生物潤(rùn)滑油生物降解性測(cè)定法

1生物潤(rùn)滑油生物降解性測(cè)試法本文件規(guī)定了生物潤(rùn)滑油生物降解性的測(cè)定方法。本文件適用于對(duì)比評(píng)估生物潤(rùn)滑油在水中的生物降解性和標(biāo)準(zhǔn)參考材料的生物降解性。本方法不適用于水溶性或揮發(fā)性材料。2術(shù)語(yǔ)與定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。3方法概要將含有礦物培養(yǎng)液（3.2.1）、試驗(yàn)油和接種物（3.2.3）的試驗(yàn)燒瓶與含有毒化樣的燒瓶一起放置在培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時(shí)間為0d和21d。平行放置裝有參比油（3.2.2）代替試驗(yàn)油的燒瓶。在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，對(duì)燒瓶中的內(nèi)容物進(jìn)行酸化、聲波振動(dòng)并使用1,1,2-三氯三氟乙烷萃取。然后通過紅外光譜分析提取物，測(cè)量在2930cm-1波長(zhǎng)處CH2-CH3的C-H鍵的最大吸收峰值。吸收值用于計(jì)算毒化瓶和試驗(yàn)瓶的殘余油含量，求出試驗(yàn)油的生物降解率。4儀器與材料4.1儀器4.1.1燒瓶：500mL，最小26口窄頸燒瓶，帶玻璃塞。4.1.2干凈棉花：用于在培養(yǎng)過程中塞住燒瓶口。4.1.3分液漏斗：500mL。每次重復(fù)試驗(yàn)單獨(dú)使用一個(gè)漏斗。注1：試驗(yàn)前，必須徹底清潔所有玻璃器皿，且不含碳?xì)浠衔?。適合的清洗方法是使用洗滌劑清洗，用自來水徹底沖洗，然后用去離子水或蒸餾水徹底沖洗，最后用萃取溶劑沖洗后徹底干燥。（標(biāo)準(zhǔn)級(jí)二氯甲烷是可接受的交替沖洗溶劑）。水中應(yīng)無(wú)碳?xì)浠衔铩Ｗ?：用于制備毒化樣（6.1.4）的抗生素，可以吸附在玻璃器皿上。因此，為避免污染，建議每次連續(xù)運(yùn)行時(shí)，對(duì)毒化樣始終使用相同的燒瓶。2T/CPCIF0090—20214.1.4離心機(jī)：可選。低溫離心機(jī)，最大離心力為4000g，運(yùn)行10min。注3：高轉(zhuǎn)速和高溫可能會(huì)殺死細(xì)菌。4.1.5超聲波振蕩器：輸出功率為100W-200W，頻率為20kHz-40kHz。4.1.6恒溫震蕩培養(yǎng)箱：轉(zhuǎn)速為120r/min-220r/min。4.1.7紅外光譜儀：?jiǎn)喂馐螂p光束。4.2材料4.2.1礦物培養(yǎng)液Mineralmedium礦物培養(yǎng)液的制備方法如下：將下述各種鹽的混合物用去離子水或蒸餾水溶解并稀釋至1L溶液，制備溶液A、B、C、D。(1)溶液A：8.50gKH2PO4，21.75gK2HPO4，33.40gNa2HPO4?2H2O，15.00gNH4Cl。(2)溶液B：22.50gMgSO4?7H2O。(3)溶液C：36.40gCaCl2?2H2O。(4)溶液D：0.75gH3BO3，3.00gFeSO4?7H2O，0.10gZnSO4?H2O，0.50gMnSO4?4H2O，0.05gCuSO4?5H2O，0.10gCoSO4，0.05g(NH4)6Mo7O24?4H2O。從A、B、C、D4種溶液中各取1mL，然后用蒸餾水或去離子水稀釋成1L溶液得到礦物培養(yǎng)液。注5：水合化合物可由其他水合物或同等比例的無(wú)水材料代替。注6：溶液D在使用前必須搖勻，因?yàn)榻饘冫}會(huì)析出并引起渾濁。溶液D應(yīng)每6個(gè)月制備一次。4.2.2參比油4.2.2.1RFLP4.2.2.2RFDE注7：參比/標(biāo)準(zhǔn)油數(shù)據(jù)需滿足表1中規(guī)定的質(zhì)量。表1參比油3注8：可以通過以下方式獲得參比油：天津內(nèi)燃機(jī)研究所，150220820394.2.3接種物試驗(yàn)中使用的接種物的細(xì)菌水平應(yīng)在104CFU/mL-107CFU/mL（CFU為菌落形成單位，ColonyFormingUnit）范圍內(nèi)?？赏ㄟ^使用以下接種物實(shí)現(xiàn)：（a）污水處理廠一級(jí)（機(jī)械）出水或（b）生活污水處理廠的二級(jí)（生物）出水。有必要，可將接種物濃縮。接種物應(yīng)立即用粗糙的折疊濾紙過濾。如果不立即使用，則應(yīng)在約6°C的溫度下儲(chǔ)存最多48h（包括收集時(shí)間）?？赏ㄟ^離心或膜過濾（最大孔徑0.22μm）來調(diào)節(jié)粗濾接種物的濃度。必須用載玻片計(jì)數(shù)菌落。4.2.4萃取溶劑應(yīng)使用光譜等級(jí)為1,1,2-三氯三氟乙烷（C2Cl3F3）。純度應(yīng)以十六烷為參照物，通過紅外光譜（HC含量小于1μg/g）進(jìn)行檢查。4.2.5母液用萃取溶劑將15g待測(cè)潤(rùn)滑油配制成100mL試驗(yàn)油母液。用參比油配制類似的參比油母液。