高效液相色譜法

關(guān)于高效液相色譜法

高效液相色譜法是以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上，采用顆粒十分細(xì)的固定相，并采用高壓泵輸送流動相而建立的一種液相色譜法。第2頁,共106頁，星期六，2024年，5月HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓填料顆粒大柱效低分析速度慢色譜柱只用一次不能在線檢測高壓，40～50Mpa填料顆粒小，2～50μm柱效高，40000～60000塊/m分析速度快色譜柱可重復(fù)多次使用能在線檢測第3頁,共106頁，星期六，2024年，5月HPLC與GC差別氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析20%的化合物不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析用毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效有很靈敏的檢測器如ECD和較靈敏的通用檢測器（FID和TCD）流動相為氣體、無毒、易于處理運行和操作容易儀器制造難度較小幾乎可以分析各種物質(zhì)可以用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析色譜柱不能很長，柱效不會很高沒有較高靈敏的通用檢測器

流動相有毒、費用較高運行和操作比GC難一些儀器制造難度大第4頁,共106頁，星期六，2024年，5月流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性第5頁,共106頁，星期六，2024年，5月

操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┑?頁,共106頁，星期六，2024年，5月第7頁,共106頁，星期六，2024年，5月第一節(jié)液相色譜柱效第8頁,共106頁，星期六，2024年，5月速率理論（與GC對比）

1.第9頁,共106頁，星期六，2024年，5月2.第10頁,共106頁，星期六，2024年，5月2）渦流擴(kuò)散項及其影響討論：

1）流動相流速對HPLC板高的影響第11頁,共106頁，星期六，2024年，5月第12頁,共106頁，星期六，2024年，5月3）傳質(zhì)阻力項及其影響第13頁,共106頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)高效液相色譜儀

高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。當(dāng)注入欲分離的樣品時，高壓泵將貯液器中流動相經(jīng)過進(jìn)樣器，將樣品帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，得到液相色譜圖。第14頁,共106頁，星期六，2024年，5月第15頁,共106頁，星期六，2024年，5月第16頁,共106頁，星期六，2024年，5月第17頁,共106頁，星期六，2024年，5月第18頁,共106頁，星期六，2024年，5月第19頁,共106頁，星期六，2024年，5月第20頁,共106頁，星期六，2024年，5月

1．高壓輸液系統(tǒng)

固定相顆粒極細(xì)，對流動相阻力很大，配備有高壓輸液系統(tǒng)。一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成。（1）流量穩(wěn)定、無脈動，流量精度和重復(fù)性在1~2%左右；（2）流量范圍寬，且連續(xù)可調(diào)，一般在0.01~10mLmin-1之間，制備型儀器能達(dá)到100mLmin-1；

第21頁,共106頁，星期六，2024年，5月

（3）輸出壓力高、密封性好，要求最高壓力300~500kg/cm2；（4）耐腐蝕，能適用于各種有機(jī)溶劑、水和緩沖溶液；（5）操作、更換溶劑方便，易于清洗和維修，容易實現(xiàn)梯度淋洗和流量程序控制等。第22頁,共106頁，星期六，2024年，5月

第23頁,共106頁，星期六，2024年，5月2．進(jìn)樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素。

第24頁,共106頁，星期六，2024年，5月第25頁,共106頁，星期六，2024年，5月3、分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。第26頁,共106頁，星期六，2024年，5月

柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細(xì)粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。第27頁,共106頁，星期六，2024年，5月4．檢測系統(tǒng)

（1）溶質(zhì)性檢測器僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。第28頁,共106頁，星期六，2024年，5月第29頁,共106頁，星期六，2024年，5月第30頁,共106頁，星期六，2024年，5月第31頁,共106頁，星期六，2024年，5月光電二極管陣列檢測器第32頁,共106頁，星期六，2024年，5月

（2）總體檢測器對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。第33頁,共106頁，星期六，2024年，5月5、附屬系統(tǒng)

包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。

梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時間的目的。第34頁,共106頁，星期六，2024年，5月

梯度洗脫的實質(zhì)是通過不斷地變化流動相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到。第35頁,共106頁，星期六，2024年，5月梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第36頁,共106頁，星期六，2024年，5月第三節(jié)分配色譜

