飼料及飼料原料中嘔吐毒素的快速篩查 膠體金快速定量法

飼料及飼料原料中嘔吐毒素的快速篩查膠體金快速定量法范圍本標準規(guī)定了用膠體金免疫層析法快速篩查測定飼料及飼料原料中嘔吐毒素，為定量篩查方法。本標準適用于玉米、小麥、大米、黃豆、豆粕、花生粕、DDGS等原料中及以玉米粉，小麥粉為主要基質(zhì)的飼料成品中嘔吐毒素的快速定量篩查。定量檢測限為0.5mg/kg(ppm)，檢測范圍為0.5mg/kg(ppm)—5.5mg/kg(ppm)。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備原理本方法應用了免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，標記針對嘔吐毒素的單克隆抗體，用噴金法固定于硝酸纖維素（NC）膜上，同時，在硝酸纖維素（NC）膜的顯色區(qū)域有兩個條帶：質(zhì)控帶和檢測帶，質(zhì)控條帶上包被有嘔吐毒素抗原，檢測條帶上包被有抗嘔吐毒素單克隆抗體的二抗。試樣提取液中的嘔吐毒素與檢測條中膠體金微粒上的單克隆抗體發(fā)生反應，形成氯金酸-抗體-抗原聚合物，此聚合物和剩余的氯金酸-抗體聚合物在側(cè)流作用下移動，當?shù)竭_質(zhì)控線時，質(zhì)控條帶上包被的抗原與剩余的氯金酸-抗體聚合物結(jié)合發(fā)生呈色反應，顏色深淺與試樣中嘔吐毒素含量負相關(guān)，而氯金酸-抗體-抗原聚合物繼續(xù)在側(cè)流作用下移動，到達檢測條帶后，與檢測條帶上的二抗形成氯金酸-抗體-抗原&二抗的聚合物，此條帶的顏色同試樣中的嘔吐毒素含量正相關(guān)。由于試樣中的嘔吐毒素的含量一定，質(zhì)控帶的顏色和檢測帶的顏色此消彼長，呈相關(guān)性。等試驗反應平衡后，用讀數(shù)儀掃描檢測條上顯色區(qū)域內(nèi)檢測條帶和質(zhì)控條帶顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置曲線計算出試樣中嘔吐毒素含量。試劑和材料除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682二級水的規(guī)定。膠體金免疫層析快速篩查組件（參見附錄A）。嘔吐毒素殘留檢測試紙條。樣本提取液。0.1%的TritonX-100水溶液：量取1L實驗用溶液，加入1gTritonX-100，混勻。商品試劑盒中提供此溶液。氫氧化鈉（NaOH1mol/L）：稱取40g氫氧化鈉，加水定容至1000ml，混勻。鹽酸（HCL，1mol/L）：量取83.33mLρ=1.18g/mL的鹽酸，加水定容至1000mL，混勻。儀器和設備天平：感量0.01g。渦旋儀。離心機：轉(zhuǎn)速≥3000r/min。微量移液器：20μL～200μL。聚苯乙烯離心管：50mL。讀數(shù)儀：可測定并顯示膠體金定量檢測條的測定結(jié)果。試樣制備與保存試樣制備按GB/T20195要求制備試樣。試樣保存將試樣于-10℃～-20℃下避光保存。分析步驟試樣提取稱取(1.00±0.01)g飼料樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，加入15mL樣品提取緩沖液（2.1.3），將瓶塞蓋緊，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min，取100μL上清液待測。非谷物基質(zhì)，如果上清液pH值小于6或大于8，則需要用1mol/L氫氧化鈉溶液（4.2）或1mol/L鹽酸溶液（4.3）調(diào)節(jié)pH至7左右，然后取100μL此溶液加入600μL樣本稀釋液（4.1.2），混勻，待測不同廠家的嘔吐毒素膠體金快速定量條所用的樣品制備方法不同，如提供嘔吐毒素膠體金快速定量檢測條使用說明，則按照使用說明中規(guī)定的方法進行操作。試樣篩查將膠體金檢測條（4.1.1）從冷藏狀態(tài)（2℃-8℃）取出放置至最適試驗溫度（23℃-25℃）。將讀數(shù)儀（5.6）打開，按照提示輸入樣品，檢測人員，檢測項目，方法等相關(guān)信息。將比色卡平放于桌面，用讀數(shù)儀掃描比色卡上的二維碼，等待檢測。準確移取100μL待測溶液（7.1），加入檢測條加樣孔中，準確計時5分鐘。孵育5min后，用讀數(shù)儀掃描檢測卡，按下讀取鍵，幾秒鐘讀數(shù)儀的屏幕上即可顯示測試樣中嘔吐毒素的含量信息?？蛇x擇打印，傳輸，儲存此信息。如結(jié)果顯示：invalid,如果檢測條上質(zhì)控線（C線）無色，測試線（T線）上顏色肉眼可見很深，則表明試樣中嘔吐毒素含量非常高，可將試樣提高稀釋倍數(shù)，重新進行檢測。結(jié)果表述嘔吐毒素含量以ppm（mg/kg毫克每千克）表示，由讀數(shù)儀直接顯示和讀取。重復性在同一實驗室，由同一操作者使用相同儀器，按相同的測定方法，并在短時間內(nèi)對同一被測試對象相互獨立進行測試獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值大于算術(shù)平均值20%的情況不超過5%。

（資料性附錄）

膠體金免疫層析快速篩查組件試劑配制與技術(shù)要求樣本稀釋液配制（能達到相當效果者均可）磷酸二氫鉀0.2g十二水合磷酸氫二鈉2.9g氯化鈉8.0g氯化鉀0.2gTritonX-1000.5mL加水定容至1000mL。基本要求工作環(huán)境要求氣溫：23℃～25℃?？乖髧I吐毒素半抗原與載體蛋白進行化學偶聯(lián)，能夠達到包被要求?？贵w要求用嘔吐毒素抗原免疫小鼠，制備針對嘔吐毒素的特異性單克隆抗體，能夠達到檢測要求。原材料要求樣品墊：玻璃纖維或無紡布。金釋放墊：玻璃纖維片，免疫金釋放時間小于10min，釋放效率大于90%。反應膜：硝酸纖維素膜，孔徑為0.45μm，4cm浸潤時間不小于140s。吸水紙。塑料卡盒：丙烯腈、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物。性能要求準確度采用500μg/kg（0.5ppm）、1000μg/kg（1ppm）和2000μg/kg（2ppm）三個濃度水平的樣品，每個濃度水平測定不低于6次，通過偏差來表達，3個濃度水平的6次重復的偏差均應控制在-20%～+20%之間。精密度采用1000μg/kg（1ppm）濃度水平的實際樣品，測定不低于6次，通過批內(nèi)變異系數(shù)來表達，變異系數(shù)應≤20%。檢測限計算20份陰性樣品測定均值加10倍標準差，其結(jié)果應小于或等于產(chǎn)品靈敏度標示值。批間穩(wěn)定性采用1000μg/kg（1ppm）左右濃度水平的