分子體外診斷檢驗 福爾馬林固定及石蠟包埋組織檢驗前過程的規(guī)范 第4部分：原位檢測技術(shù)

ICS11.100.10

CCSC30

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—XXXX

`

分子體外診斷檢驗福爾馬林固定及石蠟

包埋組織檢驗前過程的規(guī)范

第4部分：原位檢測技術(shù)

Molecularinvitrodiagnosticexaminations-Specificationsfor

preexaminationprocessesforformalin-fixedandparaffin-embedded

(FFPE)tissue-Part4:insitudetectiontechnique

(ISO20166-4:2021,IDT)

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件是GB/T42216《分子體外診斷檢驗福爾馬林固定及石蠟包埋組織檢驗前過程的規(guī)范》的第4

部分。GB/T42216已經(jīng)發(fā)布了以下部分：

――第1部分：分離RNA；

――第2部分：分離蛋白質(zhì)；

――第3部分：分離DNA；

――第4部分：原位檢測技術(shù)。

本文件等同采用ISO20166-4:2021《分子體外診斷檢驗福爾馬林固定及石蠟包埋組織檢驗前過程

的規(guī)范第4部分：原位檢測技術(shù)》。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由國家藥品監(jiān)督管理局提出。

本文件由全國醫(yī)用臨床檢驗實驗室和體外診斷系統(tǒng)標準化技術(shù)委員會（SAC/TC136）歸口。

本文件起草單位：

本文件主要起草人：

II

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引言

分子體外診斷（包括分子病理學）技術(shù)的出現(xiàn)使醫(yī)學取得了重大進展。然而，分子體外診斷結(jié)果的

準確性受諸多因素的影響，包括檢驗前過程的不規(guī)范操作。如在標本采集、運送、貯存及處理過程中的

不規(guī)范操作可能造成這些分子的含量和/或完整性發(fā)生顯著變化，后續(xù)的檢驗分析會受到檢驗前過程人

為因素的影響，不能完全反映患者的真實狀態(tài)，使得診斷或研究的結(jié)果受到影響。因此需要對從標本采

集到檢測的整個檢驗前過程進行標準化。

GB/T42216規(guī)定了福爾馬林固定和石蠟包埋組織的分子體外診斷檢驗的檢驗前操作步驟的標準化

要求，擬由4個部分組成。

――第1部分：分離RNA。目的在于規(guī)范福爾馬林固定和石蠟包埋組織的RNA檢驗的標準化檢驗前

操作步驟，減少RNA譜的變化和修飾，保障后續(xù)檢驗結(jié)果的有效性和可靠性。

――第2部分：分離蛋白質(zhì)。目的在于規(guī)范福爾馬林固定和石蠟包埋組織的蛋白質(zhì)檢驗的標準化檢

驗前操作步驟，減少蛋白質(zhì)譜的變化和修飾對后續(xù)檢驗的影響。

――第3部分：分離DNA。目的在于規(guī)范福爾馬林固定和石蠟包埋組織的DNA檢驗的標準化檢驗前

操作步驟，減少DNA譜的變化和修飾對后續(xù)檢驗的影響。

――第4部分：原位檢測技術(shù)。目的在于規(guī)范化福爾馬林固定和石蠟包埋組織原位檢測的標準化檢

驗前操作步驟，減少相關(guān)試驗因素對原位檢測結(jié)果的影響。

1

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分子體外診斷檢驗福爾馬林固定及石蠟包埋組織檢驗前過程的規(guī)

范第四部分：原位檢測技術(shù)

1范圍

本文件提供了在進行分子分析之前的檢驗前階段，用于原位檢測的福爾馬林固定和石蠟包埋組織

(FFPE)樣本標本處理、記錄、貯存及取材的指南。

本文件適用于分子體外診斷檢驗，包括醫(yī)學實驗室和分子病理學實驗室進行的實驗室自建檢測項目；

也旨在用于實驗室客戶、體外診斷開發(fā)者和制造商、生物樣本庫、從事生物醫(yī)學研究的機構(gòu)和商業(yè)組織、

以及監(jiān)管機構(gòu)。

本文件不適用于從FFPE組織中分離的RNA、蛋白質(zhì)和DNA的檢驗前階段。

注：國際、國家及區(qū)域法規(guī)要求同樣適用于本文件涉及的特定內(nèi)容。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

3術(shù)語和定義

GB/T22576界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

親和配體affinitybinder

包括親和體、多肽、抗體（3.3）片段或其他小分子（3.6），能夠與細胞結(jié)構(gòu)分子相互作用，從而

用于原位檢測（3.27）技術(shù)。

3.2

環(huán)境溫度ambienttemperature

未經(jīng)調(diào)節(jié)的周圍空氣的溫度。

抗體antibody

2

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由B淋巴細胞產(chǎn)生和分泌的蛋白質(zhì)（3.37）（免疫球蛋白），對被識別為外來（抗原（3.4））的分

