維生素類藥物的分析

第十四章維生素類藥物的分析維生素：是維持人體正常代謝機(jī)能所必需的微量營養(yǎng)物質(zhì)。人體不能合成維生素。

VitA、D2、D3、E、K1

等脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、葉酸、煙酸、泛酸分類：-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:第一節(jié)維生素A的分析全反式維生素A325.5100%全反式新維生素Aa32875%2－順新維生素Ab320.524%4－順新維生素Ac310.515%2，4－順異維生素Aa32321%6－順異維生素Ab32424%2，6－順

相對(duì)生物效價(jià)順反異構(gòu)（一）結(jié)構(gòu)：具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)VitA2VitA3共軛多烯側(cè)鏈易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)鯨醇環(huán)氧化物VitA醛VitA酸CHCl3（二）性質(zhì)1.溶解性：易溶于有機(jī)溶劑和植物油等，不溶于水2.不穩(wěn)定性3.紫外吸收特性4.與三氯化銻呈色（一）三氯化銻反應(yīng)條件：無水、無醇CHCl3二、鑒別試驗(yàn)SbCl3水SbOCl乙醇可使碳正離子的正電荷消失藍(lán)色紫紅BP（2008）λmax為326nm一個(gè)吸收峰UV法（二）λmax為350～390nm三個(gè)吸收峰去水VitA（VitA3）↓VitAUSP顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值BP

對(duì)照品法顯色劑三氯化銻TLC法（三）立體異構(gòu)體氧化產(chǎn)物及光照產(chǎn)物合成中間體去氫維生素A（VitA2）去水維生素A（VitA3）UV法（三點(diǎn)校正法）（一）含量測定三、三點(diǎn)校正法1.前提條件：（1）雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減小；（2）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。測定對(duì)象：VitA醋酸酯第一法等波長差法第二法等吸收比法(皂化法)測定對(duì)象：VitA醇2.波長的選擇：（1）

1VitA的max（如VitA酯328nm）（2）

23

分別在

1的兩側(cè)各選一點(diǎn)第二步：求3、測定法（1）基本步驟:

第一步：A選擇，A328測定或A328校正第三步求效價(jià)第四步：求標(biāo)示量％A*D*換算因數(shù)*W＝W*100*標(biāo)示量×100％換算因數(shù)：單位E數(shù)值所相當(dāng)?shù)男r(jià)數(shù)（由純品計(jì)算而得）

判斷是否在326～329nm之間改用第二法是否

求算并與規(guī)定值比較1、維生素A醋酸酯-第一法（等波長差法）A值的選擇：

規(guī)定值差值

判斷差值是否超過03%－15%－3%第二法第二法

計(jì)算A328（校正）

用A328計(jì)算有超過0.02無超過f

VitAD膠丸中VitA的含量測定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.08262g/丸）的內(nèi)容物0.2399g至250ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一20ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度為A300：0.354A316

：0.561A328：0.628A340：0.523A360：0.216A300/A328：0.555A316/A328：0.907A328/A328：1.000A340/A328：0.811A360/A328：0.299求本品中維生素A的含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.833A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====水溶性脂溶性2、維生素A醇-等吸收比法（皂化法、6/7A法

