免疫分析相關(guān)儀器

免疫分析相關(guān)儀器新鄉(xiāng)醫(yī)學院三附院王偉1主要內(nèi)容第一節(jié)酶免疫分析儀第二節(jié)自動洗板機第三節(jié)發(fā)光免疫分析儀2第五節(jié)免疫比濁分析儀第六節(jié)時間分辨熒光免疫分析儀第四節(jié)放射免疫分析儀2

本節(jié)要點一、酶免疫分析儀的工作原理二、酶免疫分析儀的基本結(jié)構(gòu)與功能三、酶免疫分析儀的性能評價四、酶免疫分析儀的使用與維護五、酶免疫分析儀的臨床應(yīng)用3第一節(jié)酶免疫分析儀3

掌握酶標儀及全自動微孔板式ELISA分析儀的工作原理、酶免疫分析儀的性能評價。熟悉酶免疫分析儀的類型及臨床應(yīng)用。

了解酶免疫分析儀的結(jié)構(gòu)及維護。第一節(jié)酶免疫分析儀學習目標44檢驗與免疫免疫學分析或稱免疫學檢驗是以抗原抗體相互結(jié)合的免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ)的，主要研究免疫學技術(shù)及其在醫(yī)學領(lǐng)域中的應(yīng)用。乙肝五項，甲肝，丙肝…..甲狀腺功能，性激素，免疫五項，HIV，TORCH風濕免疫5

酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)是目前臨床應(yīng)用最多的一種免疫分析技術(shù)，主要原理是用酶與抗原(抗體)結(jié)合形成酶標抗原(抗體)，在酶標抗原(抗體)與抗體（抗原）的特異性反應(yīng)完成以后，加入酶的相應(yīng)底物，通過酶對底物的顯色反應(yīng)，對待測樣品中的抗原(或抗體)進行定性或定量的測定分析。酶免疫分析定義6酶免疫分析基本示意圖71、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合3、加酶標抗體無抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY8酶免疫分析概述酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)

根據(jù)是否需要分離結(jié)合與游離的酶標記物，可分為:

酶擴大免疫測定均相酶免疫測定

克隆酶供體免疫測定

液相酶免疫法非均相酶免疫測定

固相酶免疫法(酶聯(lián)免疫吸附測定enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）9均相酶免疫測定用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定原理：酶標記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定待測抗原或抗體的含量。分類：均相酶免疫分析主要有酶擴大免疫測定技術(shù)（EMIT）和克隆酶供體免疫測定兩種方法。非均相酶免疫測定需分離游離與結(jié)合的酶標記物原理：在抗原抗體反應(yīng)達到平衡后，采用適當方式將游離的酶標記物和與抗原抗體結(jié)合的酶標記物加以分離，再通過底物顯色進行測定。醫(yī)學檢驗中常用的酶免疫分析法均為非均相法。分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是目前最為常用的固相酶免疫測定

酶免疫分析概述10底物半抗原酶抗體酶酶酶半抗原與酶結(jié)合成酶標半抗原，保留酶和半抗原的活性圖1-A11抗體酶抗體酶圖1-B當酶標半抗原與抗體結(jié)合后，所標的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制12EMIT示意圖13EMIT試劑盒中的主要試劑為：①抗體，②酶標半抗原，③酶的底物。檢測對象為標本中的半抗原。當試劑①、②與待測標本混合后，待測標本中的半抗原與酶標的半抗原競爭性地與試劑中的抗體相結(jié)合。底物抗體酶待測標本中的半抗原14酶酶加入未標記的的半抗原Ag

（樣品中的Ag）后，Ag與AgE競爭結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)中限量Ab的形成AbAg，如樣品中的Ag越多，競爭結(jié)合后反應(yīng)液中AbAgE的比例減少，游離的具有酶活力的AgE的量就增多。因此，反應(yīng)后最終測定的酶活力大小隨著反應(yīng)體系中未標記半抗原Ag濃度的升高而增強。限量的抗體加入的抗原15克隆酶供體免疫測定利用重組DNA技術(shù)制備β-半糖苷酶的兩個片段：大片段稱為酶受體（enzymeacceptor，EA），小片段稱為酶供體（enzymedonor，ED）。兩個片段本身均不具酶活性，但在合適的條件下結(jié)合在一起就具有酶活性。利用這兩相片段的特性建立的均相酶免疫測定稱為克隆酶供體免疫測定（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）。16CEDIA的反應(yīng)模式為競爭法，測定原理為：標本中的Ag和AgED（酶供體標記的抗原）都與特異性Ab競爭結(jié)合，形成兩種抗原抗體復(fù)合物。AgED標記的抗原與特異性Ab結(jié)合后AbAgED由于空間位阻，不再能與EA結(jié)合。反應(yīng)平衡后，剩余AgED的標記抗原與EA結(jié)合，形成具有活性的酶。加入底物測定酶活力，酶活力的大小與標本中抗原含量成正比。17ED標本中抗原活性酶

