酶工程課后作業(yè)

酶工程課后作業(yè)姓名：昂安娜班級：生工112目錄：糖化酶簡述果膠酶簡述漆酶簡述超氧化歧化酶簡述一糖化酶1糖化酶的用途

糖化酶是應(yīng)用歷史悠久的酶類,1500年前,我國已用糖化曲釀酒。本世紀(jì)20年代,法國人卡爾美脫才在越南研究我國小曲,并用于酒精生產(chǎn)。50年代投入工業(yè)化生產(chǎn)后,到現(xiàn)在除酒精行業(yè),糖化酶已廣泛應(yīng)用于釀酒、葡萄糖、果葡糖漿、抗菌素、乳酸、有機酸、味精、棉紡廠等各方面,是世界上生產(chǎn)量最大應(yīng)用范圍最廣的酶類。

葡萄糖淀粉酶(GlucoamylaseEC3.2.1.3)又稱γ一淀粉酶,簡稱糖化酶(縮寫GA或G)。糖化酶是由一系列微生物分泌的,具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端依次水解a-1,4糖苷鍵,切下一個個葡萄糖單元,并像β-淀粉酶一樣,使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化,形成β-D-葡萄糖。對于支鏈淀粉,當(dāng)遇到分支點時,它也可以水解a-1,6糖苷鍵,由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a-1,3連接的碳鏈,但水解a-1,4糖苷鍵的速度最快,它一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。

2糖化酶的活力測定原理及方法⑴原理：

目前檢測糖化酶活力最普遍的方法是用淀粉作底物,通過測定被酶分解產(chǎn)生葡萄糖的含量來定量分析糖化酶的活力。但針對一些特殊情況還有另外一些方法,如復(fù)合糖化酶中作為底物的淀粉同樣能被其他類型酶制劑所分解,要是用麥芽糖作底物,相比淀粉底物方法而言,麥芽糖只能被糖化酶專一分解。還有在篩選高活力糖化酶菌株時,采用Starch-PAGE電泳活性染色法,就可既簡便、準(zhǔn)確、靈敏,又可節(jié)約大量試劑。糖化酶有催化淀粉水解的作用,能從淀粉分子非還原性末端開始,分解α-l,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基,能被次碘酸鈉氧化,過量的次碘酸鈉酸化后析出碘,再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,計算出酶活力。

糖化酶水解麥芽糖生成D-葡萄糖。生成的葡萄糖可通過與葡萄糖脫氫酶反應(yīng)而測得,葡萄糖脫氫酶(GlucDH)試劑中加入變構(gòu)酶可將α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成β-D-葡萄糖。在GlucDH的作用下,β-D-葡萄糖與NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)發(fā)生反應(yīng)生成NADH,后者即等于葡萄糖初始濃度,可用于分光光度法在340nm測定其數(shù)值。⑵方法：根據(jù)糖化酶能水解淀粉的性質(zhì),采用Starch,在分離膠中加入淀粉作為糖化酶的作用底物,電泳結(jié)束后,在醋酸鈉緩沖液中浸泡適當(dāng)時間,使糖化酶所在部位膠板中的淀粉被酶解,其余部分的淀粉依然存在,碘液染色后,糖化酶存在的部位是無色透明的,沒有被水解的部位被染成藍(lán)色。經(jīng)實驗證明膠板中的淀粉濃度6%,醋酸鈉的浸泡時間3h～4h,碘染時間1min為宜。采用Starch-PAGE電泳活性染色篩選高活力糖化酶菌株,活性染色區(qū)帶的透明程度與酶液的活力呈正相關(guān)性,區(qū)帶越透明,表明酶活力越高。————摘自中國知網(wǎng)《糖化酶的研究概況》張秀媛二果膠酶1果膠酶的用途

果膠酶是能夠分解果膠質(zhì)的一類酶的總稱。果膠酶的應(yīng)用領(lǐng)域目前已非常廣泛,它不僅可用于食品工業(yè)如水果加工及葡萄酒生產(chǎn)等方面,還廣泛地應(yīng)用于麻類脫膠、木材防腐、生物制漿、環(huán)境保護(hù)、污物軟化處理和飼料等行業(yè)中?？衫霉z酶分解植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，分解細(xì)胞間質(zhì)中的果膠物質(zhì)，生產(chǎn)果膠低聚精等?！灾袊W(wǎng)《微生物果膠酶的應(yīng)用研究》郭鴻飛2果膠酶的活力測定原理及方法⑴原理：

