GB∕T 30744-2014 深海微生物樣品前處理技術(shù)規(guī)范（正式版）

深海微生物樣品前處理技術(shù)規(guī)范2014-06-09發(fā)布GB/T30744—2014 I 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語、定義和縮略語 4試劑和材料 25儀器與設(shè)備 6一般規(guī)定 7樣品現(xiàn)場處理 68深海微生物菌種分離 9深海微生物基因組DNA提取 10深海微生物宏基因組DNA提取 11深海生物樣品及微生物資源保存 附錄A(資料性附錄)深海微生物樣品前處理記錄表格式 附錄B(資料性附錄)耐壓菌株分離 附錄C(資料性附錄)微生物菌種分子鑒定 附錄D(資料性附錄)宏基因組Cosmid文庫構(gòu)建 表A.1深海樣品采樣記錄表 表A.2深海微生物分離鑒定記錄表 表A.3深海微生物基因組DNA提取記錄表 表A.4深海樣品宏基因組DNA提取記錄表 表A.5深海樣品保藏記錄表 表A.6深海細菌保藏記錄表 表A.7深海放線菌保藏記錄表 表A.8深海真菌保藏記錄表 表A.9深海樣品宏基因組DNA文庫記錄表 表C.116SrRNA基因通用引物的適用范圍 I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由國家海洋局提出。本標準由全國海洋標準化技術(shù)委員會(SAC/TC283)歸口。本標準起草單位：國家海洋局第三海洋研究所。1深海微生物樣品前處理技術(shù)規(guī)范本標準規(guī)定了深海微生物樣品前處理中的技術(shù)要求、工作條件、深海樣品現(xiàn)場處理、微生物及遺傳物質(zhì)提取、保存及資料處理。本標準適用于水深大于或等于1000m的深海微生物樣品的現(xiàn)場處理、提取與保存。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T12763.4海洋調(diào)查規(guī)范第4部分：海洋化學要素調(diào)查GB/T12763.6海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查HY/T058海洋調(diào)查觀測監(jiān)測檔案業(yè)務(wù)規(guī)范3術(shù)語、定義和縮略語下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本文件。3.1術(shù)語和定義深海deepsea水深大于或等于1000m的海洋區(qū)域。微生物樣品microorganismsamples已培養(yǎng)或已提取純化的，具有一定科學意義，具有實際或潛在實用價值的，可直接應(yīng)用于各種科學研究的各種菌株(包括細菌、真菌、放線菌等)、DNA/RNA等遺傳物質(zhì)；以及包含上述菌株和遺傳物質(zhì)的深海樣品，包括水樣、沉積物樣、巖石樣等。在開展深海微生物研究工作之前對采集自深海的各種微生物樣品(見3.1.2)所進行的各種處理，包括：深海生物樣品現(xiàn)場處理、深海微生物菌種分離、深海微生物基因組DNA提取、深海微生物宏基因組DNA提取、深海生物樣品及微生物資源保藏。低溫微生物cold-adaptedmicroorganism在37℃以下的溫度中生長良好的微生物(包括細菌、真菌、放線菌等),最適生長溫度等于或低于嗜熱微生物thermophile在等于或高于55℃的溫度中生長良好的微生物(包括細菌、真菌、放線菌等)。2不經(jīng)菌株分離篩選步驟，直接從環(huán)境樣品中提取的遺傳物質(zhì)(DNA或RNA),包含了樣品中所有微生物的基因信息。寡營養(yǎng)培養(yǎng)基oligotraphicmedium與正常培養(yǎng)基成分相同，但碳源、氮源營養(yǎng)物質(zhì)濃度減為十分之一的培養(yǎng)基。16SrRNA:細菌染色體上編碼核糖體RNA16S亞基的基因18SrRNA:真核生物染色體上編碼核糖體RNA18S亞基的基因Amp:氨芐青霉素(Ampicillin)BOD:生化需氧量(Biochemicaloxygendemand)CTAB:十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltriethylammnoniumbromide)dATP:脫氧腺苷三磷酸(Deoxyadenosinetriphosphate)dGTP:脫氧鳥苷三磷酸(Deoxyguanosinetriphosphate)DNA:脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)DMF:二甲基酰胺(N,N-Dimethylformamide)EDTA:乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAcid)GYT:甘油酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基(Glycerolyeastextracttryptonemedium)LB:肉湯培養(yǎng)基(Luria-bertani)OD:光密度(Opticaldensity)PFGE:脈沖場凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis)PDA:馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Potatodextroseagar)RNaseA:核糖核酸酶A(RNAaseA)SDS:十二烷基硫酸鈉(Dodecylsulfate,sodiumsalt)Tris:三羥甲基氨基甲烷(2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol)TE:Tris-HCl和EDTA-Na?