（PartitionChromatography）

根據(jù)分離機(jī)理的不同，高效液相色譜法主要可分為分配色譜、液固吸附色譜、離子交換和離子色譜、空間排阻色譜等。其中，最常用的是分配色譜法。一般將其分為液液色譜和鍵合相色譜.第37頁,共106頁，星期六，2024年，5月

在液液分配色譜中，一個液相作為流動相，另一個液相則涂在惰性擔(dān)體上作為固定相。兩者之間互不相溶，有一個明顯的分界面。試樣溶于流動相后，在色譜柱內(nèi)經(jīng)過分界面進(jìn)入固定液（固定相）中，由于試樣組分在固定相和流動相之間的相對溶解度存在差異，因而溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配，很快達(dá)到分配平衡。這種分配平衡的總結(jié)果導(dǎo)致各組分的差速遷移，從而實現(xiàn)分離。第38頁,共106頁，星期六，2024年，5月

由于固定液在流動相中有微量溶解，固定液會不斷流失而導(dǎo)致保留行為發(fā)生變化，柱效和分離選擇性變壞。因此，化學(xué)鍵合固定相逐漸代替涂漬固定相。第39頁,共106頁，星期六，2024年，5月一、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）

采用化學(xué)鍵合固定相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。第40頁,共106頁，星期六，2024年，5月1、鍵合固定相類型用來制備鍵合固定相的載體幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si—OH)與有機(jī)分子之間成鍵,即可得到各種性能的固定相。（1）疏水基團(tuán)：如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等；

第41頁,共106頁，星期六，2024年，5月

（2）極性基團(tuán)：如氨丙基、氰乙基、醚和醇等；（3）離子交換基團(tuán)：如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基、季銨鹽；作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸等。第42頁,共106頁，星期六，2024年，5月第43頁,共106頁，星期六，2024年，5月2、硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相

具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點。能在70℃以下，pH=2～8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛。第44頁,共106頁，星期六，2024年，5月3、正相色譜（NormalPhaseLiquidChromatography）流動相的極性小于固定相的極性。常用于分離極性較強(qiáng)的化合物，組分與極性固定相的作用力主要是靜電力，溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)；溶劑極性越弱，洗脫能力也越弱。分離順序是極性較低的組分保留值小，先流出色譜柱。常用飽和烴作流動相，加入適量極性溶劑以調(diào)節(jié)溶劑的強(qiáng)度，如甲醇、異丙醇等。第45頁,共106頁，星期六，2024年，5月4、反相鍵合相色譜法

（ReversePhaseLiquidChromatography）

流動相的極性大于固定相的極性。常用于分離極性較弱的化合物，由于固定相是非極性的，溶劑的強(qiáng)度隨溶劑極性的降低而增加。分離順序是極性較強(qiáng)的組分保留值小，先流出色譜柱。在洗脫序列中，水的極性最大，故水是洗脫強(qiáng)度最弱的溶劑。若增加水中的有機(jī)成分，則溶劑的洗脫強(qiáng)度增加；相反，若在水中加入無機(jī)鹽，則增加了溶質(zhì)的保留值。第46頁,共106頁，星期六，2024年，5月

在反相色譜中，通常以水為流動相的主體，再加入不同配比的有機(jī)溶劑作調(diào)節(jié)劑。常用的流動相是甲醇/水、乙腈/水、四氫呋喃/水，粘度小，沒有紫外吸收，而且能與水或緩沖溶液混合。

第47頁,共106頁，星期六，2024年，5月

關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。第48頁,共106頁，星期六，2024年，5月第49頁,共106頁，星期六，2024年，5月

反相色譜中，溶質(zhì)的分離以溶質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)的差異為基礎(chǔ)，溶質(zhì)的極性越弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大。引入取代基增強(qiáng)溶質(zhì)的疏水特性，能提高保留值，并與取代基的數(shù)目有關(guān)。如果分子中增加極性基團(tuán)，會使保留減小。根據(jù)溶質(zhì)分子中非極性骨架的差別，或官能團(tuán)的性質(zhì)、數(shù)目、位置的不同，能夠預(yù)測溶質(zhì)得洗脫順序。第50頁,共106頁，星期六，2024年，5月

