酶聯(lián)免疫吸附試驗

關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附試驗免疫標(biāo)記技術(shù)定義：將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素等標(biāo)記已知抗體或抗原，通過檢測標(biāo)記物，間接測定未知的抗原或抗體。2.分類：放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶標(biāo)記技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金標(biāo)免疫技術(shù)第2頁,共73頁，星期六，2024年，5月酶免疫技術(shù)概述1、概念以酶作為標(biāo)記物標(biāo)記試劑抗原或試劑抗體，抗原抗體反應(yīng)后，通過檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物，以檢測相應(yīng)抗體或抗原的分析方法。第3頁,共73頁，星期六，2024年，5月酶免疫技術(shù)概述

2、分類

酶免疫組化用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原和抗體

酶免疫技術(shù)均相酶免疫測定酶免疫測定固相酶免疫測定異相酶免疫測定（ELISA）液相酶免疫測定第4頁,共73頁，星期六，2024年，5月酶免疫技術(shù)概述3、酶免疫測定的特點幾乎所有的可溶性抗原系統(tǒng)均可以檢測酶免疫測定具有高度的敏感性和特異性，它的最小可測定值達ng甚至pg水平標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定，且無放射性危害操作簡便，可進行大批量標(biāo)本的測定，自動化程度高既可定性測定又可定量測定第5頁,共73頁，星期六，2024年，5月酶免疫技術(shù)概述4、應(yīng)用廣泛應(yīng)用于免疫相關(guān)性疾病的診斷微量蛋白質(zhì)檢測酶和同工酶檢測腫瘤標(biāo)志物檢測激素（肽類和非肽類）檢測藥物和毒物檢測第6頁,共73頁，星期六，2024年，5月第一節(jié)概述一、常用的酶及其底物：（一）酶選擇的要求①活性高，純度高②作用專一性強③性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)④測定方法簡便易行、敏感、精確⑤酶和底物對人體無害⑥酶和底物價廉易得第7頁,共73頁，星期六，2024年，5月（二）常用的酶和底物1.辣根過氧化物酶（HRP）和底物（1)來源:HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。（2）催化反應(yīng):D2H+H2O2—D+2H2OD2H為色素原，D為色素。（3）底物:四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、鄰苯二胺（OPD）等。第8頁,共73頁，星期六，2024年，5月TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明，加酸終止反應(yīng)后變黃色，可在比色計中定量。(450nm)OPD靈敏度高，比色方便，其缺點是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。第9頁,共73頁，星期六，2024年，5月2.

堿性磷酸酶（ALP）和底物（1)來源大腸桿菌提取，最適PH為8.0；牛腸粘膜提取，最適PH為9.6。（2）催化反應(yīng)及底物對硝基苯磷酸酯+H2O—對硝基酚+磷酸(405nm)第10頁,共73頁，星期六，2024年，5月ALP系統(tǒng)敏感性高于HRP系統(tǒng)，空白值也低。但由于ALP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結(jié)合物時得率較HRP低等原因，國內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。第11頁,共73頁，星期六，2024年，5月二、酶標(biāo)抗體(抗原)的制備1、制備要求：抗原要求純度高、抗原性強?？贵w則要求特異性強、效價高、親和力強、易于分離純化和批量生產(chǎn)。第12頁,共73頁，星期六，2024年，5月2、酶標(biāo)記抗體（抗原)的方法（1）改良過碘酸鈉標(biāo)記法本法只適用于HRP的交聯(lián)。（2）戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團試劑，可以使酶與抗體或抗原的氨基通過它而偶聯(lián)三、酶標(biāo)記物的純化及鑒定第13頁,共73頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗

——ELISA一、基本原理將抗體（抗原）包被在固相載體上，加入待測抗原（抗體）和酶標(biāo)抗體（抗原），待反應(yīng)后充分洗滌，使固相上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，最后加入底物，根據(jù)酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度，而對標(biāo)本中的抗原（抗體）進行定性或定量。第14頁,共73頁，星期六，2024年，5月二、技術(shù)類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。

第15頁,共73頁，星期六，2024年，5月（一）雙抗體夾心法1.概念用同一種抗體分別作為酶標(biāo)抗體和固相抗體以檢測抗原的方法2.應(yīng)用：檢測抗原最常用的方法第16頁,共73頁，星期六，2024年，5月3.原理第17頁,共73頁，星期六，2024年，5月4、特點：非競爭結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測第18頁,共73頁，星期六，2024年，5月5.操作步驟

1）包被抗體。將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。

4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。

第19頁,共73頁，星期六，2024年，5月（+）1、已知抗體包被載體3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物顯色2、加待檢抗原4、加酶作用的底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包被載體2、加待檢物（無抗原）3、加酶標(biāo)抗體（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原第20頁,共73頁，星期六，2024年，5月

