GB∕T 43160-2023 梨火疫病菌檢疫鑒定方法（正式版）

梨火疫病菌檢疫鑒定方法2023-09-07發(fā)布國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、塔里木大學(xué)、三亞中國檢科院生物安全中心、上海海關(guān)、廣州海關(guān)技術(shù)中心、烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心、天津市濱海新區(qū)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心、昌吉市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中1梨火疫病菌檢疫鑒定方法1范圍本文件描述了梨火疫病菌的分離培養(yǎng)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等檢測方法。本文件適用于梨、蘋果等薔薇科植物植株、砧木、接穗及幼果傳帶的梨火疫病菌的檢疫鑒定以及病害的田間調(diào)查與監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4梨火疫病菌基本信息傳播途徑：染病的植物繁殖材料(包括種苗、砧木和接穗)、昆蟲、風(fēng)、雨以及被污染的包裝材料和運輸工具等多種自然因素及人為因素均可引起梨火疫病的傳播。其中，染病的植物繁殖材料是梨火疫病遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。梨火疫病菌的其他信息參見附錄A。5方法原理根據(jù)梨火疫病菌與抗體之間的特異性反應(yīng)進行免疫學(xué)檢測；根據(jù)梨火疫病菌的特異性DNA序列進行分子生物學(xué)檢測；根據(jù)梨火疫病菌的培養(yǎng)性狀、生物學(xué)特性、寄主范圍及危害癥狀等對病原菌進行分離培養(yǎng)鑒定及致病性測定。6儀器設(shè)備和主要試劑6.1儀器設(shè)備及用具鑒定儀(Biolog)、制冰機、電子天平6.2主要試劑2×PCR反應(yīng)預(yù)混液、2×熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液等，緩沖液及培養(yǎng)基按附錄B配制，除另有規(guī)定27檢疫鑒定方法7.1癥狀檢查檢查植株有無梨火疫病的典型癥狀見附錄A中的癥狀描述，早春為重點監(jiān)測時期。主要檢查嫩否從葉柄基部向上變黑；枝干是否有潰瘍斑以及病組織上是否有菌膿。對出現(xiàn)典型癥狀或疑似癥狀的植株進行拍照記錄，并采集表現(xiàn)癥狀的嫩梢、花簇、枝干、幼果等送實驗室檢測鑒定。對于未表現(xiàn)典型癥狀的幼嫩枝條，應(yīng)重點對其頂端和基部取樣。7.2樣品的制備7.2.1顯癥植株樣品的制備樣品采集后應(yīng)盡快檢測，若不能及時檢測，樣本應(yīng)在4℃~8℃下保存，盡可能不超過一周。采集樣品以及在運輸和處理過程中應(yīng)注意避免交叉污染。樣品處理應(yīng)采用分離培養(yǎng)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測都有效的通用程序。樣品用無菌蒸餾水或pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)處理，直接用于分離培養(yǎng)、免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢測。盡量選擇表現(xiàn)出最典型癥狀并帶有菌膿的植物部位(花朵、嫩梢、幼枝、葉片或果實)。挑取病健交界部位的植物組織，切成約0.1g～1.0g的小塊，放入裝有適量PBS或無菌蒸餾水的離心管或培養(yǎng)皿中研磨或擠壓，靜置至少5min,制成樣品懸浮液，用于后續(xù)分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測。7.2.2無癥植株樣品的制備無癥狀樣品宜單個處理，或者最多10個一組。樣品處理和提取過程中小心避免交叉污染。開花期開始至果實膨大中期，采集花器、幼果幼梢枝段，裝入無菌袋或容器中。從待檢植株上剪下長度約為20cm的嫩梢或花期時的花器。如果在冬天進行采樣檢測，從每株植物上采集5個～10個花蕾。在實驗室內(nèi)，從挑選的植株上剪下花期時的花器、花梗和嫩梢下部幾個葉片的葉柄基部或莖段。稱取0.1g～1.0g植物材料，浸漬在7.2.1描述的無菌蒸餾水或磷酸鹽緩沖液中，制成樣品懸浮液。處理由多個植物材料組成的樣品時，可將其放入裝有適量PBS或無菌蒸餾水的無菌三角瓶中，置于搖床中室溫劇烈振蕩1h,制成樣品懸浮液，可直接用于后續(xù)分析，也可將懸浮液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中12000r/min離心20min,棄上清液，向沉淀中加入2mL無菌蒸餾水或磷酸鹽緩沖液使其重新懸浮，制成樣品富集液，用于后續(xù)分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測。