駱駝奶樣布魯氏菌檢測(cè)技術(shù)

1駱駝奶樣布魯氏菌檢測(cè)技術(shù)規(guī)范4縮略語BHQ1：無熒光猝滅基團(tuán)(Blackholequencher-1)Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)DNA：脫氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicacFAM：6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein)PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase25.1超凈工作臺(tái)。5.3微流控系統(tǒng)。5.4高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，可控溫至4℃,離心速度可達(dá)12000g以上。5.6渦旋震蕩儀。5.11高壓滅菌鍋。播。感染的母駱駝可能在分娩時(shí)將布魯氏菌垂直傳播傳給新生駱駝。目前，已知有馬耳他布魯氏菌1為隱蔽，增加了診斷的難度，因此通常需要結(jié)合多種檢測(cè)39病原學(xué)鑒定9.1細(xì)菌的分離：取15mL乳樣，2000xg離心15min，用10μL接種環(huán)取奶油層2環(huán)，接種于TSA或選擇9.2菌落觀察9.3微流控qPCR采用引物BrqPCR-F/BrqPCR-R、探針BrqPCRprobe對(duì)），4），9.3.2.4質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.3.2.5結(jié)果判定且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果仍9.3.3微流控檢測(cè)流程將處理后奶樣、磁珠、內(nèi)標(biāo)、qPCR摸索后的引物9.4.1主要儀器9.4.2主要耗材9.4.3材料與試劑9.4.4操作步驟9.4.4.1抗原包被9.4.4.2封閉酶標(biāo)板9.4.4.3加入待檢奶樣59.4.4.4加入HRP標(biāo)記兔抗駱駝IgG加入工作濃度的HRP標(biāo)記兔抗駱駝IgG抗體，100μL/孔，掉封口膜，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加300μL洗滌液，洗滌3次，每次1min，最后一次拍干。9.4.4.5加入底物溶液加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃避光孵育109.4.4.6加入終止液9.4.5質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.4.6結(jié)果判定S/P＞0.29，判為奶樣布魯氏菌抗體陽性，S/6A.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂15g～20g；蛋白胨10g；氯化鈉加水1000mL上述成分混合，加熱使瓊脂溶化，然后調(diào)pH至7.8，再將培養(yǎng)基分裝三角瓶中，然后置20磅(1磅≈0.00689MPa)高壓滅菌A.2血清葡萄糖培養(yǎng)基A.3選擇培養(yǎng)基在1000mL血清葡萄糖培養(yǎng)基中加入下列成分，即為選擇若培養(yǎng)羊種布魯氏菌，需1000ml血清葡萄糖培養(yǎng)基中加入7A液和B液充分混合后即為儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液應(yīng)在密封瓶中4℃避光保存，可使用3個(gè)月。使用時(shí)用蒸餾水按1:40比例將儲(chǔ)備液稀釋，8引物BrZL-F/MSZL-R（25pmol/μL）、膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、pMD-19T質(zhì)粒、感受態(tài)上游引物BrZL-F：5'-TGGCTCGGTTGC下游引物BrZL-R：5'-CGCGCTTGCCTT用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD-19T克隆載體連接，布于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12~16h。篩選出C.5.2根據(jù)擴(kuò)增情況從中選取5~6個(gè)點(diǎn)制作適合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求的標(biāo)準(zhǔn)9超聲波細(xì)胞破碎儀，恒溫?fù)u床，制冰機(jī)，紫外可見分光光度引物（25pmol/μL）,BamHI限制性內(nèi)切酶，XhoI限制性內(nèi)切基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，LB培養(yǎng)基，一次性針頭濾器（孔徑D.3序列合成及表達(dá)載體的構(gòu)建D.4.1取A.3中的菌液，以1:100的00r/min震蕩培養(yǎng)至菌液OD600值0.6～0.8，加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。/min離心10min，棄上清。D.4.4用15mLpH7.4PBS重懸沉淀，充分吹散混勻，將離心管置于碎冰中，再放到超聲波細(xì)胞破碎儀中，以超聲5s，間隔1s的程序，超聲破碎30D.4.7純化后的蛋白溶液，用0.45μm一次性針頭濾器過濾除菌。D.4.8用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白的濃度，蛋白濃度達(dá)到0.D.4.9用高效液相色譜法進(jìn)一步純化并分析蛋白純度，純度達(dá)到90%以上符合要求。Na2CO3NaHCO3200mL將Na2CO3和NaHCO3加入去離子水中，完全溶解后，用0.45μm一次性針頭濾器過濾除菌，室溫保