子作出反應(yīng)，并能與該特定抗原（3.4）結(jié)合。

3.3

抗原antigen

刺激抗體（3.3）產(chǎn)生并與之反應(yīng)的物質(zhì)。

3.4

抗原修復(fù)/表位修復(fù)antigenretrieval/epitoperetrieval

通過中和福爾馬林固定（3.19）、組織處理（3.47）和組織石蠟包埋（3.33）引入的修飾，暴露抗

原（3.4）/表位（3.14），并恢復(fù)其與免疫組織化學（3.25）檢測中所用抗體（3.3）結(jié)合的特性。

3.5

生物分子biomolecule

生物體內(nèi)產(chǎn)生的有機分子，參與生物體的維持和代謝過程。

注：有機分子的實例為蛋白質(zhì)（3.37）、碳水化合物、脂質(zhì)或核酸。

3.6

透明clearing

組織處理（3.47）過程中的一個步驟，將福爾馬林固定的組織從脫水（3.10）試劑轉(zhuǎn)移到透明劑（例

如二甲苯）中，以制備用于浸蠟（3.26）的組織。

3.7

冷缺血coldischemia

組織自人體取出后至穩(wěn)定或固定前的存在狀況。

3.8

脫鈣decalcification

使用化學試劑從骨或其他鈣化組織中去除礦物質(zhì)（無機鈣）的技術(shù)，將硬組織成分調(diào)整到石蠟（3.32）

的柔軟度，以便切片。

3.9

脫水dehydration

將福爾馬林固定的組織浸泡在一系列濃度不斷增加的脫水試劑溶液中，最后用無水（100%）溶液

處理，從而去除水分的組織處理（3.47）步驟。

3

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3.10

偏倚deviation

偏離批準的說明、程序和/或方法或既定標準。

3.11

診斷diagnosis

從其體征和/或癥狀中識別健康或疾病狀態(tài)，診斷過程可以通過各種檢驗(3.15)對個體狀況進行分類，

分成不同的類別或亞類，以便做出關(guān)于治療和預(yù)后的醫(yī)學決策。

3.12

脫氧核糖核苷酸deoxyribonucleicacid

以雙鏈或單鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸聚合體。

3.13

表位epitope

抗原（3.4）生物分子（3.6）上的抗體（3.3）結(jié)合位點。

3.14

檢驗examination

分析測試analyticaltest

以確定一個特性的值或特征為目標的一組操作。

注：從使用抗體（3.3）、核酸探針或染料的原位檢測（3.27）開始、包括各種用于定性或定量檢驗的參數(shù)測試或化

學操作的過程。

3.15

檢驗制造商examinationmanufacturer

分析測試制造商analyticaltestmanufacturer

制造和/或生產(chǎn)特定分析測試（3.15）的實體。

3.16

福爾馬林固定及石蠟包埋組織FFPEtissue

經(jīng)福爾馬林固定（3.18、3.19）、組織處理（3.47）和石蠟包埋（3.33）于組織盒的組織標本（3.36）

/樣本（3.42）。

3.17

福爾馬林formalin

質(zhì)量分數(shù)為37%的飽和甲醛水溶液（相當于體積分數(shù)為40%）。

4

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3.18

福爾馬林固定formalinfixation

用標準緩沖福爾馬林溶液（3.45）處理樣品（3.42）使其穩(wěn)定。

3.19

福爾馬林色素formalinpigment

酸性福爾馬林血紅素色素acidformalinhaematinpigmentacid

酸性血紅素hematin

黑色至棕色的無定形至微晶顆粒，從福爾馬林固定組織中制備的組織切片中所含的人工顆粒。是由

于該組織中甲酸濃度增加，甲酸作用于血紅蛋白而產(chǎn)生。

3.20

大體檢查grossing;grossexamination

裸眼肉眼檢查病理標本以獲得診斷信息，同時進行組織處理用于進一步的顯微檢查。（3.15）。

3.21

組織化學技術(shù)histochemicaltechnique(s)

用于生物分子（3.6）可視化和表征的原位檢測（3.27）技術(shù)，涉及與生物分子（3.6）中特定基團、

自由基或化學鍵的化學反應(yīng)，并提供生物分子（3.6）在組織切片（3.49）中原位定位的信息。

注：生物分子（3.6）的示例為碳水化合物、脂質(zhì)、其他代謝物、蛋白質(zhì)（3.37）、氨基酸、核酸、色素或酶等。

3.22

組織學染色histologicalstaining

原位檢測（3.27）技術(shù)通過組織學染色（例如蘇木精-伊紅（HE）、嗜鉻苯胺藍（CAB））來制備

組織切片（3.49），以突出組織切片（3.49）的特征并增強組織切片（3.49）的對比度。

3.23

均質(zhì)homogeneous

結(jié)構(gòu)和組成均勻。

3.24

=/IHCimmunohistochemistry/IHC

原位檢測（3.27）技術(shù)，利用抗體（3.3）與生物組織或細胞中的抗原（3.4）/表位（3.14）特異性

結(jié)合的原理，使用明場顯微鏡觀察抗原（3.4）（例如蛋白質(zhì)（3.37））。

3.25

浸蠟/石蠟浸蠟impregnation/impregnationwithparaffin

組織處理（3.47）中的一個步驟，更換透明劑和用融化石蠟（3.22）滲透組織。

3.26

原位檢測insitudetection

在切片上精確定位特定生物分子（3.6）的技術(shù)。

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示例：用于蛋白質(zhì)（3.37）檢測的免疫組化技術(shù)（3.25），用于核酸檢測的原位雜交（3.30），組織學染色（3.23），

組織化學技術(shù)（3.22），MALDI成像質(zhì)譜，成像質(zhì)譜，原位拉曼光譜。

3.27

原位檢測系統(tǒng)/檢測系統(tǒng)insitudetectionsystem/detectionsystem

用于在組織切片（3.49）顯示配體分子與靶標結(jié)合的一組試劑。

注1：分子可以是抗體（3.3），親和配體分子（3.1）和核酸等。

注2：原位檢測（3.27）最常見的是基于酶和熒光基團的檢測系統(tǒng)。

3.28

原位檢驗/分析性原位測試insituexamination/analyticalinsitutest

基于原位檢測（3.27）的檢驗（3.15）。

3.29

原位雜交/ISHinsituhybridization/ISH

原位檢測（3.27）技術(shù)，利用互補核酸探針與生物組織或細胞中的RNA（3.38）或DNA（3.13）片

段特異性結(jié)合的原理，使用明場或熒光顯微鏡觀察核酸（如DNA（3.13）或RNA（3.38））。

3.30

不合格nonconformity

不滿足要求。

3.31

石蠟paraffin/paraffinwax

從蒸餾物中獲得的產(chǎn)品，主要由飽和烴混合物組成，在室溫（3.41）下為固體，用于福爾馬林固定

組織標本（3.36）/樣本（3.42）的石蠟包埋（3.33）。

3.32

石蠟包埋paraffinembedding/embeddinginparaffin

將組織樣品置于石蠟中，產(chǎn)生固化的周圍基質(zhì)，從而能切割出薄層顯微切片的過程。

3.33

翻譯后修飾post-translationalmodification

在核糖體完成蛋白質(zhì)（3.37）翻譯后，由酶催化蛋白質(zhì)（3.37）的修飾，可以是向蛋白質(zhì)（3.37）

共價添加功能基團，例如磷酸化和去乙?；?。是蛋白質(zhì)（3.37）功能成熟所必需的蛋白水解加工和/或折

疊過程。

3.34

檢驗前過程pre-examinationprocess（統(tǒng)一按GB/T22576.1-2018）

分析前階段preanalyticalphase

分析前工作流程preanalyticalworkflow

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按時間順序自醫(yī)生申請至分析檢驗啟動的過程，包括檢驗申請、患者準備和識別、原始樣品采集、

