微生物工程考試考點總結全套

微生物工程考試考點總結一.名詞解釋微生物工程：指采用現(xiàn)代工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種技術。拮抗作用：當多種物質聯(lián)合作用時，其中的一種物質會通過一定渠道降低另一種物質的作用（通常是有害作用），使機體維持平衡狀態(tài)。例如當人體血糖含量較高時，胰島素分泌增加，胰高血糖素分泌減少，兩種激素桔抗作用使血糖的含量降低。當血糖含量較低時，胰島素分泌減少，胰高血糖素分泌增加，結果是使血糖的含量升高。生物測定：利用某些生物對某些物質(如維生素、氨基酸)的特殊需要，或對某些物質(如激素、抗生素、藥物等)的特殊反應來定性、定量測定這些物質的方法。載體：可以插入核酸片段、能攜帶外源核酸進入宿主細胞，并在其中進行獨立和穩(wěn)定的自我復制的核酸分子。質粒：細胞中獨立于染色體之外，能夠獨立復制的共價閉合環(huán)狀DNA.菌落原位雜交：是將細菌從培養(yǎng)平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與放射性同位素標記過的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。效價：抗生素的計量單位，是抗生素等生物制品有效成分含量高低的指標，可以通過儀器的方法測得。復制起始位點：指在DNA轉錄時RNA聚合酶與之結合，起始轉錄的特定核苷酸序列，決定轉錄起始位點和轉錄頻率。BOD（生物需氧量）：通常表示水中有機物等需氧污染物質含量的一個綜合指示。水中有機物由于微生物的生化作用進行氧化分解，使之無機化或氣體化時所消耗水中溶解氧的總數(shù)量。半連續(xù)發(fā)酵：指在發(fā)酵過程的后期周期性地放出部分含有產(chǎn)物的發(fā)酵液，然后再補加相同體積的新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法。這種發(fā)酵可以重復多次。半連續(xù)發(fā)酵semi-continuousfermentation：是指在補料－分批發(fā)酵的基礎上，間歇地放掉部分發(fā)酵液的培養(yǎng)方法。補充發(fā)酵：指在發(fā)酵過程中以一定的速率排出成熟的發(fā)酵液，同時以相同的速率加入新鮮培養(yǎng)基，使整個發(fā)酵過程基本維持在穩(wěn)定期的發(fā)酵方法。抗生素：是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學物質。下游處理：特指生物工程產(chǎn)品生產(chǎn)程序中的后期加工。指的是生物產(chǎn)品特別是發(fā)酵液的分離、純化、加工、劑型制備等，直至達到產(chǎn)品質量要求的整個處理過程。二.簡答題1.

基因工程在微生物工程的應用表現(xiàn)在哪些方面？每一方面舉例1-2個說明。答：①生產(chǎn)藥物疫苗中的引用：這類基因工程藥物的生產(chǎn)是當前基因工程最重要的應用領域，發(fā)展迅速。例如：有抗腫瘤.抗病毒功能干擾素.白細胞等；用于生理調節(jié)的胰島素和其他生長激素等。②改造傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵菌種：例如生產(chǎn)抗生素.氨基酸.有機酸.酶制劑等，這類菌種基本上都要經(jīng)過長期的誘變或重組育種，生產(chǎn)性能很難再大幅度的提高。要打破這一局面，必須使用基因工程的手段才能解決。目前在氨基酸.酶制劑等領域已有大量成功的例子。③環(huán)境保護：在環(huán)境保護方面，利用基因工程可培育同時能分解多種有毒物質的遺傳工程菌。如：1975年，有人把降解芳烴，萜烴和多環(huán)芳烴的質粒轉移到能降解Pesudomonas.sp（一種假單胞菌）中，獲得了能同時降解4種烴類的‘超級菌’，它能把原油2/3的烴分解掉。2.

作為基因工程載體系統(tǒng)，其載體需要具備哪些條件？答：載體：外源DNA不易進入受體細胞，他需要與某種工具重組后才能導入宿主細胞，以進行克隆和保存或者表達外源DNA中的遺傳信息。這種將外源DNA攜帶進受體細胞的工具稱為載體。理想的載體應具備以下幾個條件：①能穩(wěn)定復制，目的基因的插入基本不影響載體的復制能力；②應具有一個以上的單一限制酶位點，以便目的基因的插入；③具有某些容易檢測的遺傳標記，以便利用這些標記篩選克?。虎懿迦肽康幕虻姆容^寬；⑤分力量小，拷貝數(shù)高；⑥從生物防護角度考慮是安全的。3.