ED標記抗原ED抗體克隆酶供體免疫測定原理示意圖EA底物顯色反應(yīng)由于反應(yīng)屬競爭結(jié)合,故反應(yīng)液中游離的AgED

隨著標本中未標記的Ag量的增多而增加,使最終加入底物后測得的酶活性高低與標品Ag含量成正比。18微孔板固相酶免疫測定儀器(酶標儀)全自動微孔板ELISA分析儀一、酶免疫分析儀的工作原理19酶標儀

有單通道和多通道兩種類型

1.工作原理：與光電比色計相同，但光路有區(qū)別。

一、酶免疫分析儀的工作原理20光源燈濾光片微孔板光電檢測器模擬信號處理

微機單元顯示器鍵盤打印機

X方向驅(qū)動機Y方向驅(qū)動機控制電路直流穩(wěn)壓電源一、酶免疫分析儀的工作原理21光源聚光鏡聚光鏡光欄反光鏡微孔板（待測液）濾光片光電管光路系統(tǒng)：主要結(jié)構(gòu)和光電比色計相同不同之處在于：比色液的容器是塑料微孔板；以垂直光束通過待測液；通常使用光密度OD來表示吸光度酶標儀的光路系統(tǒng)簡圖22奧地利HT3酶標儀2324AW1洗板機25酶免疫分析儀的類型微孔板固相酶免疫測定儀器(酶標儀)半自動微孔板ELISA分析儀全自動微孔板ELISA分析儀管式固相酶免疫測定儀器小珠固相酶免疫測定儀器磁微粒固相酶免疫測定儀器等26磁微粒固相酶免疫測定儀磁酶免分析系統(tǒng)由分光光度測讀儀、磁鐵板和試劑組成：試劑包括：抗異硫氰酸熒光素（FITC）抗體特異抗體或抗原包被的磁微粒（顆粒直徑1μm）FITC結(jié)合的特異抗體或抗原堿性磷酸酶標記的特異抗體或抗原底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯反應(yīng)結(jié)束后將試管架放在磁鐵板上，磁微粒被磁鐵吸引至管底，完成固相與液相的分離。酶作用后反應(yīng)液呈粉紅色。27磁微粒固相酶免疫測定儀28（二）半自動微孔板ELISA分析儀在酶標儀的基礎(chǔ)上再配置:加液器溫育器洗板機

測定中需由手工將微孔板移至下一步驟的儀器中進行。二、酶免疫分析儀的基本結(jié)構(gòu)與功能返回目錄29加樣器溫育器洗板機酶標儀二、酶免疫分析儀的基本結(jié)構(gòu)與功能30（三）全自動微孔板ELISA分析儀由以下部件組成:加樣系統(tǒng)溫育系統(tǒng)洗板系統(tǒng)判讀系統(tǒng)機械臂系統(tǒng)液路動力系統(tǒng)軟件控制系統(tǒng)二、酶免疫分析儀的基本結(jié)構(gòu)與功能31

全自動微孔板式ELISA分析儀根據(jù)儀器組合分為分體機和一體機。分體機：前處理系統(tǒng)：加樣后處理系統(tǒng)：溫育、洗板、傳送以及判讀等一體機：把上述各系統(tǒng)全部組合在一起

二、酶免疫分析儀的基本結(jié)構(gòu)與功能32全自動微孔板ELISA分析儀樣品架上下吸液管33全自動微孔板ELISA分析儀反應(yīng)板清洗裝置34全自動微孔板ELISA分析儀供水桶、廢液桶儀器全貌35全自動微孔板ELISA分析儀全自動微孔板ELISA分析儀優(yōu)勢：自動化程度高，減少人與樣品的接觸機會，降低污染。能進行各種自動安全檢測。穩(wěn)定：只要避免人為操作錯誤，可連續(xù)工作。準確：不存在交叉污染，確保結(jié)果準確。高速：加注、讀板速度快，擴展性強。36三、酶免疫分析儀的性能評價

1．濾光片波長精度檢查及其峰值測定2．靈敏度和準確度3．通道差與孔間差檢測4．零點飄移5．精密度評價6．線性測定7．雙波長評價37（一）酶標儀

3.操作流程

開機參數(shù)設(shè)置

檢測結(jié)果輸出

關(guān)機打開電源開關(guān)，儀器自檢啟動系統(tǒng)，設(shè)置檢測項目、檢測波長及計算公式等選擇設(shè)定好的模板及檢測項目、錄入樣本結(jié)果輸出，保存在計算機上退出系統(tǒng)，關(guān)閉電源四、酶免疫分析儀的使用與維護38四、酶免疫分析儀的使用與維護1.工作環(huán)境要求包括以下幾個方面：儀器應(yīng)放置在無強磁場和干擾電壓且噪音低于40分貝的環(huán)境下操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽、煙塵，溫度應(yīng)在15℃~40℃之間，濕度在15%~85%之間避免陽光直射，以延緩光學部件的老化操作時電壓應(yīng)保持穩(wěn)定保持干燥、干凈、水平的工作臺面，以及足夠的操作空間。39四、酶免疫分析儀的使用與維護2.日常維護（1）儀器外部的清潔（2）檢查加樣系統(tǒng)（3）清潔儀器內(nèi)部樣品盤和微孔板托架周圍的泄露物質(zhì)（4）洗液管路的維護（5）處理廢液桶中的廢液以及儀器垃圾箱內(nèi)的一次性吸頭，丟棄托盤內(nèi)已使用過的微孔板。40