運送和醫(yī)學或病理實驗室內(nèi)傳遞、分析物提取等。

注：檢驗前階段包括影響預(yù)期檢驗結(jié)果的準備流程。

注：原位檢測（3.27）的檢驗前階段包括影響預(yù)期檢驗（3.15）結(jié)果的準備流程，例如抗原/表位修復(fù)（3.5）和預(yù)雜

交過程。

3.35

蛋白質(zhì)protein

由一條或多條由膚鍵連接的，具有特定序列的氨基酸鏈組成的一種生物大分子。

3.36

RNA（核糖核酸）RNAribonucleicacid

以單鏈或雙鏈形式存在的核糖核苷酸聚合體。

3.37

RNA譜RNAprofile

在沒有任何損失、抑制或干擾的情況下，樣品中存在并能測量的各種RNA分子的數(shù)量。

3.38

RNase（核糖核酸酶）RNaseribonuclease

催化RNA（3.38）降解成更小組分的酶。

3.39

室溫roomtemperature

本文件中是指18℃-25℃。

3.40

樣品sample

取自原始樣品的一部分或多部分。

3.41

原始樣品primarysample

標本specimen

為檢驗、研究或分析一種或多種量或特性而取出的認為可代表全部的一獨立部分的體液、呼出氣、

頭發(fā)或組織等。

3.42

標本容器specimencontainer

組織標本（3.36）收集后轉(zhuǎn)移到其中進行進一步分析前工作流程（3.35）步驟（例如轉(zhuǎn)移、固定）

的容器。

3.43

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穩(wěn)定性stability

在規(guī)定條件下貯存時，樣品材料在規(guī)定時間內(nèi)保持聲稱特性值在規(guī)定限值范圍內(nèi)的能力。

注：本文件涉及的分析物是原位和組織內(nèi)的生物分子（3.6）。

3.44

標準緩沖福爾馬林溶液standardbufferedformalinsolution

中性緩沖福爾馬林neutralbufferedformalin;NBF

10%福爾馬林（3.18）水榕液，所含甲醒的質(zhì)量分數(shù)為3.7%（相當于體積分數(shù)4%），緩沖至pH=6.8～

7.2。

注：標準緩沖福爾馬林溶液通常含有少量甲醇以抑制甲酶的氧化和聚合。

10%福爾馬林(3.18)水溶液，即pH為6.8-7.2、質(zhì)量分數(shù)為3.7%（相當于體積分數(shù)為4%）的甲醛水

溶液。

注：標準緩沖福爾馬林溶液通常含有少量甲醇以抑制甲醛的氧化和聚合。

3.45

貯存storage

在適宜的條件下長時間中斷樣品、分析物或其衍生物（如染色切片或組織塊）的分析前工作流程，

以保持其特性。

在適宜的條件下維持生物材料的預(yù)期用途。

3.46

組織處理tissueprocessing

制備FFPE組織（3.17）的四個連續(xù)步驟：組織固定、脫水（3.10）、透明（3.7）和浸蠟（3.26）。

3.47

組織處理器tissueprocessor

用于組織固定、脫水、透明和浸蠟的自動化儀器。

3.48

組織切片tissuesection

使用專用切片切割設(shè)備（即切片機）切割組織產(chǎn)生的非常薄的組織片。

注：使用切片機切割FFPE組織（3.17），生成薄片（μm），將其安裝在載玻片上，用于原位檢測（3.27）技術(shù)。

3.49

確認validation

通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求己得到滿足的認定。

注：“已確認”一詞用于表明相應(yīng)的狀態(tài)。

3.50

核準verification

通過提供客觀證據(jù)，確認已滿足特定要求。

注1：術(shù)語“已確認的”用于表示相應(yīng)的狀態(tài)。

注2：確認可以包括以下活動：

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進行替代計算，

將新的設(shè)計規(guī)范與類似的經(jīng)驗證的設(shè)計規(guī)范進行比較，

進行測試和演示，以及文件發(fā)布前審核。

3.51

熱缺血warmischemia

失去正常血液供應(yīng)的組織從身體內(nèi)移除前的狀態(tài)。

3.52

工作流程workflow

完成任務(wù)所需的一系列活動。

4總則

關(guān)于醫(yī)學實驗室質(zhì)量管理體系的一般說明，特別是標本采集、接收和處理（包括避免交叉污染）參

見GB/T22576.1-2018中4.2、5.4.4、5.4.6或GB/T27020-2016中第8章和7.2。有關(guān)實驗室設(shè)備、試劑和消

耗品的要求應(yīng)遵循GB/T22576.1-2018中5.3、和或GB/T27020-2016中6.2的要求。

診斷工作流程的所有步驟都會影響最終分析測試結(jié)果。因此，應(yīng)驗證和確認整個工作流程，包括生

物分子穩(wěn)定性和樣品貯存條件。應(yīng)記錄不能完全控制的工作流程步驟（例如：熱缺血），并進行風險評

估，（包括其對分析測試性能的潛在影響），并制定預(yù)防措施，以確保所需的分析測試性能。

在將組織固定在標準緩沖福爾馬林溶液中之前，生物分子的原位/亞細胞定位、數(shù)量、構(gòu)象和結(jié)合

狀態(tài)可能會發(fā)生變化，例如生物分子降解、洗滌、交聯(lián)和隨后的合成改變（例如基因誘導、基因下調(diào)、

RNA降解、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的變化以及生化途徑和能量狀態(tài)的變化）。這些效應(yīng)取決于熱缺血和冷缺

血的持續(xù)時間，以及福爾馬林固定前的環(huán)境溫度。此外，在不同患者/供體的組織中效應(yīng)可能有所不同。

一般來說，組織標本固定前的熱缺血和冷缺血持續(xù)時間越長，環(huán)境溫度越高，生物分子圖譜和原位

/亞細胞定位發(fā)生變化的風險就越高。

注3：生物分子的數(shù)量、修飾和原位/亞細胞定位也可能有所不同，這取決于組織的來源和類型、潛在疾病、手術(shù)程

序、藥物治療方案以及用于麻醉或治療伴隨疾病的藥物、以及組織自體內(nèi)取出后所處的不同環(huán)境條件。長時

間的冷缺血導致蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白含量的變化[5,6,48]。將標本低溫（如4℃）保存能夠減弱這種影響[7]。RNA