質粒構建的策略要考慮哪些方面。答：（1）構建的質粒克隆載體應該是能在轉化的受體細胞中進行有效的復制，并且作為質?？寺≥d體，希望在受體細胞中有較多的拷貝數(shù)。為此，構建的質粒克隆載體必須含有能在受體細胞內(nèi)有效復制的質粒復制起始位點（ori），最好是松弛型質粒的復制起始位點。（2構建的質?？寺≥d體必須含有允許外源DNA片段克隆的位點，并且這樣的克隆位點應盡可能多。（3）構建的質粒克隆載體必須含有供選擇克隆子的標記基因。一個質粒克隆載體最好有兩種選擇標記基因，并且在選擇標記基因區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點。當外源DNA片段插入克隆位點后，標記基因失活，成為選擇克隆子的依據(jù)。（4）構建的質粒克隆載體DNA分子應盡可能的小。由于質粒轉化受體細胞的效率同質粒DNA分子大小相關，小分子質粒的轉化效率高，大于15kb的質粒轉化效率明顯下降。質粒克隆載體DNA分子小，意味著可承載較大的外源DNA片段。（5）根據(jù)特殊需要，使構建的質粒克隆載體中組裝各種“元件”（小DNA片段），構建成不同用途的質粒克隆載體。4.

目的基因的檢測與鑒定要開展哪些方面著手？簡述之。答：①耐藥性標志篩選擇（插入失活法）：如果克隆載體攜帶耐藥性標志基因，轉化后只有含有耐藥基因的轉化子細菌才能在含有該抗生素的培養(yǎng)基上面形成菌落，這樣可以將轉化菌與非轉化菌區(qū)別開來。如果重組DNA的外源基因插入基因內(nèi)，標志基因失活。②標志補救：如果克隆基因能夠在宿主菌表達，且表達產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補，那么久可以利用營養(yǎng)突變菌株進行篩選，這就是標志補救。③分子雜交法：這是利用32P標記的探針與轉移至硝酸纖維膜上的轉化子DNA或克隆的DNA片段進行分子雜交，直接選擇并鑒定目的基因。④PCR篩選法：根據(jù)目的基因兩端已知核苷酸序列設計合成一對引物，依據(jù)實驗目的的與要求的不同，快速抽提宿主細胞質粒DNA或染色體DNA作為模板進行PCR擴增反應，將擴增反應產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，若出現(xiàn)特異片段的擴增條帶，即說明該克隆為陽性克隆。⑤免疫學方法：如果克隆基因的蛋白產(chǎn)物已知的，可利用特異抗體與目的基因表達產(chǎn)物相互作用進行篩選，因此屬非直接選擇法。⑥DNA序列分析法：對DNA分子序列鑒定是驗證外源基因是否正確的最確鑿證據(jù)。5.

限制性核酸內(nèi)切酶的類型有哪些？各有何主要特征。答：限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。根據(jù)限制酶的結構,輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型、第二型及第三型。第一型限制酶：兼具限制切割和修飾兩種功能，但是識別位點并非嚴格專一，需要Mg2+.ATP和S-腺苷酰蛋氨酸做為催化反應的輔因子，在講解DNA時，伴有ATP的水解。第二型限制酶：其限制-修復系統(tǒng)由一對酶（同一序列的限制酶和甲基化酶）組成，分子量較小，僅需要Mg2+做為輔因子，不需要ATP，識別位點專一，并在識別位點內(nèi)講單鏈切斷。因此二型限制酶在基因工程應用廣泛，通常說的限制酶就是Ⅱ型酶。第三型限制酶：兼具限制切割和修飾兩種功能，識別位點專一，但是切點不專一，往往不在識別位點內(nèi)部，需要Mg2+.ATP和S-腺苷酰蛋氨酸做為催化反應的輔因子，在講解DNA伴隨ATP水解。6.在基因工程中，以細菌轉化為例，說明其轉化的原理和技術？答：在基因工程中經(jīng)歷了獲取目的基因及其與載體連接后，接下來是重組DNA分子導入受體細胞。重組DNA導入細菌細胞的方法包括：轉到作用和轉染與轉導作用。以轉化作用為例：轉化是微生物細胞直接吸收外源DNA的過程。①化學轉化法：在分子克隆中，宿主細胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組DNA分子的敏感細胞才能用于轉化，這是細胞稱為感受態(tài)細胞。0℃的CaCl2低滲溶液中，細胞呈球形（感受態(tài)）；經(jīng)42℃短時間熱沖擊后，細胞可吸收外源DNA；在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時，球狀細胞復原，并分裂增殖；在選擇型平板上可選出轉化子。②電擊轉化法：除化學法轉化細菌外，還可采用高壓脈沖電擊轉化法。電擊法不需要預先誘導細菌的感受態(tài)，只是依靠短暫的電擊來促使DNA進入細菌。7．在載體遺傳標記檢測中，簡述顯色篩選法的基本原理答：顯色篩選法的基本原理：顯色篩選法可以區(qū)分轉化子與非轉化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應）等8.簡述發(fā)酵工程的種子質量控制有哪些主要因素。答：影響種子質量因素：原材料質量原材料質量波動引起種子質量不穩(wěn)定波動的主要原因無機離子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也會影響孢子的質量）培養(yǎng)溫度溫度過低，菌種生長發(fā)育緩慢溫度過高會使菌絲過早自溶濕度濕度低，孢子生長快濕度大孢子生長慢通氣與攪拌足夠的通氣量，以報紙那個菌種代謝的正常，提高種子的質量攪拌可提高通氣效果，促進生長繁殖，過度攪拌導致培養(yǎng)液大量涌泡，液膜表面的酶容易氧化變性，泡沫過多增加染菌機會，增加能耗。絲狀微生物不宜劇烈攪拌。斜面冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力有較大影響，冷藏時間越長，生產(chǎn)能力下降越多。培養(yǎng)基有較完全和豐富的營養(yǎng)物質，糖分少，需充足的氮源和生長因子，無機氮源比例大；各種營養(yǎng)物質的濃度不必太高；供孢子用的種子培養(yǎng)基，可添加易被吸收用的碳源和氮源；應考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。pH原則是獲得最大比生長速率和適當?shù)木?；培養(yǎng)最后一級種子的培養(yǎng)基的pH應接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，以便種子能盡快適應新的環(huán)境。影響種子質量的因素有哪些：1.培養(yǎng)基2.培養(yǎng)條件3.接種量4.孢子的質量保證種子質量措施：1.菌種穩(wěn)定性檢查2.無雜菌檢查9、種子擴大培養(yǎng)的目的與要求、一般步驟。答：目的：首先是出于接種量的需要與菌種的馴化，同時對于縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平也有幫助。要求：對于種子應當具備以下要求：總量及濃度能滿足要求。生理狀況穩(wěn)定，個體與群體區(qū)隔明顯?；盍姡品N發(fā)酵后，能夠迅速生長。無雜菌污染。種子擴培的一般過程是：斜面菌種→一級種子培養(yǎng)（搖瓶）→二級種子培養(yǎng)(種子罐)→