配成的緩沖液TBE:Tris-HCl、硼酸和EDTA-Na?配成的緩沖液YPD:酵母膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(Yeastextractpeptonedextrosemedium)λDNA/EcoRI+HindⅢ:經(jīng)EcoRI酶(4.1)和HindⅢ酶(4.2)兩種核酸內(nèi)切酶消化后的λ噬4試劑和材料*34.7瓊脂糖酶。4.8液體石蠟。4.12低熔點瓊脂糖凝膠：10g低熔點瓊脂糖，緩慢加入1L水中，混勻，配制成10g/L的低熔點瓊脂4.13人工海水，按照GB/T12763.4的規(guī)定配制。4.14乙醇溶液：用水配制750mL/L(體積百分數(shù)為75%)的乙醇溶液。4.15稀酸溶液：量取83mL分析純濃HC1,緩慢加入917mL水中，混勻，制成濃度為1mol/L的稀酸溶液。4.16稀堿溶液：稱取40g分析純NaOH,溶解于水中，混勻，加水稀釋至1L,制成濃度為1mol/L的稀堿溶液。4.17NaI溶液：稱取900g分析純NaI,溶解于水中，混勻，加水稀釋至1L,制成濃度為6mol/L的4.18甘油溶液：量取800mL分析純甘油，溶解于200mL水中配制成800mL/L的甘油溶液，混勻后滅菌處理。4.19Tris-HCl貯液：稱取121.14gTris,溶解于8水補足體積至1L,配成1mol/L的貯液，使用時根據(jù)實驗要求進行稀釋。4.20TE溶液：稱取0.373gEDTA-Na?,量取10mLTris-HCl貯液(4.19),將二者溶解于800mL水中，用稀堿溶液(4.16)調(diào)節(jié)pH值為8.0,用水補足體積至1L,滅菌處理。4.21Amp溶液：將1gAmp溶解于5mL水中，配制為0.2g/mL的溶液。87.8gNaCl和10gCTAB,溶解于700mL水中，加入100mLTris-HCl貯液，用稀酸溶液和稀堿溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0,加水補足體積至1L后滅菌處理。4.23凝膠回收洗滌液：稱取2.4gTris,溶解于200mL水中，用稀酸溶液調(diào)節(jié)pH值為7.4。加入292.5gNaCl,0.37gEDTA-Na?,用水補足體積至500mL,滅菌處理后，冷卻至室溫，在超凈臺中加入500mL無水乙醇。4.24甘露醇緩沖液：稱取182.2g甘露醇，37.3gEDTA-Na?,溶解于500mL水中，溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5,滅菌處理。4.25GYT培養(yǎng)基：稱取1.25g酵母膏，2.5g蛋白胨溶解于800mL水中，加入10足體積至1L,滅菌處理。a)稱取20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5gNaCl,0.19gKCl,0.95gb)稱取10g葡萄糖，溶解于80mL水中，用水補足體積至100mL,用0.22μm的濾膜過濾除菌，c)在滅菌后的4.26a)溶液中加入36mL4.26b)溶液，混勻。4.28[甲基-3H]胸腺嘧啶核苷工作液：取放射性比活度高于1.85TBq/mmol的[甲基-3H]胸腺嘧啶核44.29[4,5-3H]亮氨酸工作液：取放射性比活度高于2.22TBq/mmol的[4,5-3H]亮氨酸，用水稀釋成20nmol/mL的工作液。4.30D-[ULC]葡萄糖工作液：取放射性比活度高于7.4GBq/mol的D-[UL1‘C]葡萄糖，用35g/的NaCl溶液稀釋成0.185MBq/mol的工作液，并按10μg/mL的量加入非放射性葡萄糖，然后定量分裝于安瓿瓶中，封熔后于0.07MPa高壓滅菌15min備用。4.33SDS溶液：稱取100gSDS,溶解于水中，混勻，加水稀釋至1L,制成質(zhì)量濃度為10%的SDS4.34蛋白酶K溶液：稱取20g蛋白酶K,溶解于水中，混勻，加水稀釋至1L,制成濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液。4.35NaCl溶液：稱取41gNaCl,溶解于水中，混勻，加水稀釋至1L,制成濃度為0.7mol/L的NaCl4.36CTAB溶液：稱取10gCTAB,溶解于水中，混勻，加水稀釋至1L,制成質(zhì)量濃度為10%的4.38醋酸鉀溶液：稱取490.7g醋酸鉀，溶解于水中，混勻，加水稀釋至1L,制成濃度為5mol/L的醋a)用水將Tris-HCl貯液稀釋100倍，用稀酸溶液調(diào)節(jié)至pH值7.5,備用；b)稱取1gRNaseA,0.09gNaCl,溶解于100mL4.39a)溶液中，配成濃度為10mg/mL的溶液，于100℃加熱15min,按每管1mL分裝于小離心管中，于一20℃保存。