NY∕T 551-2017 雞產(chǎn)蛋下降綜合征診斷技術(shù)

雞產(chǎn)蛋下降綜合征診斷技術(shù)2017-06-12發(fā)布中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布 I雞產(chǎn)蛋下降綜合征診斷技術(shù)本標準規(guī)定了產(chǎn)蛋下降綜合征的臨床診斷和實驗室診斷(病毒分離、血凝和血凝抑制試驗及PCR下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法4.1.1雞群在產(chǎn)蛋高峰期(27周齡～49周齡)產(chǎn)蛋下降15%~50%,一般持續(xù)4周~10周產(chǎn)蛋逐漸恢4.1.2雞蛋破損率5%～20%。雞群出現(xiàn)4.1中任何一種臨床癥狀和/或剖檢出現(xiàn)4.2中的病理變化，可判定為疑似產(chǎn)蛋下降綜合15.1.1試劑磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/L,pH7.2),配制方法見附錄A的A.1。5.1.2樣品的采集和處理按照NY/T541的規(guī)定進行樣品采集，選擇下列1種或2種樣品：a)撲殺疑似EDSV感染雞，取適量輸卵管和卵泡膜樣品，研磨。加PBS制成1:5混懸液后凍融3次，3000g離心10min,取上清，加入青霉素(終濃度為1000IU/mL)和鏈霉素(終濃度為b)采集劣質(zhì)蛋清，加等量PBS,并加入青霉素(終濃度為1000IU/mL)和鏈霉素(終濃度為1000μg/mL),37℃作用1h,5.1.3鴨胚接種及尿囊液收獲0.2mL樣品(5.1.2)經(jīng)尿囊腔接種鴨瓜，另設(shè)接種PBS的鴨胚做對照，37℃孵育。棄掉48h內(nèi)死亡的鴨胚，收獲48h～120h死亡和存潔的鴨胚尿囊液。5.2分離物血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗鑒定5.2.1.2.1EDSV標準抗原。5.2.1.2.2磷酸鹽緩忡液(PBS,0.01mol/L,pH7.2),配制方法見A.2。5.2.1.2.31%雞紅細胞懸液，配制方法見附錄B。5.2.1.3血凝試驗操作步驟5.2.1.3.1取96孔上型反立板，用做量移液器在1孔～12孔每孔加PPS5.2.1.3.2吸取25C準書原或者傳檢尿零液的能懸液加入第1孔中，吹打次～次，充分混勻。入到第3孔，依次進行系列合比稀釋到第11孔，最后從第11孔吸取25山棄之，設(shè)第12孔為PBS對照。5.2.1.3.4每孔再加25LPBS。5.2.1.3.6振蕩混勻反應(yīng)混合液。20℃~25℃下靜置40min后觀察結(jié)果，或4℃靜置60min,PBS對照孔的紅細胞呈明顯的紐扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。5.2.1.4結(jié)果判定結(jié)果判定細則如下：a)在PBS對照孔出現(xiàn)紅細胞完全沉淀的情況下，將反應(yīng)板傾斜，觀察各檢測孔紅細胞的凝集情況。以紅細胞完全凝集的病毒尿囊液最大稀釋倍數(shù)為該抗原的血凝滴度，以使紅細胞完全凝集的病毒尿囊液的最高稀釋倍數(shù)為1個血凝單位(HAU)。b)如果尿囊液沒有血凝活性或血凝效價小于4log2,則用初代分離的尿囊液在SPF鴨胚或非免疫鴨胚中繼續(xù)傳代兩代。若血凝試驗檢測仍為陰性，則判定產(chǎn)蛋下降綜合征病毒分離結(jié)果為陰性。c)對于血凝試驗呈陽性的樣品，應(yīng)采用EDSV標準陽性血清進一步做血凝抑制試驗，并與NDV2和AIV陽性血清(H7亞型和H9亞型AIV陽性血清)進行鑒別診斷。