臨床分子生物學(xué)檢驗臨床應(yīng)用

臨床分子生物學(xué)發(fā)展及臨床應(yīng)用從整體水平到分子水平示意圖分子水平細胞水平整體水平

生命科學(xué)的發(fā)展過程：RobertHooke,1665Watson,Crick,1953臨床分子生物學(xué)檢驗的定義及其發(fā)展

20世紀50年代，WatsonandCrike提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，標志著現(xiàn)代分子生物學(xué)的興起，為人類生命現(xiàn)象的本質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。分子生物學(xué)是生命科學(xué)中發(fā)展最快并且與其他學(xué)科廣泛交叉和滲透，已成為主導(dǎo)21世紀生命科學(xué)的前沿學(xué)科。臨床分子生物學(xué)檢驗的定義及其發(fā)展目的：研究生命現(xiàn)象本質(zhì)對象：生物分子的結(jié)構(gòu)與功能技術(shù)：基因克隆、基因擴增、基因組測序、基因敲除、印跡雜交、芯片技術(shù)、雙向電泳等。臨床分子生物學(xué)檢驗的定義及其發(fā)展分子生物學(xué)打破了學(xué)科的界線醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)把醫(yī)學(xué)各學(xué)科聯(lián)系在一起分子生物學(xué)分子藥理學(xué)分子腫瘤學(xué)分子遺傳學(xué)分子免疫學(xué)分子流行病學(xué)分子病理學(xué)分子神經(jīng)學(xué)臨床分子生物學(xué)檢驗的定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)：是利用分子生物學(xué)理論與技術(shù)從基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝物組等水平研究疾病的發(fā)生發(fā)展機制、疾病的預(yù)測與風(fēng)險評價、疾病的臨床診斷與治療，以及疾病的預(yù)防與控制。臨床分子生物學(xué)將有力地推動臨床醫(yī)學(xué)走向分子醫(yī)學(xué)時代。臨床分子生物學(xué)檢驗的定義及其發(fā)展以疾病為中心展發(fā)生、發(fā)診斷、治療預(yù)防、控制高特異性新一代檢驗診斷技術(shù)高靈敏度高通量化高自動化靶標生物分子標志物針對疾病相關(guān)生物分子在疾病發(fā)生發(fā)展、預(yù)防干預(yù)、治療過程中的變化趨勢、規(guī)律、范圍臨床分子生物學(xué)檢驗高特異性可實現(xiàn)微量標本、微量生物分子的微小變化的快速檢驗臨床分子生物學(xué)檢驗的定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗發(fā)展經(jīng)歷的四個階段：一、1976年，以導(dǎo)致遺傳病的基因突變位點為靶標，以液相DNA分子雜交為核心，成功的進行了地中海貧血的產(chǎn)前診斷，開創(chuàng)了臨床分子生物學(xué)檢驗的先河。二、1985年，以PCR技術(shù)為核心，大量擴增DNA序列，衍生出了很多檢測方法（限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)）等；三、以生物芯片為核心的高通量密集型技術(shù)。根據(jù)芯片上固定的探針不同，可分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片等。主要用于基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、雜交測序等。四、以DNA測序技術(shù)為核心技術(shù)。DNA測序可以為臨床疾病的分子診斷提供最精確的判定依據(jù)，現(xiàn)已成為臨床分子生物學(xué)檢驗基本技術(shù)之一。特別是第三代測序技術(shù)-單分子實時測序，速度更快，成本更低，將使個體化醫(yī)療成為現(xiàn)實。臨床分子生物學(xué)檢驗發(fā)展經(jīng)歷的四個階段：臨床分子生物學(xué)檢驗靶標及其應(yīng)用從廣義上來講，應(yīng)用到臨床的分子標志物包括基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和各種代謝物，目前，臨床分子生物學(xué)檢驗的靶標主要以核酸（DNA或RNA）為主。DNA為靶標個體基因組特征性DNA片段鑒定（病原菌、致病基因疾病相關(guān)基因位點）基因拷貝數(shù)的測定基因組DNA突變的檢驗分析基因組DNA中基因表達的各種調(diào)控元件（啟動子、沉默子、增強子）的檢驗分析線粒體基因組DNA拷貝數(shù)測定與突變的檢驗分析外周血游離循環(huán)DNA的檢測RNA為靶標RNA病毒基因組序列測定及其拷貝數(shù)測定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA水平的檢測疾病相關(guān)的各種微小RNA（microRNA）的檢驗分析外周血游離循環(huán)RNA的檢測蛋白質(zhì)分子標志物為靶標癌胚抗原CEA、CA系列檢測各種血漿蛋白測定病原體感染后抗體譜的檢測代謝物為靶標脂肪酸代謝氨基酸代謝有機酸代謝藥物代謝基因組DNA靶標是目前臨床分子生物學(xué)檢驗最常用的分子靶標臨床分子生物學(xué)檢驗靶標及其應(yīng)用一、病原生物基因組菌種鑒定：PCR-測序和PCR-DNA探針雜交等技術(shù)可以快速和準確的用于結(jié)核桿菌菌種的鑒定，縮短檢測時間。2.確定病毒感染和病毒載量：熒光定量PCR技術(shù)是明確感染源，判斷病情及傳染性，監(jiān)測臨床療效的客觀和有效指標。