例如，在苯酚分子上引入不同的官能團(tuán)，引入甲基則保留值增加，引入一個乙基相當(dāng)于引入兩個甲基的影響，引入一個丙基相當(dāng)于引入三個甲基的影響；在苯酚分子中引入羥基時則保留值降低，并且對苯二酚要比鄰苯二酚或間苯二酚較早洗脫出來；引入一個硝基時保留值增大，然而引入兩個或三個硝基時，由于苦味酸和2，4—二硝基酚易溶于水，保留值明顯減小。第51頁,共106頁，星期六，2024年，5月

烷基鍵合相的作用在于提供非極性的表面，鍵合到表面上的碳的數(shù)量決定樣品的保留值。烷基配合基的疏水特性隨著碳鏈的長度而增加，溶質(zhì)的保留值也將隨著烷基配合基碳鏈長度的增加而增加。第52頁,共106頁，星期六，2024年，5月

溶劑強(qiáng)度是描述溶劑色譜性能的主要指標(biāo)，是溶劑對樣品的洗脫能力，它決定于溶劑與溶質(zhì)之間的分子作用力。溶劑與樣品作用力強(qiáng)，則洗脫能力強(qiáng)，組分k值??；反之組分k值高，保留時間長。色譜分離過程中，溶質(zhì)在流動相和固定相之間的分配系數(shù)決定于溶質(zhì)與流動相和固定相的相互作用。這種作用不僅決定于參與作用分子的極性，而且決定于不同類型分子間的作用力，即范德華力和氫鍵力。第53頁,共106頁，星期六，2024年，5月

在選用溶劑時，為了獲得合適極性的溶劑，常采用二元或多元混合溶劑系統(tǒng)作為流動相，改善色譜系統(tǒng)的選擇性，獲得所需要的溶劑強(qiáng)度和溶解度。通常根據(jù)所起的作用，所采用的溶劑可分成洗脫劑及調(diào)節(jié)劑兩種。洗脫劑決定基本的色譜分離情況，而調(diào)節(jié)劑則起調(diào)節(jié)保留時間長短，并改善樣品中某些分離不理想組分的分離狀況。第54頁,共106頁，星期六，2024年，5月

在反相色譜柱上，增加洗脫液強(qiáng)度對8種化合物分離的影響。在（a）中流動相包含90%的乙腈和10%的緩沖溶液，因為乙腈具有很高的洗脫強(qiáng)度，所有的化合物都很快從色譜柱中洗脫出來，由于色譜峰相互重疊，只觀察到三個色譜峰；當(dāng)降低洗脫強(qiáng)度，使乙腈的濃度降為80%，分離效果好一些，可以觀察到五個色譜峰；當(dāng)乙腈的濃度降為60%，可以觀察到六個色譜峰；當(dāng)乙腈的濃度降為40%時，可以很清楚地觀察到八個色譜峰，除了2和3兩種物質(zhì)，其它的化合物都被很好地分離了；繼續(xù)降低乙腈的濃度（30%，35%），所有的化合物都得到很好地分離，但分析時間被大大延長，檢測靈敏度下降。

第55頁,共106頁，星期六，2024年，5月

梯度洗脫色譜分離要求在盡量短的時間內(nèi)獲得足夠的分辨率，但過大的分辨率會影響分析速度，并且隨著容量因子值的增大，譜帶展寬，使檢測變得比較困難。對于容量因子值相差很大的復(fù)雜混合物，在恒定狀態(tài)下洗脫，早出來的峰很尖，容量因子往往很小，甚至分不開，晚出來的峰很寬，無法檢測。梯度洗脫是溶劑組成隨時間連續(xù)變化而進(jìn)行的洗脫，能使容量因子相差1000~10000的樣品組分，在合理的分析速度下，得到很好的分離。第56頁,共106頁，星期六，2024年，5月第57頁,共106頁，星期六，2024年，5月第四節(jié)液固色譜(LSAC)

液—固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。

第58頁,共106頁，星期六，2024年，5月

1．分離原理當(dāng)流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當(dāng)試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附:

X+nSad=Xad+nS第59頁,共106頁，星期六，2024年，5月

達(dá)平衡時,有

其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小，則保留值弱，易于洗脫，試樣中各組分據(jù)此得以分離。第60頁,共106頁，星期六，2024年，5月

2．固定相極性吸附劑最常用的是硅膠，其次是氧化鋁；非極性吸附劑最常見的是活性炭。第61頁,共106頁，星期六，2024年，5月3、流動相

在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0.8×ε0氧化鋁）。第62頁,共106頁，星期六，2024年，5月第63頁,共106頁，星期六，2024年，5月第64頁,共106頁，星期六，2024年，5月