圖譜可能會發(fā)生顯著變化（例如基因誘導、基因下調(diào)、RNA降解）[8,9]，這取決于熱缺血和冷缺血持續(xù)時間以

及福爾馬林固定前的溫度。較長的熱缺血和冷缺血持續(xù)時間所導致的DNA、序列或拷貝數(shù)的改變（例如比較

基因組雜交（CGH）圖譜）是未知的[10]。DNA甲基化模式會隨著缺血而改變[11]。

在相關(guān)情況下，應(yīng)記錄熱缺血持續(xù)時間（如大腫瘤切除）。如果無法避免冷缺血（如福爾馬林固定

前向?qū)嶒炇疫\輸?shù)倪^程），應(yīng)記錄其持續(xù)時間，并記錄標本容器周圍的溫度。

福爾馬林固定（包括福爾馬林溶液的質(zhì)量、樣品與福爾馬林溶液的體積比、固定的時間和溫度）和

其他檢驗前過程會影響形態(tài)學[12]，引起生物分子的修飾，并影響原位檢測結(jié)果的分析測試性能。這些

檢驗前過程包括組織處理[13]、FFPE組織塊的儲存[13]、切片（包括載玻片類型的選擇、切片厚度、干

燥和未染色載玻片組織切片的儲存）。在原位檢測試驗的質(zhì)量控制和應(yīng)用中應(yīng)考慮到這一點。如需減少

9

GB/TXXXXX—XXXX

此類問題對原位檢測試驗的影響，可優(yōu)化FFPE組織的分析測試和/或載玻片固定FFPE組織切片的預(yù)處理

（例如抗原修復(fù)，預(yù)雜交;見6.10.3）。

由于分子變性[14]、蛋白質(zhì)交聯(lián)、表位丟失或“掩蔽”、抗體與表位結(jié)合的空間位阻干擾[3,15]），

導致FFPE組織中的免疫反應(yīng)性改變或喪失，會影響免疫組化。有證據(jù)表明，多數(shù)抗原（表位）即使不

能完全恢復(fù)，也可以通過抗原修復(fù)得到基本恢復(fù)[16,17]。因此，可以進行抗原修復(fù)以恢復(fù)FFPE組織中

的免疫反應(yīng)性和/或通過福爾馬林固定、組織處理和包埋來“回收”被“掩蔽”或修飾的表位。由于最

佳的抗原修復(fù)程序取決于所采用的分析前條件，因此應(yīng)在整個分析前和分析工作流程中驗證抗原修復(fù)要

求。

注4：廣泛的抗原修復(fù)可引起形態(tài)假象。

原位雜交會受到生物分子特性（如核酸完整性，核酸-核酸相互作用或核酸-蛋白質(zhì)相互作用）的

影響，可以采用針對特定分析前條件進行優(yōu)化的預(yù)雜交程序來逆轉(zhuǎn)這種影響。因此，應(yīng)在整個分析前工

作流程驗證預(yù)雜交程序的要求。

在整個檢驗前過程，應(yīng)采取預(yù)防措施避免不同標本/樣本之間的交叉污染（如在可行的情況下，使

用一次性材料或在處理不同標本/樣本之間進行適當?shù)那鍧嵆绦颍?，并避免標?樣本混在一起。

應(yīng)制定并遵守整個檢驗前過程的安全說明。標本采集、運輸和處理的安全要求應(yīng)符合相關(guān)ISO標準，

如ISO15189和ISO15190。

如果由于不滿足患者需求而未按照制造商的說明使用商業(yè)產(chǎn)品，則實驗室應(yīng)驗證并確認其預(yù)期用途。

其使用的責任和風險由用戶承擔。參見附件A。

5實驗室外部

5.1標本采集

5.1.1概述

標本采集宜考慮擬進行的分子檢驗的要求（例如疾病狀況，標本大小）（參見條款6）。

實驗室應(yīng)與臨床/手術(shù)室和醫(yī)生合作，制定患者/標本供者所需文件、標本采集、標本容器的選擇和

標簽以及標本運輸程序的說明。

5.1.2患者/標本供者的信息

文件記錄應(yīng)包括患者/標本供者ID，可以是代碼形式。

文件記錄宜包括但不局限于：

a)患者/標本供者的相關(guān)健康狀況，例如健康與否、疾病類型、伴隨疾病、人口學信息（如性別、

年齡等）；

b)組織采集前的常規(guī)醫(yī)學治療和特殊治療信息，例如麻醉劑、藥物、外科手術(shù)或診斷程序；

c)患者/標本供者相應(yīng)的知情同意。

5.1.3標本信息

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GB/TXXXXX—XXXX

文件記錄應(yīng)包括但不局限于：

a)手術(shù)標本：根據(jù)檢驗需求，可通過將缺血相關(guān)的血管結(jié)扎/鉗制時間點（通常為動脈鉗制時間）

記為體內(nèi)缺血（熱缺血）開始，以切除標本并從體內(nèi)取出為結(jié)束（見6.6），從而計算出熱缺

血持續(xù)時間。為了記錄熱缺血持續(xù)時間，需與手術(shù)室工作人員合作；

注：活檢組織的熱缺血可忽略不計。

b)尸檢標本：估計的死亡時間點（用于確定尸檢間隔）；從體內(nèi)取出組織的時間點和日期[以計

算冷缺血持續(xù)時間，最后以固定開始結(jié)束（見6.2）]，以及取出方法（例如，芯針活檢、切除、

活檢裝置采樣）；

c)組織類型、來源和狀況（例如病變組織、未受疾病影響的組織）的描述，包括外科醫(yī)師、放

射醫(yī)師或病理醫(yī)師在手術(shù)室內(nèi)外所做的任何標記；文件還應(yīng)包括負責標本采集的人員身份（例

如：姓名或代碼）。

5.1.4標本處理、儲存及運輸前準備

應(yīng)執(zhí)行以下步驟：

a)將標本從體內(nèi)取出后，記錄對其進行任何添加或修改，例如用于標本定向的標記（例如：油

墨標記、縫線）、切口、避免標本干燥的措施（如用等滲緩沖液保濕以防止標本表面干燥）；

b)根據(jù)適用的運輸法規(guī)選擇和使用用于運輸?shù)臉吮救萜骱桶b袋（如可密閉容器、真空包裝、

冷卻箱、儲運箱），所使用的標本容器應(yīng)能安全關(guān)閉。當使用預(yù)先裝有標準緩沖福爾馬林溶

液的標本容器時，應(yīng)遵循制造商的說明；

c)選擇和使用福爾馬林固定程序（如6.2所述），或在實驗室內(nèi)對組織進行福爾馬林固定時，選

擇和使用穩(wěn)定程序（如真空包裝、冷卻方法）進行運輸；根據(jù)6.2所述，如果福爾馬林固定在

實驗室外開始，則應(yīng)記錄時間和日期；

注：當組織解凍后，意外地冷凍組織（如錯誤地使用冷藏包）可能會導致生物分子降解及影響生物分子形態(tài)特征；

d)標本容器的標簽[例如患者ID，注冊號，醫(yī)院入院號，樣本類型及數(shù)量，器官組織來源]和附加

記錄信息[5.1.2,5.1.3,5.1.4a)-c)中規(guī)定的信息]。應(yīng)將兩個患者標識視為正確識別患者/標本供

者所需的最少信息量。標本容器的標簽[例如使用自粘標簽，手寫體，射頻識別設(shè)備（RFID），

預(yù)先貼標簽的容器，條形碼]，應(yīng)確保標本或樣本的可追溯性。

標本從體內(nèi)取出后，應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到標本容器中。然后維持容器溫度在2℃~8℃，最大限度地減少形

態(tài)和/或生物分子的變化。

來自同一患者/供體的、具有相似特征（宏觀外觀，組織類型，疾病狀態(tài)和解剖位置）的幾個標本

可以放入一個標本容器/容器隔室中。

應(yīng)監(jiān)控和記錄標本容器所處環(huán)境的溫度（例如不同房間儲存的溫度、運輸溫度；參見5.2）。如果

無法測量溫度，則應(yīng)估算溫度并記錄下來（如環(huán)境溫度，室溫或2℃~8℃）。

5.2運送要求

在標本尚未放入標準緩沖福爾馬林溶液之前，應(yīng)立即置于濕冰上或維持溫度在2℃~8℃情況下進行

運輸，以盡量減少形態(tài)和生物分子的變化。

注：有證據(jù)表明，在將樣本保存于生物樣本庫或用于組織病理學評估之前，在運輸過程[18]中將樣本置于4℃真空塑

料袋中，可以穩(wěn)定組織形態(tài)和生物分子。

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如果標本本在實驗室外已經(jīng)放入標準緩沖福爾馬林溶液中，運輸過程中的溫度不應(yīng)超過室溫。

以適當?shù)姆绞奖O(jiān)控和記錄溫度（例如通過溫度記錄儀進行）（參見5.1.4）。

與說明的任何偏離均應(yīng)加以描述并形成文件。

6實驗室內(nèi)部

6.1標本接收

應(yīng)記錄標本接收人員的身份信息（如姓名或編號）。

記錄標本到達的日期和時間，檢查和記錄所接收標本狀況（例如標簽、包括溫度在內(nèi)的運輸條件、

組織類型和標本數(shù)量、容器泄漏或破裂）。

與既定運輸程序的任何偏差都應(yīng)記錄（參見5.2）。應(yīng)制定處理不合格事件的程序。另請參閱ISO15189

相關(guān)信息。

6.2福爾馬林固定標本/樣本

本步驟適用于標本和從一個標本中取出的一個或多個部分。

固定劑選用標準緩沖福爾馬林溶液。

注1：在某些國家，標準緩沖福爾馬林溶液也稱中性緩沖福爾馬林（NBF）。

至少每周檢查一次標準緩沖福爾馬林溶液的pH值，或在使用前檢查一次（如果未使用并檢查超過

一周）。

注2：福爾爾馬林不穩(wěn)定（如甲醛可以氧化為甲酸）[19]。

注3：使用存放時間過久的福爾馬林溶液會導致甲酸的形成，從而降低pH值。并可能導致福爾馬林色素，其在組織

學切片中以黑色至棕色的無定形至微晶顆粒形式存在，是由酸作用于血紅蛋白產(chǎn)生的[20]。

應(yīng)執(zhí)行以下步驟：

a)記錄將組織標本或樣本放入標準緩沖福爾馬林溶液中的時間點（以便于計算總固定持續(xù)時間，

該時間以組織處理期間將樣本轉(zhuǎn)移到脫水試劑為終點；參見6.6）；

注1：福爾馬林固定的總時間可能會影響進一步的檢查，例如免疫組化技術(shù)[21]、基于核酸的分子檢查[22,23]。最佳

福爾馬林固定時間可能因組織類型和大小而異[48]。對于較大的手術(shù)標本，例如切除的肝臟，由于甲醛從組織

表面滲透到內(nèi)部，在肉眼檢驗之前可能會出現(xiàn)固定不均勻。

注2：對于手術(shù)標本，使用福爾馬林固定超過24h導致交聯(lián)強度升高，這可能會影響抗原決定簇的原位檢查（例如免

疫組化）[24]。在許多情況下，抗原修復(fù)可以逆轉(zhuǎn)這些作用[17]，但是廣泛的抗原修復(fù)也會導致人工偽像（例

如非特異性、假陽性染色及形態(tài)學）。

注3：由于福爾馬林固定開始于組織邊緣，過短的福爾馬林固定（在固定狀態(tài)下）會導致福爾馬林和酒精的混合固

定。在組織處理過程中，未固定的組織中心會因酒精（凝結(jié)）而發(fā)生固定[25]。

注4：制造商的安全數(shù)據(jù)表（MSDS）包含處理標準緩沖福爾馬林溶液的重要信息。

注5：甲醛是一種致癌的、有害的化合物，可以穿透組織并對生物分子進行化學修飾，其對于身體不同部位的危害

分級可能不同。

b)選擇用于固定的容器

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1)用于標本/樣本固定的容器的容量應(yīng)保證標本可以完全浸沒在標準緩沖福爾馬林溶液中。

并且標準緩沖福爾馬林溶液用量與組織的比例至少為10：1（體積比）[10]。如果原始標

本容器的容量未達到10:1的體積比，則應(yīng)將標本轉(zhuǎn)移到更大的容器中，以達到該比例。

更換的較大容器的標簽應(yīng)與原始樣本容器的標簽相同。標簽可以采用獨特的實驗室標本

識別號（病理病例號）；

注1：用于原位RNA檢驗的標本，通常使用15:1～20:1（體積比）[47]。

注2：有證據(jù)表明，在使用適當?shù)难b置或適當?shù)娜〔臅r，可以采用較低的福爾馬林與組織體積比（例如2：1或1：1）

[26-28]。

2)對于較大的標本，為確保其完全被福爾馬林固定，應(yīng)進行特殊的組織處理方法，如切開

實體器官（如二等分）或打開中空器官。在這種情況下，應(yīng)定期更換標準緩沖福爾馬林

溶液；

3)應(yīng)遵循制造商的說明使用預(yù)先裝滿標準緩沖福爾馬林溶液的標本容器；

4)用于固定的標本容器應(yīng)能安全關(guān)閉。

c)應(yīng)記錄福爾馬林溶液的組成、福爾馬林固定方法（如浸泡固定或超聲波組織固定）和使用條

件（如持續(xù)時間、溫度）。

注：傳統(tǒng)的浸泡固定通常在室溫下進行。福爾馬林注射、灌注及超聲波處理后有明顯的免疫組化染色優(yōu)勢[24,29,30]。

6.3標本的病理學評估和樣本的選擇

6.3.1概述

應(yīng)參照當?shù)?、國家或地區(qū)的法規(guī)。

需進行組織病理學診斷的離體組織標本的病理學的評估和記錄，以及從標本中選擇用于進一步加工

的樣本應(yīng)由具有行醫(yī)資格的病理學醫(yī)生（如獲委員會認證的）完成，或在其監(jiān)督或負責下完成。

注：特別是在疾病狀況下，組織的分子特征通常不是均勻分布的。如在腫瘤的中心和浸潤邊緣可以激活不同的分子

機制，并且腫瘤可以由不同分化等級的區(qū)域組成。

6.3.2宏觀評估

在福爾馬林固定之前和/或之后對手術(shù)標本進行宏觀評估時，應(yīng)檢查患者/供者身份信息（如姓名或

編號），患者/供者的出生日期，住院號和/或病理學病例號及標本的臨床信息（例如類型，大小，數(shù)量）

（見5.1.2和5.1.3）。

手術(shù)標本和所有宏觀發(fā)現(xiàn)應(yīng)根據(jù)各自醫(yī)學會（如病理學學會）的說明，并結(jié)合臨床信息和問題（如

病歷或臨床醫(yī)生的要求）進行適當描述。應(yīng)描述標本的解剖學定位。必要時可標記切除邊緣和其他重要

區(qū)域，有助于以后的顯微鏡檢查。以上應(yīng)記錄。

注：上述評估或記錄也可在實驗室外進行，如手術(shù)室。

6.3.3樣本的選擇

應(yīng)由具有行醫(yī)資格的病理學醫(yī)生（如獲委員會認證的）或在其監(jiān)督下為形態(tài)學、生物分子的原位檢

測以及進一步研究目的選取合適的標本部分。原位檢測的代表性樣品應(yīng)根據(jù)各醫(yī)學會的器官/疾病特定

說明進行采集（即取樣），并記錄。此外，對于某些原位檢測技術(shù)（如免疫組織化學），應(yīng)盡可能從含

有腫瘤和鄰近非腫瘤組織的腫瘤邊界采集樣本。

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注1：根據(jù)地方規(guī)定，病理學專家也可在實驗室外（如手術(shù)室）選擇合適的標本部位（參見5.1.3）。

如果從體內(nèi)取出的組織標本不需進行組織病理學診斷，那么該標本的評估及記錄、樣本的選擇與記

錄可以由病理醫(yī)生以外、其他具有資格的人員完成。

應(yīng)將照片和示意圖記錄。

樣本的大小應(yīng)與組織盒相適宜（最大約為3cmx2cmx0.5cm）。

如果標本和所選樣本尚未用福爾馬林固定，則應(yīng)立即將其放入標準緩沖福爾馬林溶液中，并按6.2

所述步驟進行。

如果標本在實驗室外，已被放置于福爾馬林中（見6.2），則應(yīng)將所選樣本轉(zhuǎn)移到組織盒中，并立

即轉(zhuǎn)移到標準緩沖福爾馬林溶液中，以避免樣本干燥。如果所選樣本尚未固定，則應(yīng)在福爾馬林中進行

后固定，這可以在組織盒內(nèi)進行。

當將從標本中取出的樣本轉(zhuǎn)運入組織盒時，應(yīng)記錄轉(zhuǎn)運時間點。組織盒中一個或多個樣本（如淋巴

結(jié)）的定位說明應(yīng)到位并遵循。

注2：原位檢測的樣本在組織盒和包埋模具中的方向決定了樣本的哪個部分首先被制成切片。將感興趣的組織表面

放置在盒中進行固定，并且當將組織放置在包埋模具中進行包埋時保持該方向。如果將多個組織（例如不同

水平的前哨淋巴結(jié)）放入一個固定盒中，并放入模具中進行包埋時，放置位置通常與組織病理學診斷有關(guān)。

每個組織盒貼有唯一標識符（如病理病例號、盒號、組織縮寫）。在后續(xù)所有程序中，不可擦除標

識符。唯一標識符應(yīng)可被人識別，并可輔以由自動打印機手動或電子打印的條形碼。

唯一標識符的最少應(yīng)包括：實驗室標本識別號（病理病例號）——包括年份、節(jié)段類型（手術(shù)、細

胞學等）；標本標識符——字母或數(shù)字；塊標識符——字母或數(shù)字。

可以使用其他標識符（例如實驗室名稱或標識符，用于區(qū)分不同組織類型、固定劑和/或病理信息

的彩色編碼盒）。

如果將從同一標本中取出的多個樣本裝在同一組織盒中，并且這些樣本具有不同特征（如組織類型、

疾病狀態(tài)、定位），則應(yīng)記錄。

6.4術(shù)中冷凍樣本的后固定

必要時，可將冷凍標本（如進行冷凍切片診斷后）放入標準緩沖福爾馬林溶液中進行后固定，以備

隨后進行石蠟包埋（如6.2所述）。

如果FFPE樣本/標本來源于冷凍組織，則應(yīng)記錄。

術(shù)中檢驗所用的殘余組織應(yīng)加工成石蠟切片，與冷凍切片結(jié)果進行比較。

6.5樣本脫鈣/軟化

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一些樣本，如骨、含骨或其他鈣化的（如腫瘤）或較硬的（如角化）樣本可能需要脫鈣或軟化，以

獲得足夠質(zhì)量的FFPE組織切片用于原位檢測技術(shù)。

脫鈣和/或軟化應(yīng)根據(jù)制造商說明或基于驗證和確認程序的書面說明進行。說明應(yīng)包括但不限于脫

鈣劑/軟化劑的類型和濃度，以及脫鈣/軟化的溫度和持續(xù)時間。應(yīng)將進行脫鈣和/或軟化的樣本記錄。

注1：有證據(jù)表明脫鈣程序會對原位檢測造成影響[24,31-33]。使用不同脫鈣試劑（如強無機物（如

鹽酸）或弱有機酸（如甲酸））的不同脫鈣方法（如在烘箱/水浴箱中孵育或超聲波加速）會對原位檢

測技術(shù)造成不同的影響[24,30]。脫鈣是在福爾馬林完全固定后、組織處理和包埋前進行的。

如果在福爾馬林固定后進行脫鈣，應(yīng)記錄組織從福爾馬林溶液轉(zhuǎn)移到脫鈣使用的第一種試劑（如脫

鈣劑或洗滌液）的日期和時間點，以便計算總固定時間。

如果標本在脫鈣后再次轉(zhuǎn)移到福爾馬林中，該時間點被記為繼續(xù)固定的開始時間。

注2：某些脫鈣劑可能需要先將福爾馬林洗凈后再轉(zhuǎn)移到脫鈣劑中，另一些則需要先將福爾馬林洗

凈后再轉(zhuǎn)移到脫水劑中（如將EDTA脫鈣的組織樣本直接放入70％（體積）的酒精中會導致EDTA沉淀）

[34]。

6.6組織處理及石蠟包埋

6.6.1概述

組織處理應(yīng)包括：脫水、透明、浸蠟等步驟，然后進行石蠟包埋。有些經(jīng)驗證的操作說明不包括透

明步驟。

注1：組織處理和石蠟包埋可影響已固定組織的形態(tài)和生物分子完整性。尤其是組織處理不充分（例如脫水不足、

浸蠟不完全）會導致組織偽像并損害原位檢測（例如染色弱、降解導致抗原丟失、非特異性反應(yīng)[24]）。

組織處理應(yīng)該在自動組織處理器中進行。如果手動進行組織處理（這與原位檢測制造商的說明并不

矛盾），則應(yīng)遵循實驗室自建的經(jīng)驗證和確認的程序。

應(yīng)存在組織處理和石蠟包埋的書面流程，并指明方法（如手動或自動）、儀器（如組織處理器和組

織包埋器的類型）、試劑（如脫水劑和石蠟的類型）和步驟/程序（試劑的使用順序、濃度、持續(xù)時間

和溫度）。在沒有制造商說明或其他正當理由的情況下，應(yīng)按照原位檢測制造商說明或經(jīng)實驗室驗證和

確認的程序進行，并進行記錄。附錄B提供了指南示例。

應(yīng)記錄標本或樣本從福爾馬林轉(zhuǎn)移到脫水劑（如含酒精溶液）的時間點和日期，以計算總固定時間。

根據(jù)組織處理器制造商的說明進行自動組織處理時，需定期更換所有試劑，并應(yīng)記錄（包括更換日

期和更換的試劑類型）。

注2：組織處理過程中的脫水劑和透明劑被先前步驟的殘留物稀釋，會導致從組織中去除水分的效率降低。特別是

在儲存期間，若組織中殘留的水分不能被石蠟替代，組織則易降解[10,35]。更換間隔取決于組織處理的次數(shù)和

上一次更換的日期。

注3：有的組織處理器具有自動試劑管理系統(tǒng)，用于測量試劑量并提示用戶已達到試劑的濃度閾值；有的組織處理

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器利用升高溫度和/或微波能量減少處理時間。

6.6.2脫水和透明

脫水應(yīng)使用一系列濃度逐漸增加至無水試劑（100％）的脫水劑（例如乙醇）溶液（見附錄B）。

注1：在組織處理過程中，通常使用乙醇作為脫水劑取代組織中的水，導致組織脫水。由于脫水和透明不完全而產(chǎn)

生的殘余水分會影響組織（包括生物分子）在儲存期間的質(zhì)量和穩(wěn)定性[10,13,25,35]。

注2：可以使用酒精或非酒精脫水劑（如乙醇、異丙醇、甲醇、乙二醇和變性醇），不同脫水劑可能對原位檢查產(chǎn)