一、病原生物基因組3.病毒分析：基因型變異產(chǎn)生不同臨床癥狀和預(yù)后，基因變異使病毒產(chǎn)生變異株，導(dǎo)致耐藥。4.細菌耐藥監(jiān)測和分子流行病學(xué)調(diào)查：抗生素大量使用導(dǎo)致菌群失調(diào)，機體微生態(tài)平衡遭到破壞。用隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)進行耐藥基因分型、同源性分析；指導(dǎo)選擇治療方案。還可用于追蹤和控制傳染源及可能的傳播途徑，確定患者反復(fù)感染是源于復(fù)發(fā)還是在感染等。

二、基因突變1.致病基因的分子缺陷單基因致病基因的檢測是診斷遺傳性疾病最可靠的實驗手段。采用DNA印記技術(shù)、PCR技術(shù)、突變檢測技術(shù)、基因表達產(chǎn)物量分析技術(shù)等可以確定疾病的分子缺陷，明確診斷。致病基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，影響了編碼產(chǎn)物量和質(zhì)的改變，如血紅蛋白病、血友病、Duchenne肌營養(yǎng)不良等。二、基因突變2.線粒體基因突變線粒體基因突變檢測（PCR、點突變檢測）對診斷線粒體遺傳病有重要價值。如糖尿病的研究。3.腫瘤相關(guān)基因研究基因結(jié)構(gòu)的改變、癌基因激活和抑癌基因失活機制、信號傳導(dǎo)通路中相關(guān)分子的變化，對我們了解腫瘤的發(fā)生機制、浸潤轉(zhuǎn)移與基因改變的關(guān)系，尋找腫瘤治療靶點提供了突破口。