測定酶活力的方法主要有還原法、色原底物法、粘度法等,其中還原法中的3,5一二硝基水楊酸比色法(簡稱DNS法)具有操作簡便,對試劑、儀器等條件要求不高等優(yōu)點。該方法是利用果膠酶在一定溫度、時間和條件下水解果膠,釋放出還原性D-半乳糖醛酸,與3,5一二硝基水楊酸共熱產(chǎn)生棕紅色的氨基化合物,即發(fā)生顯色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi),水解生成D-半乳糖醛酸的量與吸光度成正比[1~2],與果膠酶活力成正比,通過分光光度計測定吸光度,可以計算出果膠酶的活力。該方法(又稱分光光度計法)簡單易行。⑵方法：①試劑配制1乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(pH4.8)首先制備0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸鈉溶液,然后將0.2mol/L乙酸溶液410.0mL與0.2mol/L乙酸鈉溶液590.0mL混合均勻,用酸度計測定。2DNS試劑(3g/L)稱取3.00g3,5一二硝基水楊酸,溶解于500mL蒸餾水中,再逐步加入10.4gNaOH、91.0gC4H4KNaO6·4H2O、2.5g苯酚和2.5g無水亞硫酸鈉,溫水浴(不超過48℃)中不斷攪拌,直至溶液清澈透明。冷卻后用蒸餾水定容至1000mL,保存在棕色瓶中。3果膠底物(5g/L)稱取0.5g果膠,用pH4.8的緩沖液溶解,充分?jǐn)嚢韬?用緩沖液定容至100mL,置于冰箱內(nèi)冷藏(2~5℃)。1.2.1.4D-半乳糖(1mg/mL)精確稱量1.000gD-半乳糖醛酸,用緩沖溶液定容至1000mL,獲得1mg/mL的D-半乳糖醛酸溶液。②波長選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取9支25mL的刻度試管編號,并按表1所示加入各種試劑,在沸水浴中加熱5min,冷卻后定容至25mL。1號試管為標(biāo)準(zhǔn)空白樣,任選其它一支試管(本實驗選擇6號試管),在450～550nm的范圍內(nèi)每隔10nm測定溶液的吸光度。再以蒸餾水為空白樣,在450～550nm的范圍內(nèi)每隔10nm測定1號試管溶液的吸光度。根據(jù)選擇的最適波長,在此波長下以1號試管為標(biāo)準(zhǔn)空白樣測定其它試管內(nèi)溶液的吸光度,利用回歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。③DNS試劑用量的選擇如表3其它試劑用量不變,將DNS試劑用量設(shè)為3種處理,即1.5、2.5、5.0mL,然后在最適波長下測定吸光度值,通過回歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)相關(guān)系數(shù)確定DNS試劑的最適用量。④酶活力測定（1g酶在48℃、pH4.8的條件下,1h分解果膠產(chǎn)生1mgD-半乳糖醛酸為一個酶活力單位）1酶液稀釋倍數(shù)的確定如表4所示,每處理稱取1g(精確到0.1mg)酶粉(約2500U),用pH4.8的乙酸一乙酸鈉緩沖溶液分別稀釋到100、500、1000、2000倍,根據(jù)酶活力的測定結(jié)果確定最適的果膠酶稀釋倍數(shù)。2果膠底物用量的確定果膠底物的用量如表5所示,分別設(shè)置為0.2、0.5、0.8、1.0、1.5mL,根據(jù)酶活力的測定結(jié)果確定最適的果膠用量。3酶活力測定步驟于甲、乙兩支25mL比色管中分別加入一定量的果膠底物,在48℃水浴中預(yù)熱5min;于甲、乙管中分別加4mLpH4.8的乙酸一乙酸鈉緩沖溶液,甲管中加入1mL稀釋酶液,立即搖勻,在48℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min,再向乙管中加1mL稀釋酶液,并立即放入沸水浴中煮沸5min,終止反應(yīng),冷卻;分別取甲、乙管中的反應(yīng)液2mL于兩支25mL比色管中,再分別給甲、乙管加2mL蒸餾水,加入一定體積(1.2.2已確定的最適量)DNS試劑,混合,沸水浴煮沸5min,取出,立即冷卻。加蒸餾水定容到25mL;以標(biāo)準(zhǔn)空白為基準(zhǔn)調(diào)零,在最適波長處測定兩試管的吸光度(OD值);用測得的(OD甲-OD乙)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的D-半乳糖醛酸的量,代入下面公式計算果膠酶活力。