7.3免疫學(xué)檢測對于疑似癥狀樣品，如新鮮的葉片、幼果等，可利用商品化免疫膠體金試紙條進行現(xiàn)場初篩檢測。采用商品化酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法進行檢測，按照說明書進行操作及結(jié)果判定。若檢測結(jié)果為陰性，直接判定為未檢出梨火疫病菌。若檢測結(jié)果為陽性，需進行分離培養(yǎng)鑒定及致病性測定。亦可不進行免疫學(xué)檢測，直接進行分子生物學(xué)檢測。7.4分子生物學(xué)檢測對于植株樣品，按照步驟7.2的方法制備成樣品懸浮液或樣品富集液后，直接用商業(yè)化植物基因組DNA提取試劑盒按照操作說明書提取樣品總DNA,-20℃保存?zhèn)溆?。對于分離培養(yǎng)得到的疑似菌株，可直接或經(jīng)裂解處理后(取適量菌懸液于1.5mL離心管中，97℃3沸水浴10min;12000r/min離心10min,取上清液，-20℃保存)作為分子生物學(xué)檢測反應(yīng)模板。以E.amylovora標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對照，以非E.amylovora的植物細(xì)菌作陰性對照，以雙蒸水代替模板作為空白對照，同時利用靶標(biāo)在梨火疫病菌質(zhì)粒pEA29及染色體基因上的兩對特異性擴增引物對待測樣品進行PCR擴增及凝膠電泳檢測，具體檢測步驟按附錄C執(zhí)行。實時熒光PCR檢測具體步驟按附錄D執(zhí)行，對照設(shè)置同7.4.2。7.5分離培養(yǎng)鑒定按照步驟7.2的方法制備成樣品懸浮液或樣品富集液后，用滅菌接種環(huán)醮取懸浮液于超凈工作臺內(nèi)在LB培養(yǎng)基平板上劃線分離，或者用無菌水對樣品懸浮液進行10倍梯度稀釋，各取100μl稀釋液涂板分離，各重復(fù)3次。將培養(yǎng)基平板放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃恒溫培養(yǎng)24h～48h,挑取可疑單菌落進行純化，轉(zhuǎn)接2次～3次，隨后進行致病性測定、Biolog鑒定、免疫學(xué)或分子生物學(xué)鑒定。在LB培養(yǎng)基上，梨火疫病菌形成乳白色菌落，菌落較大而凸起，光滑呈透鏡狀，而常見的污染菌草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)在LB培養(yǎng)基上則形成黃色菌落。分離物在培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至BUG培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)24h,按照Biolog使用說明，調(diào)整分離物菌懸液濁度分別加入BiologGN微孔板或GENⅢ微孔板中，每孔100μL。微孔板30℃下培養(yǎng)18h后用Biolog儀讀數(shù)，獲得測試結(jié)果。7.7致病性測定7.7.1幼果接種試驗取梨幼果(直徑約3cm～5cm)洗凈晾干，用滅菌刀片橫切果實，置墊有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿上(加少量無菌水)。用接種針蘸取在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h～36h的待鑒定菌落，針刺接種到幼果的果肉組織，一個橫切面接種3個～4個點。接種后，26℃保濕培養(yǎng)，誘導(dǎo)發(fā)病和菌膿的形成。24h后，觀察接種部位有無壞死和菌膿產(chǎn)生。實驗以無菌水為對照。7.7.2枝梢接種試驗剪取梨樹當(dāng)年生的幼嫩枝梢，插于盛有自來水的三角瓶中，用接種針蘸取在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h～36h的待鑒定菌落，刺傷接種到頂端生長點下約5cm～10cm處；也可刺傷后，在刺傷點接種1滴(3μL～5μL)濃度為10?CFU/mL的病菌懸浮液。接種后套袋25℃左右保濕培養(yǎng)，2d～3d后觀察接種點是否出現(xiàn)變黑、組織干癟、枝梢萎蔫等癥狀及是否出現(xiàn)菌膿。8結(jié)果判定對于有典型癥狀的植株樣品，免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢測結(jié)果為陽性，即判定為檢出梨火疫病菌。對于無癥狀樣品，免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢測結(jié)果為陽性，初步判定為檢出梨火疫病菌，若分離培養(yǎng)出典型菌落，Biolog鑒定為陽性或致病性測定出現(xiàn)典型癥狀，則確定檢出梨火疫病菌。