判斷

max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定

計(jì)算是否

0.73

0.7303%－3%f（二）高效液相色譜法色譜柱：硅膠；流動(dòng)相：正己烷-異丙醇（997：3）檢測波長：325nm流速:1.2ml/min內(nèi)標(biāo)：VA醋酸酯三氯化銻比色法（三）優(yōu)點(diǎn)：簡便快速λmax618nm～620nm缺點(diǎn)：呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性標(biāo)準(zhǔn)曲線法氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨鹽)第二節(jié)維生素B1的分析HClCl-一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）結(jié)構(gòu)1.溶解性：易溶于水，水溶液呈酸性。3.UV共軛雙鍵λmax=246nm二、性質(zhì)2.硫色素反應(yīng)4.與生物堿沉淀試劑反應(yīng)5.氯化物的特性專屬性反應(yīng)二、鑒別試驗(yàn)（一）硫色素?zé)晒夥磻?yīng)硫色素，藍(lán)色熒光＋2HVitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)S元素反應(yīng)（三）其他反應(yīng)H+Cl-三、含量測定冰醋酸+醋酐，電位法指示終點(diǎn)（一）非水溶液滴定法UV法（二）=421A=ECL片劑、注射劑NaOH（三）硫色素?zé)晒夥ㄔ?.+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇SdAb對(duì)照液供試液dSbAC樣′--=×C標(biāo)特點(diǎn)3、（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）專屬性強(qiáng)，氧化產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物不干擾，可用于制劑分析，體液分析等。第三節(jié)維生素C的分析L－抗壞血酸結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、（一）結(jié)構(gòu)二烯醇內(nèi)酯兩個(gè)手性碳（C4,C5）（二）性質(zhì)1.溶解性：易溶于水水溶液呈酸性2.酸性：一元酸，C3－OH的pKa=4.17，C2－OH的pKa=11.573.旋光性：手性C（C4、C5）4.還原性5.水解反應(yīng)：6.具糖的性質(zhì)：具糖類的性質(zhì)與反應(yīng)7.UV特征**有活性有活性無活性二烯醇結(jié)構(gòu)-還原反應(yīng)利用還原性：與氧化劑的反應(yīng)鑒別試驗(yàn)二、（一）與AgNO3反應(yīng)（二）與2，6-二氯靛酚反應(yīng)氧化型還原型與堿性酒石酸銅反應(yīng)USP與KMnO4反應(yīng)（三）與其他氧化劑反應(yīng)四、薄層色譜法:Rf值（藍(lán)色）50℃(吡咯)（五）糖類的反應(yīng)BP0.01mol/LHCl（六）UV三、雜質(zhì)檢查（一）溶液的澄清度與顏色檢查（二）鐵、銅離子的檢查維生素C原料藥片劑注射劑維生素C原料藥糠醛縮合呈色原子吸收法（三）草酸的檢查：氯化鈣指示劑淀粉（一）碘量法四、含量測定原理：利用Vc強(qiáng)的還原性H+

取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6。2、方法原料藥（2）酸性環(huán)境稀醋酸

（1）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定

趕走水中O2減少O2的干擾3、討論4.附加劑干擾的排除片劑——過濾注射劑

——抗氧劑

——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a(二)2，6-二氯靛酚滴定法1、原理2、方法自身指示終點(diǎn)法（2）快速滴定2min內(nèi)（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）亦可剩余比色測定（定量過量）（測剩余染料）3、討論（4）缺點(diǎn)

需經(jīng)常標(biāo)定貯存≤一周不穩(wěn)定專屬性強(qiáng)，多用于含Vc的制劑和食品的分析（5）優(yōu)點(diǎn)（三）高效液相色譜法血漿中維生素C的測定(穩(wěn)定性）標(biāo)準(zhǔn)溶液包括樣品預(yù)處理過程均需加入偏磷酸，偏磷酸同時(shí)可用于血樣中的蛋白沉淀；當(dāng)天取血當(dāng)天測定；處理好的樣品亦需冰箱保存第四節(jié)維生素D的分析一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）結(jié)構(gòu)維生素D2(麥角骨化醇)維生素D3(膽骨化醇)1.性狀：無色針狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末；無臭，無味。2.溶解性：宜溶于有機(jī)溶劑，在植物油中略溶，在水中不溶。3.不穩(wěn)定性：含有多個(gè)烯鍵，所以極不穩(wěn)定，宜氧化變質(zhì)，效價(jià)降低，毒性增強(qiáng)。（二）性質(zhì)4．旋光性維生素D26個(gè)手性碳原子維生素D35個(gè)手性碳原子5．顯色反應(yīng)：甾類化合物氯仿溶液黃色紅色紫色綠色6．紫外吸收特性：無水乙醇265nm

醋酐硫酸二、鑒別試驗(yàn)

（一）顯色反應(yīng)1．與醋酐-濃硫酸反應(yīng)

氯仿溶液黃色紅色紫色綠色醋酐硫酸2．與三氯化銻反應(yīng)本品1,2-二氯乙烷

三氯化銻試液

橙紅色

粉紅色3．其它顯色反應(yīng)