果膠酶活力(U):Y×N×2/t（其中OD甲-酶樣吸光度;OD乙-酶空白樣的吸光度;Y-酶作用生成的D-半乳糖醛酸(mg);N-樣品稀釋倍數(shù);2-測定酶活力時取了反應(yīng)液的1/2;t-反應(yīng)所用時間(h)。）————摘自《分光光度計法測定果膠酶活力的方法研究》王小敏三漆酶1漆酶的用途漆酶是一種含銅多酚氧化酶,在白腐菌中普遍存在,少數(shù)低等真菌和植物中也產(chǎn)生,多為分泌型糖蛋白。漆酶的應(yīng)用集中在以下幾方面:漆酶參與的有機合成;生物檢測;有毒化合物的消除;工業(yè)廢水處理;紙漿的生物漂白等等。————摘自中國知網(wǎng)《真菌漆酶及其應(yīng)用》鈔亞鵬2漆酶的活力測定原理及方法

⑴測氧氣法

漆酶是一種多酚氧化酶,它所催化的反應(yīng)過程中有氧氣的介入。測量反應(yīng)的耗氧量既可間接地推知漆酶的活性。較早建立的瓦氏呼吸器檢測法便是基于這一原理川。這一方法后來改進(jìn)為利用氧電極來測量耗氧量,如弗羅納等以愈創(chuàng)木酚為底物,利用氧電極測定了漆酶催化反應(yīng)過程中的耗氧量,并將1個漆酶活性單位定義為PH6.0及25℃條件下以愈創(chuàng)木酚作為電子供體時消耗1.0微摩爾氧氣所需要的酶量。亦可取醒醇作底物,利用氧電極測定漆酶的活性。郭明高提出了測定生漆漆酶活性的吸氧法,即將生漆溶于甲苯,測定酶促吸氧速度和累計酶促吸氧量,同時利用堿促吸氧法測定反應(yīng)前后漆酚濃度的變化,從而可以求得漆酚濃度衰減的規(guī)律及漆酶促吸氧的克分子比。此法的特點是反應(yīng)漆酶處于其天然存在的狀態(tài)而反應(yīng)底物又恰為漆酶的天然底物漆酚,這在漆酶測活研究中尚屬首例。⑵分光光度法某些漆酶的底物本身無色而酶促氧化產(chǎn)物發(fā)色,利用分光光度計監(jiān)測漆酶催化的反應(yīng)過程中顏色的變化即可推算出漆酶的活性。這類比色方法的酶源、反應(yīng)底物與檢測波長如表1所示。利用一種偶聯(lián)劑來追徐已經(jīng)生成的產(chǎn)物(例如與產(chǎn)物結(jié)合生成穩(wěn)定的、具有檢測特征的化合物),往往可以提高檢測的準(zhǔn)確性。焦性沒食子酸在漆酶的催化作用下,能夠氧化生成苯酮,苯酮與酚試劑迅速縮合,形成穩(wěn)定的紅色化合物,利用分光光度法測定其濃度的變化即可確定漆酶的活性[e]。這種方法比用對苯二胺作底物的常規(guī)比色方法靈敏。黃色的2一硝基一湯一硫代苯酸(TNB)與等摩爾的4一甲基一1,2苯醒(或?qū)Ρ叫?偶聯(lián)之后,黃色消失。赫爾曼·埃斯特鮑爾等利用漆酶催化4一甲基鄰苯二酚或?qū)Ρ蕉由傻男杨惾ヅ悸?lián)TNB,再用分光光度計在412nm處測量TNB的減少量,比較準(zhǔn)確地測定了香蕉、松針和漆樹中漆酶的活性。TNB的摩爾消光系數(shù)較大,因而這一方法極其靈敏。日本科學(xué)家最近發(fā)現(xiàn)漆酶可以催化無色的苯甲酸一與ABTS試劑偶聯(lián),生成在可見光范圍內(nèi)具有強烈峰吸收的特征性有色物質(zhì)。他們已將這一反應(yīng)成功地應(yīng)用于漆酶活性的測定,取得了良好的效果。酶催化的氧化反應(yīng)是一種單電子氧化反應(yīng),初級產(chǎn)物中將有自由基出現(xiàn)。自由基極易誘發(fā)化學(xué)反應(yīng),特別是芳環(huán)上的化學(xué)反應(yīng)。這些反應(yīng)將導(dǎo)致產(chǎn)生更為復(fù)雜的多環(huán)分子。此外,作為漆酶底物的酚類容易被溶液中的氧氣直接氧化。所有這些誘生的發(fā)色基團(tuán)在可見光區(qū)內(nèi)均有強烈吸收。因此,在嚴(yán)格的意義上說,測定漆酶活性的分光光性法仍尚欠準(zhǔn)確。⑶高壓液相色譜法