3.月維護（1）執(zhí)行檢查程序（1）檢查管路及電源線（3）檢查樣品注射器及與之相連探針（4）檢查微孔探測器（5）檢查支撐機械臂的軌道四、酶免疫分析儀的使用與維護414.光學部件維護重點是在光學部分，防止濾光片霉變。應(yīng)定期檢測校正檢查。濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標儀上卸下，在波長精密度較高的紫外-可見分光光度計上在可見光區(qū)對每個濾光片進行掃描，其檢測值與校定值之差為濾光片波長精度。四、酶免疫分析儀的使用與維護425.全自動酶免分析儀的維護

按儀器操作SOP進行。每日開關(guān)機時沖洗管道，對于試驗的順利進行及延長儀器的壽命都極為重要。須用蒸餾水和指定沖洗液進行沖洗，以保證每條工作通道的順暢。四、酶免疫分析儀的使用與維護43五、酶免疫分析儀的臨床應(yīng)用

1.病原體及其抗體的檢測2．各種免疫球蛋白和細胞因子、補體等的檢測3．腫瘤標志物的檢測4．多種激素的檢測5．藥物和毒品的檢測44第二節(jié)自動洗板機

本節(jié)要點一、自動洗板機的工作原理二、自動洗板機的基本結(jié)構(gòu)與功能三、自動洗板機的性能指標與評價四、自動洗板機的使用與維護五、自動洗板機的常見故障與排除45

掌握洗板機的使用及性能指標熟悉洗板機的分類及工作原理

了解洗板機的主要結(jié)構(gòu)、維護保養(yǎng)、常見故障和排除第二節(jié)自動洗板機學習目標46一、洗板機的工作原理洗板儀器簡易型（手動式洗板器）自動型（條式、板式洗板器）集成環(huán)境式洗板機（智能）47一、洗板機的工作原理自動洗板機多采用雙頭真空／壓力泵作真空壓力源，在管路上還設(shè)置一電磁閥，以實現(xiàn)自動吸液、注液功能。微孔板驅(qū)動單元完成走板功能，以實現(xiàn)微孔板的逐排沖洗。一般洗滌微孔板的步驟依次為吸干反應(yīng)液、將洗滌液注滿微孔、浸泡一定時間、吸走孔內(nèi)液，上述步驟重復(fù)幾次。48二、自動洗板機的基本結(jié)構(gòu)與功能機殼清洗頭升降單元微孔板驅(qū)動單元壓力和真空單元開關(guān)電源微處理器外設(shè)49（一）清洗頭升降單元組成部分：清洗頭螺母絲桿升降電機部件二、自動洗板機的基本結(jié)構(gòu)與功能50（二）微孔板驅(qū)動單元組成部分：微孔板載盒滑板傳動帶滑軌走板電機定位簧片二、自動洗板機的基本結(jié)構(gòu)與功能51（三）壓力和真空單元組成部分：真空壓力泵真空管路壓力管路電磁閥洗液瓶廢液瓶二、自動洗板機的基本結(jié)構(gòu)與功能52（四）開關(guān)電源、微處理器控制單元及外設(shè)

開關(guān)電源同時為電磁閥、升降電機提供直流電源。微處理器系統(tǒng)組成：

單片機程序存儲器數(shù)據(jù)存儲器相應(yīng)的鎖存譯碼芯片二、自動洗板機的基本結(jié)構(gòu)與功能53三、自動洗板機的性能指標與評價1.硬件部分①沖洗針頭設(shè)計（單針/雙針）：單針是指洗液和排液采用同軸套管設(shè)計。而雙針設(shè)計是指洗液和排液采用雙針分離頭設(shè)計，可最大限度減少交叉污染。②洗液通道數(shù)：洗液通道數(shù)是指儀器可以同時連接多個洗液瓶的通道數(shù)量。通常是1個洗液通道和1個廢液通道。也有些有三個或四個洗液通道。54三、自動洗板機的性能指標與評價2.軟件控制部分①抽吸方式：不同的抽吸方式可選，底部沖洗和交叉抽吸，單抽吸或雙抽吸。②存儲量：存儲量指存儲洗板程序數(shù)量。③振板功能：增加振板功能可以讓沖洗更充分。55AW1洗板機56三、自動洗板機的性能指標與評價1.自動洗板機的評價指標

殘液量的評價指標主要指殘液量，是指清洗結(jié)束后，微孔板各孔剩余的液體量，這是一個關(guān)鍵指標，很顯然殘液量大，洗板機的洗板效果相對較差。目前大多數(shù)洗板機的殘液量為≤5μl，設(shè)計良好的洗板機可達≤2μl甚至更小。57三、自動洗板機的性能指標與評價

2.全國醫(yī)療器械檢測機構(gòu)基本儀器自動洗板機裝備標準部分要求如下：殘留體積：每孔殘留體積≤2μl；分配重復(fù)性：對于標準96孔板，在300μl注射量時，CV值不大于6%；分配準確度：平均體積±3%。58（一）自動洗板機使用

1.檢查廢液瓶口的塞子，清空廢液，再把塞子安緊在廢液瓶口上，注意不要讓廢液管纏繞。2.擰開洗液瓶的蓋子，倒掉前一天洗液瓶里剩余的洗液，倒進新配的洗液。擰緊蓋子，以保證洗液管的通暢。3.打開電源開關(guān)，根據(jù)實驗要求選擇相應(yīng)洗滌程序和洗滌微孔板條數(shù)。

四、洗板機的使用與維護59（一）自動洗板機使用

4.將待洗反應(yīng)板順位放入載板架，保證整板處于同一水平位置，以免孔邊緣過高碰到吸液針。5.清洗完成后，取出已洗好的微孔板，將載板架彈進。關(guān)閉電源。6.拔掉廢液瓶口的塞子（接有與洗板機相連的廢液管），倒掉廢液瓶的廢液。四、洗板機的使用與維護60四、自動洗板機的使用與維護（一）洗板機的使用檢查廢液瓶新配洗液打開電源開關(guān)反應(yīng)板放入載板架關(guān)閉電源清空廢液瓶保證廢液管的通暢倒掉前一天洗液瓶里剩余的洗液選擇相應(yīng)洗滌程序和洗滌微孔板條數(shù)板順位放入一般選擇整板洗滌且為8孔模式，每一洗滌循環(huán)包括吸液、注水、再吸液三步，設(shè)定5個或6個循環(huán)61四、自動洗板機的使用與維護1.洗板前、后均要用蒸餾水沖洗管道。2.洗板過程中，板孔中加入緩沖液時有氣泡產(chǎn)生或有緩沖液溢出孔外，說明針孔堵塞，應(yīng)暫停洗板，將洗板針取下，用比洗板針小一號的注射針上下連通幾下，用蒸餾水連沖幾次即可。3.洗板中有緩沖液溢出，應(yīng)立即暫停，清理干凈后再進行洗板。4.每天工作結(jié)束后要對其內(nèi)外進行清潔，并用蒸餾水將所有的管道清洗一遍，防止洗液的結(jié)晶堵塞管道。（二）自動洗板機的維護保養(yǎng)62四、自動洗板機的使用與維護5.及時倒棄廢液，以免廢液瓶過滿而使廢液回流造成洗板機的故障。6.保證待洗反應(yīng)板的孔邊緣不要過高且保持水平，以免造成吸液針損傷。7.定期將洗液及廢液管道拆卸下來進行沖洗，以保證管道的通暢。8.關(guān)機前要把菜單回復(fù)到待機狀態(tài)再關(guān)機，平常不用時應(yīng)拔掉電源插頭，用塑料罩或布罩蓋住。（二）自動洗板機的維護保養(yǎng)63五、自動洗板機的常見故障和排除1.不能排廢液2.關(guān)機后程序丟失3.銀針清洗時針齊根斷在液針孔內(nèi)4.操作時某一個通道不能進/吸液64小結(jié)掌握酶標儀及全自動微孔板式ELISA分析儀的工作原理，酶免疫分析儀、洗板機的性能評價；熟悉酶免疫分析儀的類型及臨床應(yīng)用、洗板機的分類和工作原理；了解酶免疫分析儀、洗板機的主要結(jié)構(gòu)、維護保養(yǎng)、常見故障和排除等65第三節(jié)發(fā)光免疫分析儀

本節(jié)要點一、發(fā)光免疫分析概述二、發(fā)光免疫分析儀工作原理與基本結(jié)構(gòu)三、化學發(fā)光免疫分析儀的性能指標四、發(fā)光免疫分析儀的臨床應(yīng)用66

掌握發(fā)光免疫分析儀的類型及工作原理。熟悉發(fā)光免疫分析的臨床應(yīng)用。

了解各類發(fā)光免疫分析的基本結(jié)構(gòu)。學習目標第三節(jié)發(fā)光免疫分析儀67化學發(fā)光：

某些化學反應(yīng)產(chǎn)生的能量能使其產(chǎn)物或中間態(tài)分子激發(fā)，形成激發(fā)態(tài)分子，當其衰退至基態(tài)時，所釋放出的化學能量以可見光的形式發(fā)射，這種現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。第三節(jié)發(fā)光免疫分析儀68類型 常用標記物 發(fā)光劑化學發(fā)光免疫分析（CLIA） 吖啶酯 吖啶酯化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 辣根過氧化物酶魯米諾微粒子化學發(fā)光免疫分析（ECIA）堿性磷酸酶 AMPPD電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA） 三聯(lián)吡啶釕 三聯(lián)吡啶釕一、發(fā)光免疫分析概述

表7-1發(fā)光免疫分析的種類69化學發(fā)光的分類-1酶促化學發(fā)光：辣根過氧化物酶系統(tǒng)堿性磷酸酶系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學發(fā)光：吖啶酯系統(tǒng)草酸酯系統(tǒng)70化學發(fā)光的分類-2按持發(fā)光續(xù)時間：閃光（Flash）發(fā)光時間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯以原位進樣(InSituInjector)和時間積分法測量（檢測與加樣同時進行稱原位進樣）輝光（Glow）發(fā)光時間在數(shù)十分鐘以上，如：HRP-Luminol系統(tǒng)(辣根過氧化物酶-魯米諾)

AP-AMPPD(3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽)系統(tǒng),AP(堿性磷酸酶)

-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)無須原位進樣、以速率法測量。71時間發(fā)光信號輝光坪區(qū)速率法測量原位進樣積分法測量閃光尖峰閃光與輝光及其測量方式的差別72(一)全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)1．工作原理將某些化學基團標記在抗原或抗體上，這些化學基因被氧化后形成激發(fā)態(tài)，并在返回基態(tài)的同時發(fā)射一定波長的光子，光電倍增管將接收到的光能轉(zhuǎn)變?yōu)殡娔?，以?shù)字形式反映光量度，再計算測定物的濃度。二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)73

吖啶酯標記CLIA反應(yīng)原理二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)74(一)全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)2.基本結(jié)構(gòu)（1）主機部分：原材料配備部液路部機械傳動部光路檢測部（2）微機系統(tǒng)二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)75(一)全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)3.儀器操作（1）開機、裝載試劑（2）定標（3）標本檢測（4）維護保養(yǎng)（5）關(guān)機二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)76(二)全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)1.工作原理：應(yīng)用經(jīng)典的免疫學原理，采用單克隆抗體試劑，采用磁性微粒作為固相載體，以堿性磷酸酶作為標記物，發(fā)光劑采用AMPPD，固相載體的應(yīng)用擴大了測定的范圍。二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)77二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)堿性磷酸酶標記的ECIA反應(yīng)原理78(二)全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)

2.基本結(jié)構(gòu)傳送艙主探針系統(tǒng)分析系統(tǒng)流體系統(tǒng)電子系統(tǒng)二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)79DxI-800全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析儀美國貝克曼公司，具有高特異性、高靈敏性、高準確性、高穩(wěn)定性，檢測速度400T/hr，可檢測的項目有：甲狀腺功能檢測5項、性激素檢測6項、貧血檢測7項、腫瘤標志物檢測7項、心血管檢測3項、糖尿病檢測3項、乙肝兩對半定量檢測、HCG、皮質(zhì)醇、生長素等50個項目80(二)全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)3.儀器使用開機、裝載試劑定標標本檢測維護保養(yǎng)二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)UniCel?DxI80081羅氏Elecsys2010電化學發(fā)光全自動免疫分析儀82深圳麥格魯米化學發(fā)光儀83深圳麥格魯米化學發(fā)光儀試劑杯和樣品架84深圳麥格魯米化學發(fā)光儀試劑架85深圳麥格魯米化學發(fā)光儀A磁性微球B低點校準品C高點校準品D空

E熒光標記物F發(fā)光標記物86（三）全自動電化學發(fā)光免疫分析儀1．工作原理將待測標本與包被抗體的順磁性微粒和發(fā)光劑標記的抗體加在反應(yīng)杯中共同溫育，形成磁性微珠包被抗體-抗原-發(fā)光劑標記抗體復(fù)合物。當磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下的磁鐵吸引住，而游離的發(fā)光劑標記抗體被沖洗走。同時在電極加電壓，啟動電化學發(fā)光反應(yīng)，使發(fā)光試劑標記物三氯聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+TPA在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學發(fā)光。光的強度與待測物的濃度成正比。二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)87(三)全自動電化學發(fā)光免疫分析儀二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)三氯聯(lián)吡啶釕標記的ECLIA反應(yīng)原理88電化學發(fā)光免疫分析示意圖89(三)全自動電化學發(fā)光免疫分析儀2．儀器結(jié)構(gòu)：試劑盒、溫育反應(yīng)盤、電化學檢測系統(tǒng)及計算機控制系統(tǒng)二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)90(三)全自動電化學發(fā)光免疫分析儀3.儀器操作步驟開機、裝載試劑定標標本檢測維護保養(yǎng)關(guān)機二、發(fā)光免疫分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)91德國西門子ADVIACentaurXP全自動化學發(fā)光免疫分析儀92三、化學發(fā)光免疫分析儀的性能指標臨床使用的發(fā)光免疫分析儀有很多種，它具有檢測速度快、精度好、重復(fù)性高、條碼識別系統(tǒng)、24小時待機、系統(tǒng)穩(wěn)定等特點。市場上常見的三種全自動發(fā)光免疫分析儀的性能特點見表7-2。93四、發(fā)光免疫分析儀的臨床應(yīng)用

1．甲狀腺系統(tǒng)2．性腺系統(tǒng)3．血液系統(tǒng)4．腫瘤標記物5．心血管系統(tǒng)6．血藥濃度7．感染性疾病94第四節(jié)放射免疫分析儀一、放射免疫技術(shù)概述二、液體閃爍計數(shù)器基本原理三、液體閃爍計數(shù)器的基本結(jié)構(gòu)四、液體閃爍計數(shù)器的使用五、放射免疫分析儀的應(yīng)用

本節(jié)要點95

掌握液體閃爍計數(shù)器的原理、結(jié)構(gòu)與使用熟悉放射免疫分析的基本原理了解放射免疫分析儀的應(yīng)用學習目標第四節(jié)放射免疫分析儀96放射免疫技術(shù)（radioimmunoassay,RIA）是將放射性核素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的高特異性結(jié)合在一起，以放射性核素為標志物的最早應(yīng)用的標記免疫分析技術(shù)。第四節(jié)放射免疫分析儀97

一、放射免疫技術(shù)概述（一）技術(shù)原理：

RIA是在體外條件下，由非標記抗原（待測物質(zhì)）與定量的標記抗原對限量的特異性抗體（一抗）的競爭性抑制結(jié)合反應(yīng)。98（一）技術(shù)原理

一、放射免疫技術(shù)概述（一抗）99一、放射免疫技術(shù)概述（二）放射性活度測定方法1.放射免疫分析常用標記物：常用的標記物有放射γ射線和β射線的核素兩大類。前者主要為131I、125I、57Cr和60Co；后者有14C、3H和32P。100一、放射免疫技術(shù)概述（二）放射性活度測定方法

2.放射性活度測定方法實際上就是進行放射性量測定的儀器。進行放射性量測定的儀器有兩類。液體閃爍計數(shù)儀：用于檢測β射線，如3H、32P、14C等晶體閃爍計數(shù)儀：用于檢測γ射線，如125I、131I、57Cr等

101一、放射免疫技術(shù)概述（二）放射性活度測定方法

2.放射性活度測定方法液體閃爍計數(shù)儀和晶體閃爍計數(shù)儀都是將射線（放射能）與閃爍體的作用轉(zhuǎn)換成光脈沖（光能），然后用光電倍增管將光脈沖轉(zhuǎn)換成電脈沖（電能），電脈沖在單位時間內(nèi)出現(xiàn)的次數(shù)（即儀器記錄的cpm值）反映了發(fā)出射線的頻率，而電脈沖的電壓幅度則反映了射線能量的高低。

102一、放射免疫技術(shù)概述（三）放射免疫分析的優(yōu)點1.靈敏度高2.特異性強3.應(yīng)用范圍廣4.操作簡便103一、放射免疫技術(shù)概述（三）放射免疫分析的缺點1.方法的局限性2.穩(wěn)定性問題3.靈敏度問題4.測定結(jié)果中的問題5.生物安全問題

104二、液體閃爍計數(shù)器基本原理是依據(jù)射線與物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光效應(yīng)首先是閃爍溶劑分子吸收射線能量成為激發(fā)態(tài)，再回到基態(tài)時將能量傳遞給閃爍體分子，閃爍體分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，發(fā)出熒光光子。熒光光子被光電倍增管（PM）接收轉(zhuǎn)換為光電子，再經(jīng)倍增，在PM陽極獲得大量電子，形成脈沖信號，輸入后讀分析電路形成數(shù)據(jù)信號，最后由計算機數(shù)據(jù)處理，求出待測抗原含量。105