維生素D

三氯化鐵

橙黃色

二氯丙醇乙酰氯綠色（二）比旋度鑒別無水乙醇溶液

維生素D2

比旋度為＋102.5°至＋107.5°維生素D3

比旋度為＋105°至＋112°（三）其它鑒別方法薄層色譜法、HPLC法制備衍生物測熔點(diǎn)紫外、紅外吸收光譜

（四）維生素D2、D3的區(qū)別反應(yīng)維生素D2

維生素D3

96%乙醇

10ml取0.1ml

乙醇1ml和85%硫酸5ml

紅色λmax570nm

黃色

λmax495nm

三、雜質(zhì)檢查（一）麥角甾醇的檢查維生素D290%乙醇溶液

洋地黃皂苷溶液不得發(fā)生渾濁或沉淀（二）前維生素D的光照產(chǎn)物四、含量測定正相高效液相色譜法（一）維生素D測定法

含量以單位表示每單位相當(dāng)于維生素D0.025μg注意：計(jì)算的是維生素D及前維生素D經(jīng)折算成維生素D的總量測定在半暗室及避免氧化的情況下進(jìn)行第一法：無干擾雜質(zhì)第二法：有VA及其他雜質(zhì)干擾第三法：用第二法時(shí)，前VD峰受雜質(zhì)干擾僅VD峰可分離

第一法內(nèi)標(biāo)物：鄰苯二甲酸二甲酯色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：填充劑：硅膠流動(dòng)相：正己烷-正戊醇（997：3）檢測波長：254nm無干擾雜質(zhì)維生素D3△光照前維生素D3反式維生素D3維生素D3速甾醇D3與維生素D3的比保留時(shí)間分離度＞1.0

＞1.0溶液組成先后進(jìn)樣5次，維生素D3峰面積的RSD≤2.0%0.50.61.01.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)校正因子測定：維生素D的校正因子:f1=Asmi/Aims前維生素D折算成維生素D的校正因子:f2=（Asmr-f1msAr1）/（Ar2ms）含量測定：計(jì)算維生素D及前維生素D折算成維生素D的總量mi=（f1Ai1+f2Ai2）ms/As第二法第一步：皂化提取供試品OH-加熱回流冷卻乙醚提取乙醚提取液揮干乙醚殘?jiān)状既芙夤┰嚾芤篈有VA及其他雜質(zhì)干擾第二步：分離收集供試品溶液ARP-HPLC維生素D前維生素D維生素A及其他雜質(zhì)疊峰分離收集供試品溶液B維生素D及前維生素D第三步：按第一法進(jìn)行含量測定（內(nèi)標(biāo)法）揮干內(nèi)標(biāo)的正己烷溶液溶解第三法第一步：皂化提取同第二法得供試品溶液A第二步：供試品溶液ARP-HPLC維生素D前維生素D維生素A及其他雜質(zhì)疊峰分離供試品溶液C收集揮干異辛烷溶解90℃、1.5h揮干正己烷溶解前維生素D維生素D第三步：用第一法色譜條件按外標(biāo)法計(jì)算含量用第二法時(shí)，前VD峰受雜質(zhì)干擾苯并－二氫吡喃醇第五節(jié)維生素E的分析

一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）結(jié)構(gòu)名稱R1R2相對(duì)活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***生物效價(jià)右旋體：消旋體=1.4：10dl－α－生育酚醋酸酯（二）性質(zhì)1、溶解性：易溶于有機(jī)溶劑，不溶于水4、UV2、水解性：酯鍵易水解△3、氧化性75℃15′（一）硝酸反應(yīng)橙紅色二、鑒別試驗(yàn)（橙紅色）生育紅生育酚HNO3強(qiáng)氧化劑三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應(yīng)△[O]（二）生育酚對(duì)-生育醌紅色Fe3+[O]λmax=284nmλmin=254nm0.01%無水乙醇中UV法（三）薄層板硅膠G展開劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）TLC法（四）（五）其他鑒別方法

紅外、氣相色譜法（二）生育酚

三、雜質(zhì)檢查

1.原理：游離生育酚還原性，硫酸鈰滴定2.試劑：硫酸鈰滴定液（0.01mol/L）

指示劑：二苯胺（亮黃→灰紫）（一）酸度：游離醋酸四、含量測定GC法（一）GC特點(diǎn)1、選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強(qiáng)→衍生化。易受樣品蒸氣壓限制固定液→硅酮（OV-17）擔(dān)體→硅藻土或高分子多孔小球柱溫→265℃檢測器→氫火焰離子化檢測器(FID)內(nèi)標(biāo)→正三十二烷內(nèi)標(biāo)法加校正因子定量2、VitE測定的色譜條件幾種常用的固定相非極性：OV-1、SE-30、HP-1（100%二甲基聚硅氧烷），分析：溶劑、石油產(chǎn)品、藥物，按沸點(diǎn)出峰；一般使用溫度：-60℃~340℃。非極性：SE-54、HP-5、DB-5（5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷），