù)生長期的種子是發(fā)酵生產(chǎn)中的最適種齡，此時(shí)菌體尚未達(dá)到最高峰。待菌體進(jìn)入穩(wěn)定期之后，發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)物合成階段，菌體穩(wěn)定期的生長規(guī)律對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐有著重要的指導(dǎo)意義，例如，對(duì)生產(chǎn)菌株或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物（SCP、乳酸等）為目的的某些發(fā)酵來說，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期[13]。在該發(fā)酵模擬試驗(yàn)中，當(dāng)取樣觀察發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)有大量芽孢存在時(shí)，既說明發(fā)酵已經(jīng)處于發(fā)酵末期。在發(fā)酵前期過程中觀察0006罐一直發(fā)酵正常，但從第三天觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐里含有大量雜質(zhì)而菌體量和芽孢量很少，可能原因就是發(fā)酵過程中被污染，應(yīng)屬于發(fā)酵中期污染，在該種情況下會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)生菌的代謝，雜菌大量產(chǎn)酸致使培養(yǎng)液pH下降，糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時(shí)甚至?xí)?huì)使已產(chǎn)生的產(chǎn)物分解。在染雜菌的情況下，如果情況較輕，可以降低培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，如果發(fā)酵單位到達(dá)一定遂平可以提前放罐,對(duì)于0005罐，整個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵過程中情況良好，基本與工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵的周期相同，菌體生長狀況正常，發(fā)酵條件控制恰當(dāng)，無污染情況發(fā)生；0004大罐較0005和0006大罐早進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)一天左右，所以觀察到的情況與0005和0006大罐不一致，但是總體的趨勢(shì)是一樣的，沒有污染發(fā)生，并且整個(gè)發(fā)酵過程幾乎與工業(yè)生產(chǎn)的正常發(fā)酵周期相符，所以0004和0006大罐發(fā)酵試驗(yàn)較為理想。4.2枯草芽孢桿菌拮抗實(shí)驗(yàn)分析在枯草芽孢桿菌抑制玉米小斑病菌生長的試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌A16對(duì)玉米小斑病菌的生長的確起到了一定的抑制作用。在拮抗實(shí)驗(yàn)中，接種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基中玉米小斑的有明顯的抑菌帶，說明枯草芽孢桿菌的拮抗性強(qiáng)且穩(wěn)定，對(duì)玉米小斑病菌有較好的拮抗作用，在第一天和第二天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的病原菌菌絲生長狀態(tài)幾乎同步，因?yàn)樗臃N的枯草芽孢桿菌距離病原菌距離較遠(yuǎn)，還不能對(duì)病原菌的生長起到一定的抑制作用，從第三天開始對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的菌絲生長狀況開始出現(xiàn)變化，實(shí)驗(yàn)組的枯草芽孢桿菌已經(jīng)明顯發(fā)揮抑菌作用而使得病原菌菌絲的生長幾乎停滯，而對(duì)照組的菌絲仍然處于生長狀態(tài)，可見枯草芽孢桿菌是一種較為理想的拮抗細(xì)菌，在植物病害尤其是農(nóng)作物的生物防治方面表現(xiàn)出一定的生防潛力。該實(shí)驗(yàn)只是粗略地測(cè)定了枯草芽孢桿菌對(duì)玉米小斑病菌生長的抑制作用，對(duì)于枯草芽孢桿菌作用的最適條件還應(yīng)有進(jìn)一步的要求，比如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、溶氧量、pH等。對(duì)于此拮抗關(guān)系，需要進(jìn)行更進(jìn)一步的研究來確定枯草芽孢桿菌作用的最適條件，為以后更好地防治玉米小斑病奠定基礎(chǔ)。5存在問題及展望5.1枯草芽孢桿菌生物肥料研發(fā)的展望及應(yīng)用對(duì)策在對(duì)枯草芽孢桿菌已有的研究基礎(chǔ)上，再進(jìn)行進(jìn)一步的研發(fā)，如對(duì)植物內(nèi)外微生物區(qū)系及微生態(tài)平衡的影響；對(duì)土壤性質(zhì)改良的長效機(jī)理；也可以研發(fā)在畜禽魚免疫方面的研發(fā)，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。同時(shí)，枯草芽孢菌劑在不同條件下使用時(shí)，對(duì)菌體本身可能產(chǎn)生的影響，密切注意它們的變化趨勢(shì)和可能發(fā)生的不良變異和影響，并提出合理有效的預(yù)防方法[14]。通過這些作用機(jī)理的研究，可以有效指導(dǎo)枯草芽孢桿菌制劑的產(chǎn)品生產(chǎn)工藝和應(yīng)用技術(shù)方法，是其的應(yīng)用和研究水平有更大的發(fā)展和提高。為了解決大多數(shù)菌劑還在實(shí)驗(yàn)室開發(fā)階段而不能大范圍施用的問題,目前主要采用與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配防和與其他拮抗微生物協(xié)同防病這兩種措施。這樣在某種程度上實(shí)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌菌劑的使用，也使得其使用效果在其他微生物的協(xié)同作用下得到提高。在產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化的問題上，國家應(yīng)逐步建立、完善行業(yè)生產(chǎn)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，制定有關(guān)法律及實(shí)施細(xì)則，使生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。同時(shí)建立與完善市場(chǎng)檢查和監(jiān)督機(jī)制，一旦發(fā)現(xiàn)不合格產(chǎn)品，立刻依據(jù)法律給予對(duì)應(yīng)的處罰。5.2生物菌肥研發(fā)使用中存在的問題我國的微生物肥料行業(yè)還處在起步階段，很多的肥料生產(chǎn)企業(yè)還徘徊在幼稚發(fā)展階段，沒有完善的管理制度，生產(chǎn)技術(shù)還有待發(fā)展，沒有明顯的效益?，F(xiàn)在，國家對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料有相應(yīng)的免稅政策，其中包括飼料、農(nóng)膜、部分化學(xué)農(nóng)藥與部分化學(xué)肥料，對(duì)銷售種子、種苗、農(nóng)機(jī)、化肥、農(nóng)藥的銷售商也有相應(yīng)的免稅政策，但這些都不包括微生物肥料行業(yè)與產(chǎn)品。與化肥行業(yè)、農(nóng)藥行業(yè)相比，微生物肥料行業(yè)還處在稚嫩的發(fā)展階段，但是，它又與我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略息息相關(guān)，在有機(jī)食品生產(chǎn)方面有著不可替代的地位，是我國肥料行業(yè)發(fā)展的方向之一。現(xiàn)在市場(chǎng)上出售的生物菌肥大部分對(duì)土壤的溫度、濕度、pH等要求比較嚴(yán)格，使得施用后菌種可能不能發(fā)揮最大的作用。在施用過程中，受到一些因素的影響，比如與殺菌劑、殺蟲劑等混合使用會(huì)造成菌肥中生物菌的死亡；高溫、低溫、干燥等較惡劣的條件不可施用。生物菌肥的研發(fā)面臨的一個(gè)問題是生物菌的生物活性如何在產(chǎn)期保存的情況下保存完好，有些菌肥只能進(jìn)行短期保存，這樣對(duì)工業(yè)生產(chǎn)來說會(huì)造成較大負(fù)擔(dān)。另外新菌種有待開發(fā)來生產(chǎn)更多功效的菌肥，能用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物只占所有微生物很小的一部分，所以對(duì)新型工業(yè)菌的開發(fā)研究是當(dāng)前一項(xiàng)有待解決的任務(wù)。5.3生物菌肥的推廣使用及展望5.3.1從目前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形勢(shì)和肥料使用狀況來看，農(nóng)藥化肥將逐步被生物肥料、生物農(nóng)藥所取代，化學(xué)制劑防治害蟲是一種治標(biāo)不治本的方案，雖然在短期內(nèi)可能達(dá)到消滅害蟲，提供作物營養(yǎng)的目的，但是但是時(shí)間久了害蟲雜草逐漸產(chǎn)生了抗性，土壤中殘留大量的化肥農(nóng)藥，都將嚴(yán)重影響人類及牲畜的健康以及環(huán)境的協(xié)調(diào)穩(wěn)定。從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)特點(diǎn)的角度來講，推廣生物菌肥具有一定的重要性。由于過去農(nóng)田耕作大量使用化學(xué)肥料，土壤中的氮過量，難溶解的磷、鉀又不能被植物吸收，使得土壤越來越板結(jié)，農(nóng)作物的耕種也就越困難，從而導(dǎo)致了農(nóng)作物的質(zhì)量與產(chǎn)量的下降。生物菌肥中的有效微生物可以同通過其新陳代謝的產(chǎn)物來降解難溶物質(zhì)，活化土壤，促進(jìn)植物對(duì)磷、鉀等元素的吸收，從而提高農(nóng)作物的品質(zhì)及產(chǎn)量。從示范和施用效果的角度來看，推廣和應(yīng)用生物菌肥具有一定的可行性。大量的調(diào)查顯示，使用生物菌肥的農(nóng)田作物產(chǎn)量均比未使用前不同程度的提高。在生物菌肥的推廣使用過程中，強(qiáng)有力的調(diào)查結(jié)果會(huì)提供更好地說服力。從生物菌肥使用的范圍來看，其推廣應(yīng)用具有一定的廣泛性。不同的生物菌肥可以適應(yīng)不同的種植環(huán)境，從而改善不同質(zhì)量的土壤，也就是說，生物菌肥的多樣化使得生物菌肥在各種地質(zhì)上都能發(fā)揮充分的效果。各級(jí)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣部門要加強(qiáng)生物菌肥的推廣，從生物菌肥產(chǎn)品的特性、作用功能、使用方法等方面，進(jìn)行多角度、全方位的推廣[15]。從而響應(yīng)“發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)”的號(hào)召。5.3.2生物菌肥的作用已逐漸被人們認(rèn)可?，F(xiàn)已有70多個(gè)國家進(jìn)行生物菌肥的生產(chǎn)機(jī)推廣使用。盡管現(xiàn)在生物菌肥的生產(chǎn)量以及應(yīng)用量遠(yuǎn)比不上傳統(tǒng)的化學(xué)肥料，但是由于其顯著的作用，已初步形成了小規(guī)模的生產(chǎn)并取得了一定的經(jīng)濟(jì)效益。經(jīng)過長期的研究開發(fā)，生物菌肥已形成了以下幾種趨勢(shì)：(1)由單一菌種向復(fù)合菌種轉(zhuǎn)化；(2)由單一功能向多功能轉(zhuǎn)化；(3)由豆科作物接種劑向非豆科作物肥料轉(zhuǎn)化；(4)由單一接種劑向復(fù)合生物肥轉(zhuǎn)化；(5)由用無芽胞菌種生產(chǎn)向用有芽胞菌種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化[16]?，F(xiàn)已有部分國家對(duì)生物菌肥的監(jiān)測(cè)衡量制定了一個(gè)明確的標(biāo)準(zhǔn)，以便對(duì)生物菌肥規(guī)格有一個(gè)明確的規(guī)定，避免了市場(chǎng)銷售及應(yīng)用的混亂。為了促進(jìn)國內(nèi)微生物肥料行業(yè)的發(fā)展，建議國家在相關(guān)法律上給予生物菌肥一定的優(yōu)惠政策，比如免收增值稅。同時(shí)，國家應(yīng)該加強(qiáng)菌種資源的管理，加大執(zhí)法力度，完善檢測(cè)體系，規(guī)范市場(chǎng)，保證微生物肥料的產(chǎn)品質(zhì)量。另外，國家應(yīng)該加大對(duì)微生物肥料基礎(chǔ)研究的投入，收集更多寶貴的資源，對(duì)微生物肥料的作用機(jī)理進(jìn)行更加深入徹底的研究，使我國的微生物肥料行業(yè)可以更好的發(fā)展[17]?，F(xiàn)在，我國也制定了農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)和成立微生物質(zhì)量檢測(cè)中心，并已于1996年正式對(duì)微生物肥料制品進(jìn)行產(chǎn)品登記、檢測(cè)及發(fā)放生產(chǎn)許可證等工作。隨著環(huán)境問題在全球范圍內(nèi)越來越受到重視以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展策略的應(yīng)用，生物菌肥的開發(fā)、生產(chǎn)及應(yīng)用力度在不斷擴(kuò)大。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，生物菌肥的研制一定會(huì)取得突破性進(jìn)展，逐步形成大規(guī)模的應(yīng)用，從而對(duì)土壤修復(fù)，農(nóng)作物增產(chǎn)等發(fā)揮其應(yīng)有的作用。生物菌肥作為一種無毒無害的產(chǎn)品將越來越受到人們的青睞，生物菌肥的推廣勢(shì)將成為肥料發(fā)展的必然趨勢(shì)。參考文獻(xiàn)[1]葛誠，吳薇.我國微生物肥料的生產(chǎn)、應(yīng)用及問題「J」.中國農(nóng)學(xué)通報(bào),1994,(3);24-28[2]沈衛(wèi)鋒，牛寶龍，翁宏飚等.枯草芽孢桿菌作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，,1（4）：234-238[3]MonicaLEElizabethADJ,WilliamEBJ.etal.Viabilityandstabilityofbiologicalcontrolagentsoncottonandsnapbeanseeds.Pest.Manag.Sci.2001,57(8):695-706[4]于同立.淺談細(xì)菌生物肥料[J].山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,18(2):35-40.[5]李維炯.微生態(tài)制劑的應(yīng)用研究[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2008.160-161[6]陳中義.多功能質(zhì)