液體閃爍計數(shù)器的結(jié)構(gòu)和性能不斷發(fā)展，目前多采用雙管快符合對稱系統(tǒng)多獨立道分析，與微機聯(lián)用，實現(xiàn)了高度的自動化。1．自動換樣器2．基本電子學線路3．微機操作系統(tǒng)三、液體閃爍計數(shù)器基本結(jié)構(gòu)106四、液體閃爍計數(shù)器的使用1．樣品-閃爍液反應(yīng)體系建立樣品和閃爍液按一定比例裝入測量瓶，向光電倍增管提供光信號。（1）樣品：根據(jù)樣品的可溶性，進行不同的處理。（2）閃爍液：包括溶劑和溶質(zhì)。（3）測量瓶：常用的測量瓶用低鉀玻璃、聚乙烯等材料制作。1072．猝滅樣品、氧氣、水及色素物質(zhì)等加入閃爍體中，會使閃爍體的熒光效率降低，出射熒光光譜改變，從而使整個測量裝置的測量效率降低的過程稱為猝滅。為減小猝滅，可在閃爍液中通氮氣或氬氣驅(qū)氧；將樣品pH值調(diào)至7左右，避免酸的猝滅作用；對卟啉、血紅蛋白等著色樣品進行脫色處理等。四、液體閃爍計數(shù)器的使用1083．計數(shù)效率測定通常用于放射性的相對測量，即通過樣品與標準樣品的計數(shù)率的比較來測定樣品。由于標準與待測樣品的猝滅情況不同，就需要對猝滅進行必要的校正來求出每個具體樣品相對于標準樣品的實際計數(shù)效率。常用的校正法有內(nèi)源法，外源法和道比法等目前廣泛使用的是外部標準源校正法。四、液體閃爍計數(shù)器的使用109五、放射免疫分析儀的應(yīng)用1.各種激素2.微量蛋白質(zhì)3.腫瘤標志物4.藥物110第五節(jié)免疫比濁分析儀一、免疫比濁技術(shù)概述二、免疫比濁分析儀工作原理與基本結(jié)構(gòu)三、免疫比濁分析儀的保養(yǎng)四、免疫比濁分析的臨床應(yīng)用

本節(jié)要點111

掌握免疫比濁分析儀的種類及工作原理熟悉免疫比濁分析的分類、基本原理及免疫比濁分析儀的臨床應(yīng)用

了解免疫比濁分析儀的結(jié)構(gòu)及保養(yǎng)學習目標第五節(jié)免疫比濁分析儀112免疫比濁法（immunoturbidimetry）是利用可溶性抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當有光線通過時，就會產(chǎn)生折射或吸收，測定這種折射和吸收后的透射光或散射光，即可計算出樣品的含量。一、免疫比濁技術(shù)概述113（一）免疫比濁的分類

一、免疫比濁技術(shù)概述免疫散射比濁法免疫膠乳濁度測定法速率散射比濁法免疫透射濁度測定法免疫透射比濁法終點散射比濁法114（二）免疫比濁技術(shù)的主要特點1.穩(wěn)定性好，敏感性高2.分析簡便、快速3.能更好地避免標本之間的污染和標本對人的污染4.對同一份樣品可同時測定多種檢測項目，標本用量少，具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢。一、免疫比濁技術(shù)概述115（三）免疫比濁技術(shù)的基本原理1．免疫透射比濁度測定免疫比濁法測定的光路示意圖一、免疫比濁技術(shù)概述116（三）免疫比濁技術(shù)的基本原理1.免疫透射比濁度測定

抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當反應(yīng)液中保持抗體過剩時，形成的復(fù)合物隨抗原增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加而導(dǎo)致透射光的減少。一、免疫比濁技術(shù)概述117（三）免疫比濁技術(shù)的基本原理2.免疫散射比濁測定終點散射比濁法散射免疫比濁速率散射比濁法一、免疫比濁技術(shù)概述118（三）免疫比濁技術(shù)的基本原理2.免疫散射比濁測定（1）終點散射比濁法

在抗原—抗體反應(yīng)達到平衡時，即復(fù)合物形成后作用一定時間，通常為30-60分鐘，復(fù)合物濁度不再受時間的影響，但又必須在聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進行濁度測定。

一、免疫比濁技術(shù)概述119（三）免疫比濁技術(shù)的基本原理（2）速率散射比濁法

是一種先進的動力學測定法。速率是指抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)過程中，在單位時間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率散射比濁法是測定單位時間內(nèi)免疫復(fù)合物形成的最快時間段(約在1分鐘內(nèi))的散射信號值。

一、免疫比濁技術(shù)概述120（三）免疫比濁技術(shù)的基本原理3．免疫膠乳比濁

選擇一種大小適中、均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應(yīng)抗原時，則發(fā)生凝集?？乖贵w反應(yīng)后溶液的吸光度或散射光強度與膠乳凝聚程度成正比，與待測抗原濃度呈正相關(guān)。采用透射比濁法或散射比濁法測定。

一、免疫比濁技術(shù)概述121（一）ARRAY特種蛋白分析測定系統(tǒng)1.工作原理在抗體過量的前提下，懸浮于緩沖液中的抗原-抗體免疫復(fù)合物顆粒通過光束時產(chǎn)生的散射光速率變化，散射測濁儀檢測出該信號的強弱與抗原濃度成正比，速率峰值經(jīng)微電腦處理轉(zhuǎn)換成抗原濃度。二、免疫比濁分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)122（一）ARRAY特種蛋白分析測定系統(tǒng)

2.