基于上述考慮,巴迪安尼等建立了測定漆酶活性的高壓液相色譜法,其大致步驟是,以愈創(chuàng)木酚為底物,在無氧溶液中加入漆酶,3分鐘后,用三氯乙酸中止反應(yīng),并將反應(yīng)體系置于一40℃避光的低溫恒溫器中,非酶催化反應(yīng)基本停止,再用高壓液相色譜純化、分離愈創(chuàng)木酚,用分光光度法測定愈創(chuàng)木酚的濃度,據(jù)此即可推算出每分鐘漆酶分解的愈創(chuàng)木酚的微克分子數(shù)[“”。比較研究表明,以愈創(chuàng)木酚為底物的分光光度法測出的漆酶的K二值與用高壓液相色譜法測定的同一漆酶的Km值相差較大,初級氧化產(chǎn)物進(jìn)一步反應(yīng)所生成的發(fā)色基團(tuán)對于分光光度法顯然有明顯干擾。費利斯利用高壓液相色譜對與植物代謝發(fā)生各種聯(lián)系的52種芳香族化合物的漆酶分解產(chǎn)物作了分析研究,提出了根據(jù)這些底物的酶促分解速率測定漆酶活性的方法[22’。他們找到了這些分解產(chǎn)物的最大吸收波長,發(fā)現(xiàn)這些吸收峰值往往彼此接近,因此,在存在多種酚類底物的體系中測定漆酶活性的方法是不可取的?？傊?測定漆酶活性的儀器己從簡單的瓦氏呼吸器改進(jìn)為分光光度計,進(jìn)而發(fā)展到精密的高壓液相色譜儀,測定的精確度和靈敏度亦隨之而不斷提高。值得提出的是,目前所通常采用的分光光度法測定的漆酶活性常用某種特定底物在一定時間內(nèi)的光吸收的變化值來表示,尚未統(tǒng)一換算成酶學(xué)上的標(biāo)準(zhǔn)活性單位,這就不利于測試結(jié)果的比較分析,因此,漆酶活性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化工作仍應(yīng)待加強?！灾袊W(wǎng)《漆酶活性測定方法概述》周易勇四超氧化歧化酶

1超氧化歧化酶的用途

氧的某些代謝產(chǎn)物及其衍生的含氧物質(zhì)都是直接或間接由氧轉(zhuǎn)化而成的。由于它們都含有氧,而且具有較活潑的化學(xué)反應(yīng)特性,遂統(tǒng)稱為活性氧。它們可導(dǎo)致膜脂過氧化、堿基突變、DNA鏈的斷裂和蛋白質(zhì)的損傷等。植物體在正常生長條件下也能產(chǎn)生少量的氧氣,它主要來源于線粒體的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、光合作用,以及一些氧化還原酶的產(chǎn)物。但在正常的生理情況下,活性氧在不斷產(chǎn)生,也不斷地被清除,因而不會造成自由基對機體的損傷?；钚匝踉谥参矬w內(nèi)的清除由保護(hù)酶和抗氧化物質(zhì)來完成。保護(hù)酶主要是超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)等,其中SOD起主要作用;植物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)主要包括抗壞血酸、維生素E及還原性谷朧甘膚等。SOD是一種具有特定生物催化功能的蛋白質(zhì),由蛋白質(zhì)和金屬離子組成,它廣泛存在于自然界的動物、植物以及一些微生物體內(nèi)。1938年Mann和Keilin[3〕首次從牛紅細(xì)胞中得到一種含銅蛋白—血銅蛋白,1969年MoCord和Fridovioh[‘〕發(fā)現(xiàn)此蛋白能夠使超氧陰離子自由基02一發(fā)生歧化反應(yīng),因而將其定名為超氧化物歧化酶。生存環(huán)境的變化是不可避免的,任何生物必須去適應(yīng)各種變化.以植物為例,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),不同條件、不同物種、不同的發(fā)育時期及不同器官發(fā)生脅迫后,SOD活性表現(xiàn)有升有降。然而SOD活性不論是升高還是降低,都表現(xiàn)出抗性強的品種比抗性弱的品種活性高.即當(dāng)SOD活性降低時,抗性強的品種下降幅度小;而當(dāng)SOD活性升高時,抗性強的品種升高幅度大;或者抗逆性強的品種活性升高而抗逆性弱的品種降低。這說明在逆境條件下植物的抗性強弱與植物體內(nèi)能否維持較高的SOD活性水平有關(guān)。SOD在食品當(dāng)中得到了廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出來很多富含SOD的食品,如SOD草墓、SOD啤酒、SOD蘋果、SOD桃子、SOD綠豆芽、SOD活性茶以及SOD臍橙等,營養(yǎng)豐富,市場經(jīng)濟(jì)效益很好,有很好的發(fā)展?jié)摿?。SOD在醫(yī)藥中的應(yīng)用廣泛，是一種新型抗炎癥藥物,尤其對治療關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有明顯療效。臨床上用SOD治療了一些患有關(guān)節(jié)炎退變癥的病人,每人注射1~15次,注射量因病人而異,少則1次只注射2mg,多則可注射30mg,治療90d后,19個病人中有16個明顯好轉(zhuǎn)。Puhl等用cu一SOD進(jìn)行關(guān)節(jié)注射治療關(guān)節(jié)炎,也取得了令人滿意的效果。另據(jù)報道,SOD治療自身免疫疾病方面的效果也比較顯著。SOD用于靜脈注射對由化療引起的骨髓損傷和白血球減少的恢復(fù)效果也較好。此外,SOD對治療貝切特氏病、心肌梗塞等血管性心臟病、膠原病、新生兒呼吸困難綜合癥、水腫、肺氣腫、輻射病以及老年白內(nèi)障等疾病也有療效。SOD在保健品和日用化工方面的應(yīng)用由于人的皮膚直接與氧氣接觸,會造成皮膚的老化和損傷。SOD在保護(hù)皮膚、防止氧化等方面的效果比較突出。為此,也開發(fā)了一些富含SOD的保健品,通過食用來抵抗衰老。此外,國內(nèi)外不少化妝品都添加了SOD,如國內(nèi)的大寶SOD、康妮SOD、SOD康舒達(dá)箱等產(chǎn)品,對保養(yǎng)皮膚、防止衰老、阻止老年斑的生成有一定的效果?！灾袊W(wǎng)《超氧化物歧化酶(SOD)研究綜述》陳鴻鵬、譚曉風(fēng)2超氧化歧化酶的活力測定原理及方法⑴原理：

自1969年McCord等首次發(fā)現(xiàn)具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase簡稱SOD)以來，眾多測定SOD的方法已逐步建立起來，其中以化學(xué)法最為常用.經(jīng)典的鄰苯三酚法是Marklund等

于1974年發(fā)表的一種通過比色測定SOD的簡便方法.此后，鄰苯三酚法在國內(nèi)外得以廣泛應(yīng)用.與其他方法相比，鄰苯三酚自氧化法具有操