生物（人教版選修3）課件1.2基因工程的基本操作程序

1．2基因工程的基本操作程序專題一基因工程1．了解目的基因獲取的常用方法。2．理解基因表達載體的構建是基因工程的核心。3．掌握將目的基因導入受體細胞的方法。4．理解目的基因的檢測與鑒定。一、基因工程的基本操作程序編碼蛋白質

所有

一部分

(2)利用PCR技術擴增目的基因：①含義：是一項在生物體外

的核酸合成技術。②原理：

。③條件：

、DNA模板、Taq酶、四種脫氧核苷酸。復制特定DNA片段DNA雙鏈復制引物④過程：目的基因DNA受熱

后解鏈為單鏈

與單鏈相應互補序列結合

在

作用下進行

重復循環(huán)多次⑤結果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成

形式擴增(2n)。變性引物DNA聚合酶延伸指數(3)人工合成法：①條件：基因較小，

又已知；②方法：通過

用化學方法直接人工合成。核苷酸序列DNA合成儀1．探討基因文庫、基因組文庫、cDNA文庫有何關系？提示：基因組文庫含有一種生物的全部基因，而cDNA文庫只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫。三、基因表達載體的構建1．構建目的(1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以

給下一代。(2)使目的基因能夠

和發(fā)揮作用。遺傳表達2．構建零件2．終止子和終止密碼子是否一樣？提示：終止子是指DNA分子上決定轉錄停止的三個相鄰堿基；終止密碼子是指mRNA分子上決定翻譯停止的三個相鄰堿基。目的基因

維持穩(wěn)定

表達

農桿菌轉化法

花粉管通道法

(2)農桿菌特點①易感染

和

。②Ti質粒上的

可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞

上。3．導入動物細胞(1)方法：

技術。(2)常用受體細胞：

。雙子葉植物裸子植物T-DNA(可轉移的DNA)染色體的DNA顯微注射受精卵4．導入微生物細胞(1)原核生物特點：

、多為

、遺傳物質相對

等。(2)對受體細胞的常用處理方法：用

處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細胞稱為

)。繁殖快單細胞較少Ca2＋感受態(tài)細胞2．個體生物學水平上的檢測與鑒定：如一個抗蟲或抗病的目的基因導入植物細胞后，是否賦予了植物抗蟲或抗病特性，需要做抗蟲或抗病的

。蛋白質

接種實驗3．要檢測目的基因是否成功地插入了受體DNA中，需要用基因探針，基因探針是指什么？提示：用放射性同位素或熒光分子等標記的DNA分子。一、PCR技術與DNA復制的區(qū)別1．PCR技術擴增目的基因的原理及過程(1)原理：利用DNA雙鏈復制的原理，在體外將基因的核苷酸序列不斷地加以復制，使其數量成指數方式增加。(2)過程：如圖所示。從上圖中可以看出利用設計的特異性引物對cDNA文庫進行PCR擴增，提取出了相應的目的基因，而不是對cDNA文庫進行簡單、全面地復制。2．PCR技術與DNA復制的比較DNA復制PCR技術區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋場所細胞內(主要在細胞核內)細胞外(主要在PCR擴增儀內)酶DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)溫度條件細胞內溫和條件需控制溫度，在較高溫度下進行合成的對象DNA分子DNA片段或基因聯系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸【特別提醒】PCR技術利用熱變性解旋與復性，所以用耐高溫的DNA聚合酶，同時需設計引物，由于DNA解旋是在高溫下變性實現的，故不再需解旋酶。

資料顯示，近10年來，PCR技術(聚合酶鏈式反應)成為分子生物學實驗室的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA的半保留復制，在試管中進行DNA的人工復制(如圖)，在很短的時間內，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗室所需的遺傳物質不再受限于活的生物體。請據圖回答：(1)加熱至94℃的目的是使DNA中的______鍵斷裂，這一過程在細胞內是通過______的作用來完成的。(2)當溫度降低時，引物與模板末端結合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成2個DNA分子，此過程中原料是______，遵循的原則是________________________。(3)請指出PCR技術與轉錄過程的三個不同之處：①_____________________________________________；②______________________________________________；③_____________________________________________。(4)Taq酶的特點是________。A．耐強酸 B．耐強堿C．耐高溫 D．最適溫度37℃解析：(1)94℃時DNA雙鏈解旋，破壞的是兩條鏈之間的氫鍵，而在細胞內DNA復制解旋時解旋酶起相同作用。(2)PCR技術與DNA復制過程原理是相同的，即堿基互補配對，原料均為4種脫氧核苷酸。(3)PCR技術與轉錄區(qū)別很大。如下表：(4)Taq酶適于在高溫條件下發(fā)揮作用。過程PCR技術轉錄模板DNA兩條鏈DNA一條鏈原料脫氧核苷酸核糖核苷酸酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶解旋酶、RNA聚合酶溫度較高常溫產物DNARNA答案：(1)氫解旋酶(2)4種脫氧核苷酸堿基互補配對原則(3)①PCR技術以DNA的兩條單鏈為模板合成子代DNA，轉錄以DNA的一條單鏈為模板合成RNA

②PCR技術的原料為脫氧核苷酸，轉錄的原料是核糖核苷酸③二者反應時的催化酶不同(或其他合理答案)