其中，分子生物學(xué)檢測可根據(jù)實驗室條件，按照7.4.2或7.4.3進行，任意一種檢測方法的結(jié)果為陽4性則判定分子生物學(xué)檢測結(jié)果為陽性。致病性測定可根據(jù)實驗室條件，按照7.7.1或7.7.2進行，任意一種測定方法出現(xiàn)典型癥狀則判定致病性測定結(jié)果為陽性。9樣品及資料保存9.1樣品及菌種保存樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存。對檢出梨火疫病菌的樣品應(yīng)保存于4℃冰箱中，以備復(fù)核。該類樣品保存期滿后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后再處理。從檢測樣品中分離并鑒定為梨火疫病菌的菌株，應(yīng)妥善保存?？刹捎酶视捅４嬗诔蜏乇浠騼龈杀４?。對不需要長期保存的菌株應(yīng)及時滅菌處理。9.2結(jié)果記錄與資料保存員的簽字?，F(xiàn)場檢疫發(fā)現(xiàn)的可疑癥狀、培養(yǎng)基上的菌落特征和人工接種的典型癥狀等應(yīng)及時拍照保存，酶聯(lián)免疫方法應(yīng)有酶聯(lián)反應(yīng)的原始數(shù)據(jù)，PCR凝膠電泳檢測應(yīng)有電泳結(jié)果照片，熒光PCR檢測應(yīng)有原始數(shù)據(jù)。5(資料性)梨火疫病菌相關(guān)資料A.1名稱與分類地位中文名：梨火疫病菌分類地位：細(xì)菌界(Bacteria),變形菌門(Proteobacteria),γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria),腸桿菌目(Enterobacteriales),腸桿菌科(Enterobacteriaceae),歐文氏菌屬(Erwinia)。目前已報道分布的國家或地區(qū)有：a)亞洲：亞美尼亞、阿塞拜疆、中國(大陸及臺灣地區(qū))、格魯吉亞、印度(馬哈拉施特拉邦)、伊朗、以色列、日本(北海道、本州島)、約旦、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、黎巴嫩、沙特阿拉伯、敘利b)歐洲：阿爾巴尼亞、奧地利、白俄羅斯、比利時、波斯尼亞和黑塞哥維那、保加利亞、克羅地亞、塞(海峽群島、北愛爾蘭);d)大洋洲：澳大利亞、新西蘭；e)北美洲：百慕大群島、加拿大(艾伯塔省、不列顛哥倫比亞省、曼尼托巴、新布倫瑞克省、紐芬蘭省、加拿大西北地區(qū)、新斯科舍省、安大略省、愛德華王子島、魁北克省、薩斯喀徹溫省、育空地區(qū))、墨西哥、美國(阿拉巴馬州、阿肯色州、加利福尼亞州、科羅拉多州、康涅狄格州、特拉華州、克拉荷馬州、俄勒岡州、賓夕法尼亞州、南卡羅來納州、南達(dá)科他州、田納西州、德克薩斯州、猶他州、佛蒙特州、弗吉尼亞州、華盛頓、西弗吉尼亞州、威斯康星州、懷俄明州);f)中美洲及加勒比海地區(qū)：危地馬拉、海地；唐棣屬(Amelanchier)[榿葉唐棣(A.alnifolia)、加拿大唐棣(A.canadensis)、平滑唐棣(A.laevis)]、榆葉梅(Amygdalustriloba)、重瓣榆葉梅(Amygdalustrilobavar.plena)、紫杏(Armeniacadasycarpa)、腺肋花楸(Aroniaarbutifolia)、秘魯胡蘿卜(Arracaciaxanthorrhiza)、假升麻(Aruncussylvester)、木瓜屬(Chaenomeles)[日本木瓜(C.japonica)、貼梗海棠(C.lagenaria)、木瓜(C.sinensis)]、枸子屬(Cotoneaster)[(匍匐枸子(C.adpressus)、藏邊枸子(C.affinis)、四川枸子(C.ambigena)、細(xì)尖枸子6carpus)、小葉枸子(C.microphyllus)、光澤枸子(C.nitens)、暗紅枸子(C.obscurus)、氈毛枸子子(C.xabelii)]、山楂屬(Crataegus)[雞距山楂(C.crusgalli)、道格拉斯山(C.douglasii)、柔(C.succulenta)]、榀梓屬(Cydonia)[榀梓(C.oblonga)]、牛筋條(Dichotomanthustristaniaecarpa)、柿(Diospyroskaki)、君遷子(Diospyroslotus)、云南移(木衣)(Docyniadelavayi)、枇杷屬(Eriobotrya)[(枇杷(E.japonica)]、草莓屬(Fragaria)[智利草莓(F.chiloensis)]、蟲菊(Fragariavirginiana)、加州黑胡桃(Juglanscalifornica)、印度黑胡桃(Juglanshindsii)、黑胡桃(Juglansnigra)、胡桃(Juglansregia)、西博士胡桃(Juglanssieboldiana)、蘋果屬(Malus)[窄葉海棠(M.an-(M.microm.)