三、基因多態(tài)性基因多態(tài)性用于：1.基因定位和遺傳病相關(guān)性分析通過分析遺傳標志的多態(tài)性，可將致病基因定位于染色體的特定區(qū)域，推測遺傳標志與疾病的關(guān)聯(lián)程度。2.疾病診斷和遺傳咨詢遺傳性疾病除了對患者基因缺陷分析以外，還要對其家系成員有無疾病病風(fēng)險進行評估。當孕婦為攜帶者時要做產(chǎn)前診斷。3.多基因病的研究主要是檢測相關(guān)基因的多態(tài)性，有助于了解疾病發(fā)生機制、疾病分類、靶器官損傷情況、指導(dǎo)個體用藥和評估病情預(yù)后。4.器官移植配型和個體識別主要是器官移植前HLA配型，犯罪嫌疑人識別、親子鑒定等。四、循環(huán)游離核酸包括游離DNA和游離RNA，與生理和病理狀態(tài)下的細胞代謝密切相關(guān)。其水平檢測在產(chǎn)前診斷、腫瘤早期診斷和病程監(jiān)測等方面意義重大。如血漿中microRNA可作為潛在分子標志物.1.循環(huán)游離核酸與腫瘤在腫瘤患者檢測microRNA、K-ras、P53、APC等癌基因和抑癌基因的突變，對腫瘤的治療和病程都可進行監(jiān)測，可作為潛在的早期診斷和預(yù)后判斷的分子標志物。四、循環(huán)游離核酸2.游離核酸與產(chǎn)前診斷孕婦外周血中的游離DNA是無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷較佳的分子標志物孕后5周即可檢測到?？捎糜谔盒詣e鑒定、單基因遺傳病等的檢測，胎兒游離RNA檢測，可對胎兒染色體畸變進行產(chǎn)前診斷。3.循環(huán)micoRNA與腫瘤診斷micoRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著極為密切的關(guān)系，micoRNA在腫瘤的異常表達，具有組織特異性，在血液中穩(wěn)定性很高，可能是血液中理想的腫標，并在惡性腫瘤中得到證實。第三節(jié)臨床分子生物學(xué)檢驗發(fā)展與應(yīng)用臨床分子生物學(xué)技術(shù)靶標：生物分子主線：基因結(jié)構(gòu)、表達變化功能改變主要技術(shù)：分子雜交、PCR、DNA測序、芯片、雙向電泳、色譜-質(zhì)譜、生物信息學(xué)靶標變化：以基因突變檢測遺傳性代謝病以病原微生物基因組及其拷貝數(shù)檢測感染性疾病以疾病全基因組關(guān)聯(lián)性分析SNPs檢測疾病風(fēng)險分析及耐藥性。應(yīng)用范圍日益廣泛第三節(jié)臨床分子生物學(xué)檢驗發(fā)展與應(yīng)用檢驗領(lǐng)域的改變：從單一的病因檢驗診斷到疾病的風(fēng)險評估、病因分析、療效評價、預(yù)后評估等綜合檢驗診斷。檢驗方法的改變：定性到定量、低通量到高通量、手工到自動化，從而實現(xiàn)靈敏度、特異性的提高，實現(xiàn)快速早期檢驗診斷。質(zhì)量控制體系也從無到有，從室內(nèi)質(zhì)控到室間質(zhì)評來保證檢測結(jié)果的真實、可靠、準確、有效。所以臨床分子生物學(xué)檢驗對感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤等診斷與治療發(fā)揮著愈來愈重要的作用。第三節(jié)臨床分子生物學(xué)檢驗發(fā)展與應(yīng)用感染性疾病(包括血液篩查)遺傳病檢測(包括染色體病檢測)腫瘤學(xué)(包括腫瘤個體化治療)藥物基因組學(xué)(個體化用藥)預(yù)測醫(yī)學(xué)一、臨床分子生物學(xué)檢驗與感染性疾病診斷與治療嚴重影響人類健康的病原生物結(jié)核桿菌肝炎病毒人類免疫缺陷病毒SARS病毒禽流感、原蟲以上病原生物基因和基因組的研究成為消滅病原生物、控制人類感染性疾的重要內(nèi)容，耐藥機制的研究在控制耐藥性和醫(yī)院獲得性感染也很重要。一、臨床分子生物學(xué)檢驗與感染性疾病診斷與治療以前病原體的檢測主要依靠病原學(xué)及免疫學(xué)方法檢測，但是方法受到靈敏度和特異性的限制，使得感染性疾病的診斷受到影響。但隨著生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，不僅可以對微生物感染做出確診，還可以對感染性病原體進行分型和耐藥性監(jiān)測，在人類感染性疾病的臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、微生物分類分型研究中顯示出它獨特強大的功能。示例：HPV分型與相關(guān)疾病風(fēng)險預(yù)測預(yù)測受檢者的患病風(fēng)險度，決定其篩查間隔：6、11型不會引起宮頸癌，高危型16、18等會最終導(dǎo)致宮頸癌對HPV陽性病人進行隨訪監(jiān)控，控制病情發(fā)展，避免過度治療宮頸病變病人手術(shù)前后隨訪提供依據(jù)24示例：HBV分子分型與耐藥性檢測HBVP區(qū)測序：預(yù)測拉米夫定、恩替卡韋、阿德福韋和替比夫定等藥物的耐藥情況HBVC區(qū)測序：預(yù)測HBV感染慢性化和肝細胞損傷加重25二、遺傳性疾病的臨床分子生物學(xué)檢驗遺傳性疾病的分類：Mendelian遺傳病、多因素遺傳病、染色體異常遺傳病(如21-三體)遺傳性疾病中的四種基本應(yīng)用：遺傳病基因攜帶者篩查、遺傳易感性篩查、產(chǎn)前診斷、新生兒篩查相關(guān)檢測技術(shù)：熒光原位雜交（FISH）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析，PCR-測序、比較基因組雜交（CGH）、基因拷貝數(shù)多態(tài)（CNV）等26示例：出生缺陷無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查母體外周血胎兒有核紅細胞(FNRBCs)母體血清/血漿胎兒特異性DNA甲基化標志物胎兒DNA的陽性標記物克服遺傳學(xué)水平檢測胎兒DNA的局限性27示例：遺傳性耳聾健康人群篩查：評估耳聾基因攜帶者的生育風(fēng)險高危人群孕檢：預(yù)測聾胎生育風(fēng)險，早期產(chǎn)前診斷新生兒篩查：早期發(fā)現(xiàn)易感基因攜帶情況(如：氨基糖甙類藥物易感基因攜帶者)28三、腫瘤的臨床分子生物學(xué)檢驗?zāi)[瘤是細胞基因組和他的微環(huán)境持續(xù)相互作用的結(jié)果，腫瘤相關(guān)基因包括癌基因和抑癌基因。癌基因具有潛在誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化的特征。腫瘤細胞基因組會出現(xiàn)缺失、重排、甲基化、擴增和插入.后基因組時代有許多方法分析腫瘤，最流行的是依賴于基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的生物技術(shù)腫瘤的臨床分子診斷主要集中在兩個領(lǐng)域腫瘤分子診斷與分子分型腫瘤個體化治療29