雙抗體夾心法中，應(yīng)注意類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。如果待檢標(biāo)本中含有RF，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。使用抗體的F(ab’)2或Fab片段作為酶標(biāo)抗體可消除RF的干擾。6．注意事項第21頁,共73頁，星期六，2024年，5月（二）雙位點一步法1.概念用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，以檢測抗原2.應(yīng)用檢測抗原，較雙抗體夾心法更為簡便省時第22頁,共73頁，星期六，2024年，5月EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體3.原理第23頁,共73頁，星期六，2024年，5月3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無抗原）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYY（-）YYY洗滌洗滌4.操作步驟第24頁,共73頁，星期六，2024年，5月

如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測定。5．注意事項第25頁,共73頁，星期六，2024年，5月（三）競爭法1.概念受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比2.應(yīng)用可用于測定抗原或抗體第26頁,共73頁，星期六，2024年，5月3、原理第27頁,共73頁，星期六，2024年，5月3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被載體YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無抗原）和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被于載體表面YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗滌洗滌4.操作步驟第28頁,共73頁，星期六，2024年，5月5、特點：用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結(jié)合的能力。反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限量的，且前者的結(jié)合位點少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。反應(yīng)后，結(jié)合在固相載體上的酶標(biāo)Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記Ag（Ab）的濃度成反比。第29頁,共73頁，星期六，2024年，5月（四）間接法1.概念用固相抗原及酶標(biāo)記抗抗體檢測抗體的方法2.應(yīng)用

間接法是檢測抗體最常用的方法。只要更換不同的固相抗原，可以用同一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種抗體。第30頁,共73頁，星期六，2024年，5月

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE3.原理第31頁,共73頁，星期六，2024年，5月4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體（+）YYY3.加酶標(biāo)二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包被載體（-）3.加酶標(biāo)二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌4.操作步驟第32頁,共73頁，星期六，2024年，5月（五）雙抗原夾心法檢測抗體

用同一種抗原分別作為酶標(biāo)抗原和固相抗原以檢測抗體的方法用于抗體的檢測1．原理2．應(yīng)用第33頁,共73頁，星期六，2024年，5月E固相抗體標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE3.原理第34頁,共73頁，星期六，2024年，5月4.加酶作用的底物不顯色（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌YEYYYYEYEYEYEYE2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌EEE洗滌洗滌4.操作步驟第35頁,共73頁，星期六，2024年，5月（六）競爭法檢測抗體同競爭法結(jié)合抗原。HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區(qū)別。1．原理第36頁,共73頁，星期六，2024年，5月（1）競爭法檢測HBcAb：①將HBcAg包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)特異性抗體，溫育，洗滌。③加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。2．技術(shù)要點第37頁,共73頁，星期六，2024年，5月固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb第38頁,共73頁，星期六，2024年，5月（2）競爭法檢測HBeAb：①將HBeAb包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和HBeAg，溫育，洗滌。③加入酶標(biāo)HBeAb，溫育，洗滌。④加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。第39頁,共73頁，星期六，2024年，5月固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競爭法檢測HBeAb第40頁,共73頁，星期六，2024年，5月（七）捕獲法1.概念先用固相化的抗人IgM抗體捕獲IgM，再用特異性抗原及其酶標(biāo)抗體檢測相應(yīng)的IgM2.應(yīng)用血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法第41頁,共73頁，星期六，2024年，5月3.原理

第42頁,共73頁，星期六，2024年，5月

采用固相捕獲法檢測IgM類抗體時要注意的是RF（IgM類）及其它非特異IgM的干擾。RF（IgM類）能與固相抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體（動物IgG）反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。

4．注意事項第43頁,共73頁，星期六，2024年，5月

非特異IgM由于其在第一步溫育中，可與特異IgM競爭與固相抗體結(jié)合，所以會影響測定的靈敏度。因此，使用本法測IgM，必須對臨床樣本進行適當(dāng)稀釋。第44頁,共73頁，星期六，2024年，5月三、技術(shù)要點（一）常用的固相載體1.聚苯乙烯——目前最常使用（1）蛋白質(zhì)吸附性能較強，保留免疫活性，價格低廉，不參與化學(xué)反應(yīng)。第45頁,共73頁，星期六，2024年，5月（2）形狀小試管、小珠和微量反應(yīng)板。最常使用的載體是微量反應(yīng)板，也稱為ELISA板。國際通用標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔板，也有8×6的48孔板。