4.2.6控制油溶液在25mL萃取溶劑中加入50μL參比油母液配制成控制溶液。4.2.7鹽酸水溶液c（HCl）=1mol/L。5試劑5.1青霉素鈉：高純。將7.00g青霉素鈉溶于去離子水，定容至100mL，配成抗生素水溶液。5.2氯化鈉：分析純。警告：必須消除在紅外光譜中具有2930±10cm-1的CH吸收峰的材料的污染。尤其是必須消除所有油脂和硅的來源。4T/CPCIF0090—20216試驗(yàn)步驟6.1準(zhǔn)備試驗(yàn)樣樣品按可分為“0d樣”和結(jié)束降解周期的“21d樣”。6.1.1中性樣：由150mL礦物培養(yǎng)液（見4.2.1）和1mL接種物組成；最少需要2個(gè)平行樣,作為“0d樣”。6.1.2試驗(yàn)油樣：向中性樣（見6.1.1）中加入50μL試驗(yàn)油母液（見4.2.5制備試驗(yàn)油樣?！?d樣”和“21d樣”分別最少需要3個(gè)平行樣。6.1.3參比油樣：在中性樣燒瓶中加入50μL參比油母液，制備參比油樣。“0d樣”和“21d樣”分別最少需要3個(gè)平行樣。6.1.4毒化樣:在相應(yīng)的試驗(yàn)油和參比油樣瓶中添加抗生素水溶液（見5.1），但不加菌液。最少各需要2個(gè)平行樣，作為“21d樣”。6.2試驗(yàn)樣的培養(yǎng)除用于測(cè)試“0d樣”的燒瓶外，所有燒瓶均應(yīng)用干凈棉花塞住瓶口，在25℃±1℃的黑暗條件下，搖擺振蕩培養(yǎng)21d，搖床轉(zhuǎn)速120r/min~220r/min。試驗(yàn)開始后應(yīng)準(zhǔn)備“0d樣”，0d中性樣、0d試驗(yàn)油樣在接種后立即萃取。6.3萃取培養(yǎng)期結(jié)束后，向試驗(yàn)燒瓶中加入30gNaCl、1mL1mol/LHCl溶液，并在超聲波振蕩器上超聲振蕩2min-3min，超聲頻率為20kHz-40kHz（輸出100W–200W）、溫度為20℃-25℃,通過搖動(dòng)溶解鹽。聲波振動(dòng)會(huì)使容器的內(nèi)容物變熱。在下一階段進(jìn)行前，應(yīng)注意將其冷卻至室溫，使萃取劑不會(huì)蒸發(fā)過多。每個(gè)試驗(yàn)瓶中加入25mL萃取劑，用力搖晃1min–2min。隨后，容器的內(nèi)容物被轉(zhuǎn)移到分離漏斗中，漏斗用塞子密封，不再進(jìn)一步晃動(dòng)。等待液體分層，然后移取出清亮的溶劑相（在分層界面沒有任何的乳化液），并且直接轉(zhuǎn)移到10mm×10mm的紅外比色皿中。6.4紅外光譜分析用紅外分析儀測(cè)定萃取液的紅外圖譜，波數(shù)范圍0cm-1-4000cm-1，采用基線法對(duì)紅外圖譜在2930cm-1±10cm-1處吸收峰的吸光度進(jìn)行定量處理。7生物降解性的計(jì)算7.1紅外光譜測(cè)定控制溶液的IR吸收率Ec，用于驗(yàn)證試驗(yàn)的有效性。7.2紅外光譜測(cè)定中性樣的IR吸收率，計(jì)算兩個(gè)中性樣吸收率的平均值En。7.3紅外光譜測(cè)定試驗(yàn)油樣、參比油樣及其毒化樣“0d樣”液的IR吸收率E0。7.4計(jì)算E0與En之差，并計(jì)算算術(shù)平均值XE。7.5由式(1)計(jì)算變化系數(shù)(Cv),其中S為標(biāo)準(zhǔn)偏差。57.6紅外光譜測(cè)定各“21d樣”液的IR吸收率E，由式(2)計(jì)算各“21d樣”液的殘油含量。T或P=（E-En）/XE×100% （2）P和T分別為毒化樣和測(cè)試油樣中殘油的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%7.7按式(3)計(jì)算生物降解率(B,%)。B=(P-T)/P×100% B是測(cè)試樣生物降解率，%不活躍的接種物、不充分的實(shí)驗(yàn)室條件和不合適的試驗(yàn)材料可導(dǎo)致不正確的生物降解率值。因此，必須滿足以下要求。8.1“0d樣”的變化系數(shù)（Cv）必須<5%。如果沒有，則必須報(bào)告數(shù)值并顯示結(jié)果。8.2本試驗(yàn)要求參比油的XE須介于Ec的90%～110%之間，否則，整個(gè)試驗(yàn)運(yùn)行無(wú)效。8.3用參比油獲得的生物降解率必須在參考/標(biāo)準(zhǔn)油數(shù)據(jù)表中規(guī)定值的再現(xiàn)性范圍內(nèi)。如果參比油的值超出再現(xiàn)性范圍，則整個(gè)試驗(yàn)運(yùn)行無(wú)效。8.4參比油的中毒試驗(yàn)瓶21d后殘油含量的平均值必須大于80%。否則，最終的測(cè)試運(yùn)行無(wú)效。8.5試驗(yàn)材料中毒試驗(yàn)瓶21d后殘余油含量的平均值必須大于80%，否則，試驗(yàn)方法不適用于測(cè)定試驗(yàn)材料的生物降解性。8.6每次測(cè)試必須測(cè)量參比油RFDE（3.2.2）9結(jié)果9.1結(jié)果必須以表格形式呈現(xiàn)，給出所附示例（表2）中概述的信息表2試驗(yàn)油的生物降解率//01------2------3------S------------1----2----32S---------