三、腫瘤的臨床分子生物學(xué)檢驗

應(yīng)用腫瘤分子標記來檢測腫瘤細胞出現(xiàn)的缺失、重排、甲基化、擴增和插入，從而對腫瘤早期診斷、分子分型、預(yù)后和治療方法的選擇提供指示，并可獲得腫瘤易感性30腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)測腫瘤分子分型腫瘤預(yù)后判斷示例：腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)測31示例：腫瘤分子分型32示例：腫瘤預(yù)后判斷33

四、臨床分子生物學(xué)檢驗與個體化醫(yī)學(xué)

個體化醫(yī)學(xué)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的核心目標，包含個體化診斷和個體化治療兩個部分，個體化診斷是個體化治療的基礎(chǔ)，個體化治療是個體化診斷的目的。如細胞色素P450酶系基因多態(tài)性的檢測，可指導(dǎo)個體用藥劑量；線粒體點突變可指導(dǎo)氨基糖苷類藥物的應(yīng)用，HER2（人表皮生長因子受體）的檢測可指導(dǎo)抗腫瘤藥物赫賽丁的臨床應(yīng)用。四、臨床分子生物學(xué)檢驗與個體化醫(yī)學(xué)腫瘤治療藥物在不同種族人群或個體間存在顯著的敏感性和不良反應(yīng)的差異腫瘤個體化治療臨床分子診斷的兩個基本應(yīng)用領(lǐng)域靶向治療：EGFR類單抗藥物(西妥昔、易瑞莎)傳統(tǒng)化療：依利替康、5-氟脲嘧啶、鉑類藥物35腫瘤個體化治療——靶向治療靶向治療是在細胞分子水平上，針對已經(jīng)明確的致癌位點(如：腫瘤細胞的一個蛋白分子或基因片段)來設(shè)計相應(yīng)的治療藥物，藥物進入體內(nèi)會特異地選擇致癌位點來相結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍的正常組織細胞通過實時定量、基因測序、FISH等技術(shù)檢測腫瘤患者基因突變及拷貝數(shù)變異(CNV)，根據(jù)檢測結(jié)果使用對應(yīng)的靶向生物藥物治療：單克隆抗體和小分子化合物等36示例：KRAS基因突變檢測KRAS基因突變可以使MAKP途徑持續(xù)性激活，最終導(dǎo)致EGFR單抗類藥物(愛必妥)的治療無效(如：結(jié)直腸癌、胃癌、頭頸部癌及肺癌等)KRAS基因痕量突變檢測技術(shù)——在擴增體系使用了抑制野生型KRAS基因擴增的探針，從而使反應(yīng)體系只能選擇性擴增突變型KRAS基因，達到高靈敏度(0.01%)檢測KRAS基因痕