基本結(jié)構(gòu)（1）散射測濁儀（2）加液系統(tǒng)（3）試劑和樣品轉(zhuǎn)盤（4）卡片閱讀器二、免疫比濁分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)123（一）ARRAY特種蛋白分析測定系統(tǒng)3.儀器主要特點（1）速率信號的獲取散射測濁儀在檢測標本時，散射光信號的第一次變化是反應(yīng)緩沖液產(chǎn)生的。（2）抗原過剩的監(jiān)測（3）使用抗體、標準血清、抗體卡片和校正卡片二、免疫比濁分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)124（二）BN特種蛋白分析測定系統(tǒng)1．工作原理實質(zhì)上是透射比濁的一種改良。利用發(fā)光二極管（840nm）作為光源，檢測在前向角13°～24°的散射光，由硅化光電二極管接收散射光信號，這種散射光的強度與免疫復(fù)合物濃度成正比。

二、免疫比濁分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)125

2．基本結(jié)構(gòu)由分析儀、計算機、打印機、條碼讀取器四部分組成。分析儀是該系統(tǒng)的主要部分，包括：散射測濁儀自動加液系統(tǒng)支架運輸裝置比色杯裝置。

二、免疫比濁分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)1263.儀器主要特點（1）固定時間測定：該分析儀可以通過固定時間來檢測血清特種蛋白濃度。（2）終點檢測法：該分析儀通過終點法來檢測用膠乳反應(yīng)的血清特種蛋白濃度，是檢測預(yù)溫30分鐘后光散射的值t

。二、免疫比濁分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)127（三）IMMAGE免疫分析測定系統(tǒng)

1.工作原理使用760nm和近紅外940nm波長作為光源，速率散射比濁速率抑制散射比濁速率近紅外顆粒透射法速率抑制近紅外顆粒透射法四種檢測技術(shù)二、免疫比濁分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)128（三）IMMAGE免疫分析測定系統(tǒng)2．基本結(jié)構(gòu)和前述ARRAY特種蛋白分析測定系統(tǒng)相似。3.儀器特點（1）加大抗原過量檢測范圍（2）全方位的條形碼系統(tǒng)（3）液面感應(yīng)（4）測試速度快IMMAGE800特定蛋白儀二、免疫比濁分析儀的工作原理與基本結(jié)構(gòu)129各類免疫比濁分析儀的主要保養(yǎng)包括：1．每日保養(yǎng)2．每月保養(yǎng)3．特殊保養(yǎng)三.免疫比濁分析儀的保養(yǎng)1301．每日保養(yǎng)①檢查沖洗液余量及沖洗管道；②檢查廢液桶及排廢管道；③檢查儀器底部有無液體滲漏；④檢查注射器閥,管道和活塞頭；⑤清潔試劑針,樣品針,試劑攪拌針和樣品攪拌針外表面。三.免疫比濁分析儀的保養(yǎng)1312．每月保養(yǎng)①清潔儀器表面②清洗儀器所有風扇的過濾網(wǎng)③記錄儀器工作次數(shù)3．特殊保養(yǎng)三.免疫比濁分析儀的保養(yǎng)1321．免疫功能監(jiān)測2．心血管疾病檢測3．炎癥狀況監(jiān)測4．類風濕關(guān)節(jié)炎的檢測5．腎臟功能監(jiān)測6．營養(yǎng)狀態(tài)監(jiān)測7．新生兒體檢8．凝血及出血性疾病的檢測9．貧血監(jiān)測觸球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。10．血腦屏障監(jiān)測四、免疫比濁分析的臨床應(yīng)用133一、時間分辨熒光免疫分析工作原理二、時間分辨熒光免疫分析儀基本結(jié)構(gòu)三、時間分辨分析儀的性能評價四、時間分辨熒光免疫分析儀的使用與維護五、時間分辨熒光免疫分析的臨床應(yīng)用

第六節(jié)時間分辨熒光免疫分析儀

本節(jié)要點134

掌握時間分辨熒光免疫分析的原理及特點熟悉時間分辨熒光免疫分析儀的測試原理及臨床應(yīng)用

了解時間分辨熒光免疫分析儀的基本結(jié)構(gòu)及維護學習目標第六節(jié)時間分辨熒光免疫分析儀135熒光免疫測定：均相熒光免疫測定法、非均相熒光免疫測定法、直接熒光測量法第六節(jié)時間分辨熒光免疫分析儀136一、時間分辨熒光免疫分析工作原理

是用鑭系三價稀土離子及其螯合物如銪（Eu3+）等及其螯合物作為示蹤劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光物質(zhì)、放射性同位素、酶和化學發(fā)光物質(zhì)，來標記抗體、抗原、多肽、激素、核酸探針或生物活性細胞；

待反應(yīng)體系（如抗原抗體免疫反應(yīng)等）發(fā)生后，根據(jù)稀土離子螯合物有長壽命熒光的特點，通過電子設(shè)備控制熒光強度測定時間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后，再進行產(chǎn)物的長壽命熒光強度測定，以此來判斷反應(yīng)體系中被測物質(zhì)的濃度。137一、時間分辨熒光免疫分析工作原理當免疫反應(yīng)發(fā)生后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的特點，用時間分辨熒光分析儀延緩測量時間，排除標本中非特異性熒光(藍)的干擾，所得信號完全是稀土元素螯合物發(fā)