發(fā)酵14簡述總大腸桿菌檢測主要操作步驟

答：3.1檢樣稀釋

3.1.1以無菌操作將檢樣25mL(或g)放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)予置適當數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器,以8000-10000r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。

3.1.2用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。

3.1.3另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。

3.1.4根據(jù)要求或對檢樣污染情況的估計,選擇三個稀釋度,每個稀釋度,接種3管。

3.2乳糖發(fā)酵試驗

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1℃溫箱內(nèi),培養(yǎng)24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報告為大腸菌群陰性,如有產(chǎn)氣者,則按下列程序進行。

3.3分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1℃溫箱內(nèi),培養(yǎng)18-24h,然后取出,觀察菌落形態(tài),并做革蘭氏染色和證實試驗。

3.4證實試驗

在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發(fā)酵管,置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。3.5報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù),查MPN檢索表,報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。三.論述題1.微生物基因工程菌構建的基本原理與過程答：基本原理：①DNA是遺傳物質；②DNA雙螺旋結構；③中心法則和遺傳密碼；④基因是可以切割和轉移的。技術原理：①提供外源基因的劑量；②篩選、修飾重組基因表達的轉錄調控元件；③修飾構建蛋白質生物合成的翻譯調控元件；④基因工程菌的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)。過程：①目的基因的獲得；②DNA與載體體外連接；③導入受體細胞；④篩選、鑒定重組子；⑤目的基因的表達、檢測。4、發(fā)酵過程泡沫產(chǎn)生的原因有哪些？試述泡沫的控制途徑。答：1、通氣攪拌的強烈程度通氣大、攪拌強烈可使泡沫增多，因此在發(fā)酵前期由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗少，培養(yǎng)基成分豐富，易起泡。應先開小通氣量，再逐步加大。攪拌轉速也如此。也可在基礎料中加入消泡劑。2、培養(yǎng)基配比與原料組成培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，黏度大，產(chǎn)生泡沫多而持久，前期難開攪拌。3、菌種、種子質量和接種量菌種質量好，生長速度快，可溶性氮源較快被利用，泡沫產(chǎn)生幾率也就少。菌種生長慢的可以加大接種量4、滅菌質量培養(yǎng)基滅菌質量不好，糖氮被破壞，抑制微生物生長，使種子菌絲自溶，產(chǎn)生大量泡沫，加消泡劑也無效。5、細胞破碎與沉淀技術有哪些？試述超聲波破碎原理。答：機械法：高壓勻漿破碎法，振蕩珠擊破碎法，高速攪拌珠研磨破碎法，超聲波破碎法。非機械法：滲透壓沖擊破碎法，凍融破碎法，酶溶破碎法，化學破碎法，去垢劑破碎法。超聲波破碎原理：將電能通過換能器轉換為聲能，這種能量通過液體介質而變成一個個密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生的象小炸彈一樣的能量，從而起到破碎細胞等物質的作用。6