ELISA板的特點是可以同時進行大量標(biāo)本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結(jié)果。第46頁,共73頁，星期六，2024年，5月微量反應(yīng)板返回章目錄第47頁,共73頁，星期六，2024年，5月2.聚氯乙烯與聚苯乙烯類似，特點為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。3.微孔濾膜如硝酸纖維素膜、尼龍膜等。4.含鐵的磁性微粒第48頁,共73頁，星期六，2024年，5月四、測定方法（一）加樣加液體

ELISA中一般需進行1次加樣和4-5次加液。在定性測定中雖不特別強調(diào)加液量的準(zhǔn)確性，但也需要標(biāo)準(zhǔn)化。例如規(guī)定為加液一滴，加液時加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。在定量測定中則加樣加液量應(yīng)力求準(zhǔn)確。第49頁,共73頁，星期六，2024年，5月（二）溫育1.在ELISA中一般有2次抗原抗體反應(yīng)，一次酶促反應(yīng)，反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求進行。2.一般采用水浴，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。第50頁,共73頁，星期六，2024年，5月微量反應(yīng)板返回章目錄第51頁,共73頁，星期六，2024年，5月（三）洗滌——決定著實驗的成敗

1.洗滌的目的是洗去沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。2.洗滌方式：自動洗板機和手工操作。第52頁,共73頁，星期六，2024年，5月（四）顯色1.顯色是ELISA中最后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物，反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素，定量反應(yīng)中，溫度和時間力求準(zhǔn)確。2.顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。第53頁,共73頁，星期六，2024年，5月（五）比色定性測定可采用目視比色或比色計（酶標(biāo)儀）測定結(jié)果。定量測定用比色計測定結(jié)果。結(jié)果準(zhǔn)確性取決于ELISA板底的平整與透明度和比色計的質(zhì)量。比色結(jié)果的表達以往通用光密度（opticaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。第54頁,共73頁，星期六，2024年，5月第55頁,共73頁，星期六，2024年，5月第56頁,共73頁，星期六，2024年，5月第四節(jié)其他酶免疫技術(shù)一、均相酶免疫測定基本原理：利用酶標(biāo)抗原結(jié)合抗體形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗原分離的情況下，直接測定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進而推算出待檢樣品中的抗原量。

主要用于小分子抗原或半抗原的檢測.第57頁,共73頁，星期六，2024年，5月分類

非競爭性結(jié)合法

均相酶免疫測定抗體能抑制酶的活性競爭性結(jié)合法抗體能增強酶的活性第58頁,共73頁，星期六，2024年，5月酶擴大免疫測定技術(shù):

（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）基本原理:半抗原與酶結(jié)合成酶標(biāo)半抗原，保留半抗原和酶的活性。當(dāng)酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，所標(biāo)的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制。第59頁,共73頁，星期六，2024年，5月二、斑點—ELISA

基本原理斑點—ELISA是用吸附蛋白質(zhì)能力很強的硝酸纖維素膜（NC膜）為固相載體，酶催化底物形成不溶性有色沉淀沉積在NC膜上。其檢測原理與普通ELISA相同，在NC膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點為陽性反應(yīng)。第60頁,共73頁，星期六，2024年，5月斑點ELISA(以間接法測抗體為例)第61頁,共73頁，星期六，2024年，5月斑點-ELISA的優(yōu)點NC膜吸附蛋白質(zhì)能力很強，故檢測靈敏度較普通ELISA高6-8倍試劑用量較ELISA節(jié)約約10倍操作簡便，試驗及結(jié)果判斷不需要特殊設(shè)備吸附抗原（抗體）或已有結(jié)果的NC膜可長期保存第62頁,共73頁，星期六，2024年，5月三、免疫印跡法

（immunoblottingtest，IBT）亦被稱為酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法分三個階段進行

:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉(zhuǎn)移酶免疫顯色定位

第63頁,共73頁，星期六，2024年，5月基本原理

將不同分子量的抗原經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離到不同的區(qū)帶，再轉(zhuǎn)移到NC膜上，NC膜上的抗原分別與后加入的特異性抗體和酶標(biāo)抗抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗抗體復(fù)合物，酶催化底物形成不溶性有色產(chǎn)物，使區(qū)帶染色。第64頁,共73頁，星期六，2024年，5月免疫印跡法原理示意圖

第65頁,共73頁，星期六，2024年，5月四、BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗（一）BAS生物素（biontin，B）由卵黃和肝組織中提取，分子量244.31kD生物素分子有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)

Ⅰ環(huán)為咪唑酮環(huán)，與親和素結(jié)合的主要部位；

II環(huán)為噻吩環(huán)，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的惟一結(jié)構(gòu)，經(jīng)化學(xué)修飾后成