實驗室做細胞常用染色

實驗室做細胞常用的細胞固定與染色方法一、爬片前蓋玻片處理方法對于懸浮培養(yǎng)的細胞，在進行各種染色前常需先制備成涂片。為了保證細胞在長時間的染色過程中不從載玻片脫落，必須使其牢固貼附于載玻片上。在載玻片上涂布一層有助于細胞黏附的物質是經(jīng)常采用的方法之一。能促進細胞黏附的物質主要有多聚賴氨酸、鉻礬明膠等，這里介紹多聚賴氨酸的涂布方法。1、將載玻片用玻璃專用洗滌劑(如Decon)浸泡5min，間或振蕩。2、用自來水沖洗5min。3、以1％鹽酸—70％乙醇溶液浸泡5min。4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。5、多聚L-賴氨酸(1:10溶于去離子水)浸泡5min，振蕩。6、入60℃烤箱1h，或室溫過夜干燥(用于細胞化學、免疫細胞化學及原位雜交細胞化學)。二、細胞固定常用方法固定細胞的目的在于把組織和細胞的原有結構盡可能完整地保存下來，避免組織和細胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等，使細胞和組織內的各種酶失去活性，防止細胞和組織的各種分子變性、解離，使細胞的化學物質和酶能準確定位，并在以后的處理和制片過程中亦不發(fā)生改變和破壞。同時，固定還可使細胞的各部分易于著色，適于觀察、長期保存和分析。1.固定組織、細胞的基本原則：盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測工具、對象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。2.培養(yǎng)物的準備和固定前處理：各種細胞培養(yǎng)物，如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料。對雙蓋片懸滴培養(yǎng)物和懸液培養(yǎng)物來說，常通過離心收集細胞，PBS漂洗2～3次后，備固定制片；對蓋片單層培養(yǎng)物來說，將蓋片從培養(yǎng)器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附著于細胞表面的殘渣，備固定用。3.常用固定液：常用的固定液分兩類，一類是以單一化學物質配成的固定液，稱簡單固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、四氧化鋨(鋨酸)。另一類是用兩種或兩種以上化學物質配合成的固定液，稱混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、

Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液對細胞的化學成分、酶類及細胞結構固定效果不同。因此，選擇合適的固定液是達到固定目的的基礎。(1)4％甲醛-PBS:甲醛是一種氣體，其飽和水溶液無色，約含40％甲醛。在很多情況下，甲醛常常產生多聚甲醛的白色沉淀。4％甲醛-PBS使組織變硬速度比乙醇快，并能較好地保存組織的外部形式，固定效果不受制片影響，固定材料可用蘇木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力較強，對組織固定均勻，能增強組織的彈性，大標本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色體、線粒體和高爾基體的固定液，在冷凍切片中，甲醛作固定劑具有顯著的優(yōu)點。用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制備甲醛固定液。(2)丙酮：丙酮為無色易揮發(fā)液體，用純冷丙酮(4℃)固定細胞內酶效果較佳。銨礬或鉀礬，0.1g碘酸鈉加溫溶于70m1蒸餾水。再加入30ml甘油，

2ml冰醋酸?；靹?。過濾后即成母液?？砷L久保存。用蒸餾水以1:20稀釋即成工作液，可用很長時間。每次染色前宜過濾，去除氧化膜。(2)伊紅染液：伊紅有醇溶性與水溶性之分。將0.5g伊紅溶于100m170％乙醇或蒸餾水即成工作液。1.1.2染色程序（1）用10％甲醛(福爾馬林)固定培養(yǎng)物30min，或以丙酮固定15min。（2）蒸餾水洗1次后，入蘇木精染液5～10min染細胞核。（3）入0.5％鹽酸-70％乙醇溶液30～1min，脫去胞質的著色。此時核呈紫紅色。（4）入堿性溶液堿化，使細胞核變成藍色。如果時間允許，最好用自來水(呈弱堿性)長時間浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此過程須不斷用顯微鏡監(jiān)視，以掌握堿化時間。（5）蒸餾水洗1min，去除殘留的堿性溶液，否則影響伊紅著色。（6）入伊紅染液30s～1min。（7）用梯度乙醇溶液脫水：70％、90％、95％乙醇各30s～1min；100％(2次)各2min。如伊紅為乙醇溶液，略去70％乙醇。（8）用二甲苯透明2次，各5min。（9）樹膠封固。1.1.3染色結果細胞核呈紫藍色或深藍色，大部分細胞的胞質呈粉紅色。如果胞質內含較多核糖體(例如淋巴細胞)則亦呈藍色。1.2吉姆薩染色法此法可將細胞核與胞質同時染色，故便捷快速；但染液配制技術不易準確掌握，效果常不如HE染色穩(wěn)定。1.2.1吉姆薩(Giemsa)染液的配制（1）取1.5g吉姆薩粉末放入50ml甘油，置于60℃溫箱，約3h后溶解。（2）取出后倒入50ml中性甲醇，即為母液。于棕色瓶可長久保存。需要注意的是，有的甲醇內含醋酸，會使染液中的伊紅沉淀出來，不利染色。（3）將母液與0.1mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆薩染液對pH極敏感，偏酸時染色過紅，偏堿時則過藍。所以，工作液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時間不超過48h以免被CO2酸化。1.2.2染色程序（