(4)C解析：PCR技術是在生物體外進行DNA復制的技術，其原理與DNA復制的原理是相同的，但前提是必須要有一段已知的目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。答案：A二、目的基因的導入與檢測1．目的基因導入受體細胞(1)目的基因導入受體細胞的過程(2)目的基因導入受體細胞的常用方法受體細胞種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的DNA上→表達目的基因表達載體的提純→取卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞，表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子2.目的基因的檢測與鑒定(1)操作目的檢測和鑒定目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性是基因工程最為關鍵的一步。(2)目的基因檢測與鑒定的方法比較類型步驟檢測內容方法判斷指標分子檢測第一步目的基因是否導入受體細胞DNA分子雜交技術(DNA與DNA之間)是否顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉錄出mRNA分子雜交技術(DNA與mRNA之間)同上第三步目的基因是否翻譯成蛋白質抗原—抗體雜交同上個體生物學水平的鑒定植物可進行抗蟲或抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性程度；基因工程產品可與天然產品的功能進行活性比較，以確定轉基因產品功能活性是否與天然產品相同【特別提醒】(1)原核生物作為受體細胞的優(yōu)點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少。(2)目的基因進入受體細胞，并在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉化。轉化的實質是目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。(3)構建基因表達載體(核心步驟)。

農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下圖為農桿菌轉化法的示意圖，試回答下列問題：(1)一般情況下農桿菌不能感染的植物是______，利用農桿菌自然條件下感染植物的特點，能實現______。具體原理是在農桿菌的Ti質粒上存在T-DNA片段，它具有可轉移至受體細胞并整合到受體細胞______上的特點，因此只要將攜帶外源基因的DNA片段插入到______(部位)即可。(2)根據T-DNA這一轉移特點，推測該DNA片段上可能含有控制______(酶)合成的基因。(3)圖中c過程中，能促進農桿菌向植物細胞轉移的物質是______類化合物。(4)要獲取能表現出新性狀的植株，d過程涉及的生物學技術是______。(5)植物基因工程中除了農桿菌轉化法之外，還可采取______方法。(至少寫出兩種)解析：(1)一般農桿菌不能感染的植物是單子葉植物，可感染雙子葉植物和裸子植物。利用其感染性，可實現目的基因導入到植物細胞。真正可轉移至受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上的是農桿菌T-DNA片段，因此目的基因必須插入到該部位才能成功。(2)根據T-DNA這一轉移特點，可以推測該DNA片段能控制合成DNA連接酶、限制酶以實現與雙子葉植物細胞染色體DNA的整合。(3)植物細胞受傷后可產生酚類物質，促進農桿菌向植物細胞轉移。

(4)d過程涉及的生物學技術是植物組織培養(yǎng)，通過脫分化、再分化，最終形成植物體。(5)植物基因工程中除了農桿菌轉化法之外，還有基因槍法和花粉管通道法等。答案：(1)單子葉植物目的基因導入到植物細胞染色體的DNA

T-DNA片段(內部)

(2)DNA連接酶、限制酶(3)酚(4)植物組織培養(yǎng)技術(5)基因槍法、花粉管通道法【互動探究】

(1)怎樣操作能使農桿菌感染單子葉植物？(2)根據題干分析，為什么動植物病毒也可作為基因工程的載體？提示：(1)可在單子葉植物受損處涂加酚類物質來吸引農桿菌。(2)病毒能夠侵染正常細胞，有的病毒還能將自己的核酸整合到宿主細胞的染色體上，所以可以作為基因工程的載體?！痉椒记伞拷獯鸹蚬こ袒静僮鞒绦蝾}目的一般步驟——三辨、三找、一析、一理(1)三辨：分辨限制酶的種類及識別序列和切割位點。在切割目的基因和載體時，一般用同一種限制酶切割，也可用不同的限制酶切割，但兩種限制酶切割后產生的黏性末端中堿基要互補配對。(2)三找：找出標記基因、目的基因及其插入位點。一般來說，質粒中至少有一個標記基因，如抗生素抗性基因。明確目的基因的插入位點是在標記基因內部還是在標記基因之外。(3)一析：分析目的基因插入質粒后是否破壞了標記基因。如果質粒中有一個標記基因，插入后一般不破壞標記基因；如果質粒中有兩個標記基因，則需看標記基因中是否有插入位點，如果某一標記基因中有插入位點，則目的基因插入質粒后該標記基因被破壞。(4)一理：理清判斷目的基因是否導入受體細胞的方法。一般用含有某種抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體菌，如果有兩種抗生素基因，還需判斷用哪一種抗生素來檢測。2．科研人員以抗四環(huán)素基因為標記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產鼠的β-珠蛋白，治療鼠的鐮刀型細胞貧血癥。下列相關實驗設計中，不合理的是(

)A．利用小鼠DNA分子通過PCR克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列B．用編碼序列加啟動子、抗四環(huán)素基因等元件來構建表達載體C．用Ca2＋處理大腸桿菌后，將表達載體導入具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中D．用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經導入β-珠蛋白基因編碼序列的大腸桿菌解析：具有特定抗性基因的運載體，導入不含該抗性基因的受體生物中，才能進行篩選。答案：C尋根問底1．為什么要構建基因文庫？直接從含目的基因的生物體內提取不行嗎？(教材P9)提示：構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，但并不是唯一的方法。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中直接獲得，也可以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的