5.2.2血凝抑制試驗5.2.2.1材料5.2.2.1.196孔V型微量反應(yīng)板。5.2.2.1.2微量移液器。5.2.2.2.3其他陽性血清：新城疫病毒(NDV)陽性血清，禽流感病毒(AIV)陽性血清(H7亞型和H95.2.2.34個血凝單位(4AU)的EDSY杭原制備根據(jù)5.2.1測定的病毒尿液的耳A效價，推定AHAU猶原的稀釋倍數(shù)配制抗原工作濃度。按下列方法計算，如尿囊液中病毒抗原的自A效價為910g2,其/AU為71og2,則舟尿囊液稀釋128倍即5.2.2.4血凝抑制試驗操作步驟5.2.2.4.2根據(jù)血費式驗結(jié)果配制4HAU抗原(見5.2.2.3)。5.2.2.4.3取96孔V型做最反應(yīng)板，用移液器在第1孔～第11孔各加大25tLPEs,第12孔加入505.2.2.4.4在第1孔加不25ALEDSV標準陽讓而清，充分混勻后移出25書2孔，倍比稀釋至第室溫下(20℃~25℃)靛的不多于n,4℃不少子60min。5.2.2.4.6每孔加人25的1%對紅細胞懸液，輕晃混勻后，室溫(20℃)靜置40min,或4℃靜置60min。當PBS對照孔紅細胞呈明顯紐扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。5.2.2.5與新城疫和禽流感鑒別診斷應(yīng)以NDV和AIV陽性血清對分離物做鑒別診斷，用NDV陽性血清和/或AIV陽性血清代替EDSV標準陽性血清，進行血凝抑制試驗(見5.2.2.4)。NDV陽性血清和AIV陽性血清應(yīng)不能對分離物產(chǎn)生血凝抑制，表1中示例結(jié)果表示EDSV分離結(jié)果陽性。表1應(yīng)用血凝抑制試驗鑒定分離物H?亞型AIV陽性血清十十3全不凝集(紅細胞完全流下)的陽性血清最高稀釋倍數(shù)。當陰性血清對標準抗原的HI滴度不大于2log2,陽性血清對標準抗原的HI滴度與已知滴度相差在1個稀釋度范圍內(nèi)，并且所用b)尿囊液血凝效價≥4log2,且EDSV標準陽性血清對其血凝抑制效價≥4log2時判產(chǎn)蛋下降綜5.3.1.1去離子水(dH?O)按照GB/T6682的規(guī)定制備。5.3.1.2PCR擴增用DNA聚合酶(商品化試劑)。5.3.2儀器5.3.2.3小型離心機樣品的采集和處理選擇下列1種或2種：a)取接種樣品后48h～120h死亡或存活的鴨胚尿囊液于微量離心管中，3000g離心5min,取DNA提取試劑盒，按試劑盒說明書方法提取上述a)和/或b)樣品病毒基因組以及陽性對EPF:5'-TAATTTTCTCGGGACTTTCG-3'(上游引物);表2PCR反應(yīng)體系配置表5.3.4.4設(shè)EDSV基因組為陽性對照，陰性尿囊液提取的DNA為陰性對照，平行加樣，體系同4標準分享吧5.3.4.6PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR反應(yīng)管在電泳鑒定前可置2℃~8℃冰箱中保存。5.3.5.1配制1×TAE緩沖液(見A.3.2),制備2%瓊脂糖凝膠(見A.3)。5.3.5.2取10μLPCR產(chǎn)物EDSV陽性對照應(yīng)有大小約0.43kb(431符合5.3.6.1條件：臨床診斷符合第4章中規(guī)定的臨床癥狀和病理變化，5.2和/或5.3試驗為陽性結(jié)果，可判定為產(chǎn)561%雞紅細胞懸液制備采集至少3只SPF公雞或無產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、禽流感病毒和新城疫病毒抗體的非免疫雞的抗凝血液，放入離心管中，加入3倍～4倍體積的PBS混勻，以2000r/min離心5min～10min。去掉血成體積分數(shù)為1