生不同的影響[24,36]。

注3：脫水過度會導致組織收縮，使組織變硬變脆；長時間暴露于大多數(shù)的透明劑會導致組織變脆[36]；快速脫水（如

不采用濃度遞增的脫水劑）可促使組織/細胞變形。

6.6.3浸蠟和石蠟包埋

石蠟的種類、浸蠟和包埋的時間和溫度會影響生物分子質(zhì)量。應(yīng)使用成分標準化、熔化溫度低的石

蠟。

注1：通常石蠟低熔化溫度為50℃~56℃之間。有證據(jù)表明，高熔點（65℃）聚合石蠟可以影響原位檢測（如IHC）

[24]。

石蠟包埋的書面步驟（見6.1.1）應(yīng)說明標本/樣本在組織盒中正確定位。

注2：標本/樣本在組織盒中的方向不正確會導致在切片過程中遺漏或損壞診斷上重要的組織元素。它還會影響切片

的難易程度，從而影響組織切片的質(zhì)量。

注3：某些組織可能需要特殊定向（如血管等管狀結(jié)構(gòu)，需切割管腔橫截面；，如皮膚或腸等上皮組織，需切割所

有相關(guān)層，并避免在切片過程中壓迫組織）。

注4：在組織處理和包埋過程中，可使用相關(guān)產(chǎn)品（如凝膠、海綿、墊、紙）穩(wěn)定標本/樣本在組織盒中的位置和方

向。

含有包埋組織的組織盒應(yīng)通過適當方法（例如包埋用冷板）快速冷卻。

注5：石蠟的快速冷卻可確保形成小的晶體結(jié)構(gòu)，進行FFPE組織切片時會產(chǎn)生較少的人工偽像[36]。

6.7FFPE組織塊儲存

已包埋的、福爾馬林固定的組織完全冷卻后，可以直接切片（見6.8）進行后續(xù)原位檢測或存儲。

FFPE組織一般存在多種儲存方式，例如以FFPE組織塊形式儲存、或以（置于載玻片、未染色）切

片形式儲存（見6.8）[37]。

FFPE組織塊的儲存時間及條件（例如濕度，溫度，暴露于氧氣）會隨著時間的流逝而對原位檢測

結(jié)果產(chǎn)生影響[13,37,38]。雖然存儲幾乎不影響形態(tài)，但隨著存儲時間的增加，生物分子的完整性、免

疫反應(yīng)性和核酸原位雜交信號會降低，特別是多年儲存的FFPE組織塊[13,24,38]。

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為了減少對于生物分子完整性、免疫反應(yīng)性和核酸原位雜交信號的影響，F(xiàn)FPE組織塊應(yīng)在室溫或

最好在較低溫度下干燥保存[46]。

注1：較低的儲存溫度（例如2℃至8℃、–20℃）可減緩RNA[39,40,46]、DNA和蛋白質(zhì)的降解以及免疫反應(yīng)性隨時

間的流逝。

注2：如果未將FFPE組織塊干燥儲存和/或組織處理不充分，可能會增加生物分子的降解和免疫反應(yīng)性的喪失，并且

會刺激真菌和細菌的生長。

注3：用石蠟覆蓋切好的FFPE組織塊有利于長期儲存。

應(yīng)建立一個系統(tǒng)用于長期保存FFPE組織塊。儲存位置、儲存溫度、樣本/標本的取出、樣本/標本的

用途、樣本/標本的歸還都應(yīng)記錄。

6.8FFPE組織塊的切片及載玻片切片的儲存

免疫組化和原位雜交的FFPE組織切片應(yīng)新鮮切取，如果無法避免存放載玻片切片，則應(yīng)將其干燥

存放在4℃或更低的溫度。不得超過原位檢測制造商說明書或?qū)嶒炇艺f明書中規(guī)定的總儲存時間限制。

應(yīng)記錄應(yīng)用的儲存條件（如濕度、溫度、防止暴露于氧氣的措施（例如在氮氣下儲存或用石蠟覆蓋））。

應(yīng)記錄儲存開始日期（即切片/黏附在載玻片日期），以便計算總儲存時間。

注1：將切片暴露于空氣可導致生物分子氧化，從而導致抗原改變。

注2：未染色切片在儲存期間比FFPE組織塊更容易發(fā)生生物分子降解；載玻片未染色FFPE組織切片的保存會影響抗

原的免疫組化染色。并非所有抗原因抗原衰變都受到一樣的影響，大多數(shù)抗原保存1個月～2個月沒有不利影

響，然而某些抗原保存1周～3周后，會削弱檢測能力[24]。

載玻片的類型（如電化載玻片、黏附載玻片）、FFPE組織切片的厚度、干燥（如持續(xù)時間、溫度

及方法）和未染色載玻片的儲存（如持續(xù)時間、條件）都可能影響原位檢測的結(jié)果[24,30]，并應(yīng)符合原

位檢測制造商的說明。如果不具備原位檢測制造商的說明，或者未解決上述所有因素，則實驗室應(yīng)驗證

和確認程序，并提供及遵循書面說明。

如果由原位檢測的外部人員切割切片，則應(yīng)提前闡明諸如載玻片類型和粘合性、切片厚度或原位檢

測方法對切片儲存時間的敏感性等問題。

在條件允許時，載玻片上應(yīng)清楚地標明組織盒上的信息，并附加染色/檢測系統(tǒng)上的信息。如果從

一個FFPE組織塊上切下多個部分并裱貼到不同的載玻片上，則這些切片的順序應(yīng)包括在標簽中（即載

玻片號）。一張載玻片只能放一名患者的切片。這不適用于對照切片。

標簽應(yīng)與預(yù)期的原位檢測兼容（如能經(jīng)受原位檢測期間使用的試劑和溫度）。如果要對染色的切片

進行數(shù)字化處理，則載玻片標簽應(yīng)為人和機器可識別的（如條形碼）。應(yīng)在切片時進行標記，并與相應(yīng)

FFPE組織塊的標簽相匹配。

RNA原位檢測技術(shù)要求與組織切片接觸的設(shè)備（如切片機刀片、載玻片）和試劑（水浴箱中的水）

不含RNase。

切片前應(yīng)對FFPE組織塊進行修剪。

用于原位檢測的切片厚度應(yīng)符合原位檢測制造商或?qū)嶒炇艺f明書的規(guī)定。

注3：常用切片的厚度為2μm～5μm，部分原位檢測技術(shù)和/或組織類型可能需要其他厚度。FFPE組織塊溫度，旋

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轉(zhuǎn)速度，間隙角設(shè)置等因素會影響所達到的實際厚度。