常用：底劑（烷烴）+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影響k的因素與固定相性質(zhì)和流動相性質(zhì)有關(guān)溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑

溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓

注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間第65頁,共106頁，星期六，2024年，5月5．出柱順序強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱

6．硅膠吸水量↑，LSC→LLC

硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液第66頁,共106頁，星期六，2024年，5月第五節(jié)離子交換色譜法（IEC）

和離子色譜法（IC）

一、離子交換色譜法利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。第67頁,共106頁，星期六，2024年，5月1、離子交換原理

利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換：

第68頁,共106頁，星期六，2024年，5月

陽離子交換：

陰離子交換：

一般形式：R—A＋B＝R－B＋A第69頁,共106頁，星期六，2024年，5月

達(dá)平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：

式中[A]r，[B]r分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們在溶液中的濃度。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見從表示試樣離子B對于A型樹脂親和力的大?。篕B/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。第70頁,共106頁，星期六，2024年，5月第71頁,共106頁，星期六，2024年，5月

對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+

二價離子的順序為：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+

對于季鋁型強(qiáng)堿陰離子交換樹脂，各陰離子的選擇性順序為：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－第72頁,共106頁，星期六，2024年，5月

2．固定相作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分，再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分。第73頁,共106頁，星期六，2024年，5月第74頁,共106頁，星期六，2024年，5月3．流動相

大多是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。

第75頁,共106頁，星期六，2024年，5月

一般，對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子的滯留次序為：檸檬酸離子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-

用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。第76頁,共106頁，星期六，2024年，5月

陽離子的滯留次序大為：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十差別不如陰離子明顯。第77頁,共106頁，星期六，2024年，5月

關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。

第78頁,共106頁，星期六，2024年，5月二、離子色譜法（IC）

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導(dǎo)檢測器，由于被測離子的電導(dǎo)信號被強(qiáng)電解質(zhì)流動相的高背景電導(dǎo)信號掩沒而無法檢測。

1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。第79頁,共106頁，星期六，2024年，5月離子色譜儀第80頁,共106頁，星期六，2024年，5月第81頁,共106頁，星期六，2024年，5月離子色譜連續(xù)抑制原理圖第82頁,共106頁，星期六，2024年，5月

在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動相，從而用電導(dǎo)檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。第83頁,共106頁，星期六，2024年，5月

若樣品為陽離子，用無機(jī)酸作流動相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應(yīng)：

R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-第84頁,共106頁，星期六，2024年，5月

經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。第85頁,共106頁，星期六，2024年，5月Frits等人提出不采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·L-1苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。第86頁,共106頁，星期六，2024年，5月第六節(jié)尺寸排阻色譜法（SEC）

尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。

第87頁,共106頁，星期六，2024年，5月

（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息；

(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器；

（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長；

（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。第88頁,共106頁，星期六，2024年，5月

1、分離原理

尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)——凝膠，凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。

第89頁,共106頁，星期六，2024年，5月第90頁,共106頁，星期六，2024年，5月2、固定相

所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。第91頁,共106頁，星期六，2024年，5月3、流動相

能溶解樣品，與凝膠相似，能潤濕凝膠。

溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴(kuò)散作用而影響分離效果。

選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品；以有機(jī)溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。第92頁,共106頁，星期六，2024年，5月第七節(jié)影響分離的因素1．第93頁,共106頁，星期六，2024年，5月2．對流動相的要求：1）與固定液不反應(yīng)2）對樣品有良好溶解度

k=1~10k=2~5最理想的3）與檢測器匹配：

UV（常用，測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長）熒光，電化學(xué)4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈）使用前過濾、脫氣第94頁,共106頁，星期六，2024年，5月3．洗脫方式

1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）類似GC的等溫度洗脫

2）梯度洗脫：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例即不斷改變其極性（兩個泵）適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）第95頁,共106頁，星期六，2024年，5月第96頁,共106頁，星期六，2024年，5月

液相色譜分離類型選擇參考表溶于水——排阻色譜，水為流動相相對分子質(zhì)量＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動相同系物——分配色譜不溶于水異構(gòu)體——吸附色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相液一液色譜相對分子質(zhì)量溶于水，不離解＜2000排阻色譜，水為流動相堿——陽離子交換色譜