、楸子(M.prunifolia)、蘋果(M.pumila)、西伯利亞海棠(M.robusta)、三葉海棠積(Osteomelesanthyllidifolia)、酸果木(Peraphyllumramosissimum)、柳葉石楠(Photiniaarbutifo-lia)、臺灣山枇杷(Photiniadeflexa)、光葉石楠(Photiniaglabra)、毛葉石楠(Photiniavillosa)、阿利根尼李(Prunusalleghaniensis)、杏(Prunusarmeniaca)、歐洲甜櫻桃(Prunusavium)、比西氏櫻(Prunusbesseyi)、櫻桃李(Prunuscerasifera)、無瓣櫻(Prunuscerasoides)、歐洲李(Prunussalicina)、杏李(Prunussimonii)、美國稠李(Prunusvirginiana)、火棘屬(Pyracantha)[窄葉火棘(P.angustifoliana)]、梨屬(Pyrus)[杏狀梨(P.amygdaliformis)、杜梨(P.betulaefolia)、白梨(P.bretschneideri)、pa)、沙梨(P.pyrifolia)、麻梨(P.serrulata)、秋子梨(P.sinensis)、川梨(P.variolosa)]、石斑木(Raphiolepisindica)、厚葉石斑木(Raphiolepisumbellata)、薔薇屬(Rosa)[草地薔薇(R.blanda)、絨毛草原薔(R.setigera)]、懸鉤子屬(Rubus)[復(fù)盆子(R.idaeus)]、花楸屬(Sorbus)[美洲花楸(S.cidentalis)、天山花楸(S.tianschanica)]、繡線菊屬(Spiraea)[菱葉繡線菊(S.vanhouttei)]、紅果樹(Stranvaesiadavidiana)[波葉紅果樹(S.davidianavar.undulata)]。A.4危害癥狀該病菌主要侵染植物的花序、葉片、枝條、幼果和樹干等部位，發(fā)病迅速，危害嚴(yán)重。病樹主要從花、葉、嫩枝開始發(fā)病，葉片上產(chǎn)生褐色至黑色病斑，葉片中脈產(chǎn)生黑至褐色條斑(見圖A.1),病斑可擴展至整個枝條，發(fā)病枝條幾天后迅速變色并枯死，造成嚴(yán)重的減產(chǎn)。根據(jù)病害發(fā)生的部位，癥a)花簇枯死：病菌最先侵染花器，產(chǎn)生水漬狀斑，花器不久萎蔫變黑枯死。病菌沿發(fā)病花器的花梗向下擴展至花簇，再擴展至花簇中的其他花朵或幼果，以及葉柄和葉脈，直至整張葉片發(fā)黑枯b)枯梢和枯枝：病菌侵染當(dāng)年生新梢(以春梢為主),侵入點最初表現(xiàn)為表皮變黑，病斑向上下擴7發(fā)展很快，條件適宜時，幾天內(nèi)即可擴展達(dá)15cm～30cm以上，造成整枝死亡。病枝通常變c)潰瘍斑：病菌沿著花簇或新梢向下擴展至上一級的枝條梢和枝干，當(dāng)遇到不適條件時病斑停止斑。潰瘍斑壞死部位通常不深，僅限于皮層。這些潰瘍斑可作為病菌的越冬場所，第二年，春梨火疫病在梨樹上的危害癥狀與亞洲梨火疫病無十分明顯的差別，唯一的癥狀區(qū)別是典型的梨火疫病的病部皮層下面組織為褐色，而亞洲梨火疫病的病部皮層下面組織仍為綠色。圖A.2果柄菌膿癥狀圖A.3幼枝葉片干枯癥狀圖A.4枝條萎蔫枯死癥狀8GB/T43160—2023(規(guī)范性)緩沖液及培養(yǎng)基的配制B.1PBS(pH7.2)氯化鈉(NaCl)8.0g;氯化鉀(KCl)0.2g;十二水磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O)2.9g;磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g;蒸餾水加至1.0L,攪拌混勻至溶解。B.2LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10.0g;酵母浸膏5.0g;氯化鈉(NaCl)10.0g;瓊脂15.0g;蒸餾水加至1.0L,調(diào)節(jié)pH到B.3BUG瓊脂培養(yǎng)基BUG瓊脂培養(yǎng)基57.0g,蒸餾水加至1.0L,調(diào)節(jié)pH到7.4,濕熱滅菌(121℃,20min)。9(規(guī)范性)PCR凝膠電泳檢測C.1PCR檢測引物PCR檢測引物見表C.1。引物名稱引物序列退火溫度產(chǎn)物大小pEA29A5'-CGGTTTTTAACGCTGGG-3'約1kbpEA29B5'-GGGCAAATACTCGGATT-3'FER1-F5'-AGCAGCAATTAATGGCAAGTATAGTCA-3'rgER2-R5'-AAAAGAGACATCTGGATTCAGACAAT-3'C.2PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序使用微量進樣器在冰上配制反應(yīng)體系，總體系25μL,其中2×PCR反應(yīng)預(yù)混液12.5μL,上游引物(10μmol/L)1μL,下游引物(10μmol/L)1μL,模