切片機的維護或服務(wù)應(yīng)定期進行并記錄（包括但不限于所服務(wù)的儀器和服務(wù)日期）（請參閱ISO

15189）。

展片水槽的水溫應(yīng)比石蠟的熔點低5℃至10℃，并避免過熱。應(yīng)將使用前溫度記錄。展片水槽應(yīng)在

每塊組織塊（如：組織薄片）撈片之后進行清潔，以除去組織碎片和碎屑。

在使用時，如果將FFPE組織塊浸泡在可能影響原位檢測的液體（例如用于表面脫鈣或組織軟化的

液體）中，應(yīng)進行記錄。

應(yīng)記錄載玻片F(xiàn)FPE組織切片的干燥溫度、持續(xù)時間和方法（例如烘箱干燥，（強制）風干，自動

染色機干燥模塊）。

注4：干燥溫度和持續(xù)時間會根據(jù)組織的類型有所不同。原位檢測技術(shù)的建議干燥時間/溫度為60℃處理1小時。已證

明溫度高于68℃會降低IHC染色強度[24]，導致形態(tài)改變（如核）或生物分子丟失（如脂肪）[41]。

6.9載玻片切片的脫石蠟和再水化

載玻片固定的組織切片應(yīng)在原位檢測前不久進行脫石蠟處理，或在必須進行的預(yù)處理之前（參見第

6.10節(jié)）（如IHC的抗原修復(fù)或ISH的預(yù)雜交）進行脫石蠟處理。鑒于原位分析測試的不同分析性能，可

能需要對脫蠟切片進行再水化（如用組織學染色液染色或用抗體孵育）或省略再水化（如某些原位雜交

試驗）。如果需要再水化，則應(yīng)在脫蠟后直接進行。

如果原位檢查制造商提供了脫蠟和再水化說明，則應(yīng)遵循。

如果原位檢查制造商未提供脫石蠟和再水化說明，實驗室應(yīng)根據(jù)檢驗性能規(guī)范制定并驗證其自身的

脫石蠟和再水化說明。這應(yīng)包括但不限于試劑類型、方法（如手動、自動）、裝置（如烘箱、自動染色

機）、持續(xù)時間和溫度。應(yīng)提供并遵循書面和必要的圖示說明。

注1：自動染色機搭載多種功能，可用于載玻片切片的干燥、脫石蠟和再水化。

注2：不完全脫石蠟會影響某些原位檢測技術(shù)[42]，脫蠟過程中的高溫也會對某些原位檢測技術(shù)造成影響。

6.10用于原位檢測技術(shù)的載玻片切片的預(yù)處理

6.10.1概述

一些原位檢測技術(shù)和分析測試可能需要對載玻片上脫石蠟和再水化的FFPE組織切片進行預(yù)處理，

以逆轉(zhuǎn)福爾馬林固定、組織處理和包埋造成的修飾（例如暴露抗原/表位和靶核酸）。預(yù)處理往往整合

在原位檢測技術(shù)中。

6.10.2基于抗體或其他親和結(jié)合劑的原位檢測技術(shù)的預(yù)處理

對于基于抗體或其他親和結(jié)合劑的原位檢測技術(shù)（如免疫組化、免疫熒光染色），預(yù)處理可能包括

抗原修復(fù)（如熱誘導表位修復(fù)（HIER））。

如果原位檢查制造商提供了關(guān)于抗原修復(fù)的說明，則應(yīng)遵循這些說明。

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如果原位檢查制造商未提供關(guān)于抗原修復(fù)的說明，則檢驗實驗室應(yīng)設(shè)計、指定、開發(fā)、驗證和確認

程序。這應(yīng)包括但不限于抗原修復(fù)的類型（如熱誘導或蛋白水解誘導的抗原決定簇修復(fù)），設(shè)備（例如

所使用的自動染色機、微波爐、水浴箱和壓力鍋）以及抗原修復(fù)的試劑（例如緩沖液的類型和pH、酶

的類型和濃度），持續(xù)時間和條件（例如持續(xù)時間、溫度和瓦特）[3]。應(yīng)為每個分析測試制定有關(guān)預(yù)

處理程序的說明并遵守。

應(yīng)將所應(yīng)用的預(yù)處理程序記錄。

6.10.3基于雜交的原位檢測技術(shù)的預(yù)處理

對于基于雜交的原位檢測技術(shù)（如熒光或顯色原位雜交），預(yù)處理包括組織和細胞的透化、靶標的

暴露和封閉（也稱為預(yù)雜交）。

如果原位檢查制造商提供了關(guān)于預(yù)處理的說明，則應(yīng)遵循這些說明。

如果原位檢查制造商未提供關(guān)于預(yù)處理的說明，則檢驗實驗室應(yīng)設(shè)計，指定，開發(fā)，驗證和確認程

序。應(yīng)包括但不限于預(yù)處理試劑（如酶和緩沖液的類型和濃度）、步驟、持續(xù)時間、溫度和裝置。應(yīng)為

每個分析測試制定有關(guān)預(yù)處理程序的說明并遵守。

應(yīng)將所應(yīng)用的預(yù)處理程序記錄。

6.10.4其他原位檢測技術(shù)的預(yù)處理

在經(jīng)典的組織學染色和組化技術(shù)之前通常無需任何預(yù)處理。其他原位檢測方法，例如可以映射到

FFPE組織切片特定區(qū)域的生物分子的分子分析（如原位測序、成像質(zhì)譜分析）可能需要對組織切片進

行特殊預(yù)處理。

6.11原位檢測分析前階段的質(zhì)量評估

質(zhì)量評估應(yīng)遵循檢驗制造商的說明。如果說明未包含有關(guān)質(zhì)量評估的信息，則實驗室應(yīng)制定并驗證

質(zhì)量評估程序。質(zhì)量評估可包括但不限于組織切片（如切片厚度、變形、褶皺及包括染色質(zhì)外觀在內(nèi)的

細胞形態(tài)）以及生物分子的質(zhì)量和完整性的質(zhì)量評估。生物分子的質(zhì)量和完整性可通過使用對分析前步

驟敏感的抗原的抗體或通過對從切片中分離的生物分子的質(zhì)量評估（如從切片中分離的RNA的完整性）

來評估。

組織切片內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)可作為原位檢測試驗的內(nèi)部陽性和陰性對照。對于免疫組化檢查，陽性對照

組應(yīng)與患者切片放置在相同的載玻片上。數(shù)字化原位檢測圖像（如使用玻片掃描儀生成）的分析比顯微

鏡分析需要更嚴格的分析前質(zhì)量標準。在對FFPE組織切片進行原位檢測、將玻片數(shù)字化、并通過數(shù)字

圖像上的機器學習算法進行分析時，需要更嚴格的分析前質(zhì)量標準。

比如，病理學專家可識別固定或切割導致的人工偽像，并在診斷時適當考慮這些因素。而機器學習

算法產(chǎn)生的結(jié)果可能受到嚴重影響，從而導致錯誤的評估[49]。

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A

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附錄A

（資料性）

有關(guān)實驗室開發(fā)的原位檢測試驗的驗證和確認的建議

用于驗證的案例應(yīng)反映與臨床檢測案例相同的檢驗前過程。

關(guān)于驗證實驗室開發(fā)的原位檢測試驗的檢驗前程序的分析示例：

1.將新試驗結(jié)果與形態(tài)學和預(yù)期結(jié)果相關(guān)聯(lián)；

2.針對同一組織，將新試驗結(jié)果與以前在同實驗室用有效分析法所得的試驗結(jié)果進行比較；

3.針對相同組織集，將新試驗結(jié)果與在另一實驗室使用驗證分析測試所得的試驗結(jié)果進行比較；

4.將新試驗結(jié)果與先前確認的非免疫組化試驗結(jié)果進行比較；

5.如果存在正式能力測試程序所得的組織分級結(jié)果，則將新試驗結(jié)果與其比較[43,44]。

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B

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附錄B

（資料性）

組織處理的操作指南示例

注意：不同組織類型（如腦組織）和標本類型（如活檢標本和手術(shù)標本）的組織處理持續(xù)時間和溫

度有所不同[45]。

1.3.7%（質(zhì)量比）標準緩沖福爾馬林溶液環(huán)境溫度處理2h

2.3.7%（質(zhì)量比）標準緩沖福爾馬林溶液環(huán)境溫度處理1h

3.70%（體積比）乙醇環(huán)境溫度處理1h

4.95%（體積比）乙醇環(huán)境溫度處理1h

5.100%（體積比）乙醇環(huán)境溫度處理45min

6.100%（體積比）乙醇環(huán)境溫度處理1h

7.100%（體積比）乙醇環(huán)境溫度處理1h

8.透明劑（二甲苯）環(huán)境溫度第一次處理1h

9.透明劑（二甲苯）環(huán)境溫度第二次處理1h

10.蠟（石蠟）第一次58℃處理30min

11.蠟（石蠟）第二次58℃處理1h

12.蠟（石蠟）第三次58℃處理1.5h

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參考文獻

[1]Nature.com.Post-translationalmodifications.

/subjects/post-translational-modifications.

[2]ESPINAVEDMISTONKH,HEIBYM,PIEROBONM,SCIROM,MERRITTB,ETAL.Aportraitof

tissuephosphoproteinstabilityintheclinicaltissueprocurementprocess.Mol.Cell.Proteomics.2008,7p