4.40Silica漿液：每克硅土(Silica)干粉加入3mL濃硝酸混勻，浸泡5h,然后反復用水洗至中性，去除4.41溶菌酶貯液：用水將Tris-HCl貯液稀釋100倍后加入溶菌酶，配成溶菌酶濃度為10mg/mL的4.43IPTG貯液：將IPT4.44TBE電泳緩沖液：稱取108gTris,7.5gEDTA-Na?,55g硼酸，溶解于800mL水中，用稀酸溶液和稀堿溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0,配制成貯液，使用時用水稀釋20倍使用。4.45MgCl?溶液：稱取0.95gMgCl?,溶解于10mL水中配制成1mol/L的MgCl?溶液，滅菌處理，按每管1mL分裝于小離心管中，于一20℃保存。4.46硫酸錳溶液：稱取36.4g硫酸錳(MnSO?·H?O)溶于水中，稀釋至100mL。4.47堿性碘化鉀溶液：稱取50g氫氧化鈉，溶解于30mL～40mL水中，另稱取15g碘化鉀溶于成LB固體培養(yǎng)基。配制LB液體培養(yǎng)基時無需加入瓊脂粉。54.49含Amp的LB培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃~60℃,按50mL/L的比例加入Amp溶液，再按18g/L比例加入瓊脂粉，滅菌處理，制成含Amp的LB固體培養(yǎng)基。配制含Amp的LB液體培養(yǎng)基時無需加入瓊脂粉。4.502216E培養(yǎng)基：稱取5g蛋白胨，1g酵母膏，0.01gFePO?,溶解于1L人工海水(見4.13)中，用稀堿溶液調(diào)節(jié)至pH值7.4～7.8,再按18g/L比例加入瓊脂粉，滅菌處理，制成2216E固體培養(yǎng)基。配制2216E液體培養(yǎng)基時無需加入瓊脂粉。4.51高氏一號培養(yǎng)基，按以下步驟制備：a)稱取20g可溶性淀粉，1gKNO?,0.5gK?HPO?,1gMgSO?·7H?O,0.01gFeSO?,溶解于1L海水(4.13)中，用稀堿溶液調(diào)節(jié)至pH值7.2～7.4,待用；b)稱取5g重鉻酸鉀溶于1L水中配制成重鉻酸鉀溶液；c)按10mL/L的比例將重鉻酸鉀溶液加入4.51a)溶液中，再按18g/L比例加入瓊脂粉，滅菌處理，制成高氏一號固體培養(yǎng)基。配制高氏一號液體培養(yǎng)基時無需加入瓊脂粉。4.52PDA培養(yǎng)基：將200g去皮切塊的馬鈴薯放入1L人工海水中煮沸30min,用紗布過濾，補加人工海水至1L,加入20g葡萄糖，再按18g/L比例加入瓊脂粉，滅菌處理，待冷卻至50℃~60℃時，加入50mg慶大霉素，制成PDA固體培養(yǎng)基。配制PDA液體培養(yǎng)基時無需加入瓊脂粉。4.53YPD培養(yǎng)基：稱取20g蛋白胨，20g葡萄糖，10g酵母膏，溶解于1L人工海水中，用稀堿溶液調(diào)節(jié)至pH值7.4～7.8,再按18g/L比例加入瓊脂粉，滅菌處理，制成YPD固體培養(yǎng)基。配制YPD液體培養(yǎng)基時無需加入瓊脂粉。5儀器與設(shè)備5.1濾膜：材料為醋酸纖維或硝化纖維的微孔濾膜，直徑25mm和47mm,孔徑包括0.22μm和5.2小離心管：材料為聚丙烯的離心管，容量為0.5mL、1.5mL、2mL、5mL和50mL。5.3槍頭：材料為聚丙烯的微量加樣器套頭，規(guī)格為0.2mL、1mL。5.4超低溫冰箱：最低保存溫度為一80℃的冰箱。5.5生化培養(yǎng)箱：培養(yǎng)室溫度可在0℃~60℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。5.6振蕩培養(yǎng)箱：培養(yǎng)室溫度可在0℃~60℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)速可在0r/min～300r/min范圍內(nèi)5.7電泳儀：最大輸出電壓為250V以上，最大輸出電流為300mA以上。5.8高速冷凍離心機：離心可在4℃~20℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，離心管規(guī)格50mL,轉(zhuǎn)速可在0r/min~18000r/min范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。5.9濕盒：材料為聚丙烯或其他可耐121℃高溫滅菌的塑料，長×寬尺寸大于或等于130mm×130mm,內(nèi)部放置若干用水潤濕的棉球。5.10小離心機：可使用規(guī)格為0.5mL和1.5mL的離心管，轉(zhuǎn)速在0r/min～13000r/min范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。5.11分光光度計：波長范圍190nm～1100nm可調(diào)，測量所用比色杯的光徑為10mm。5.12紫外投射儀：波長為280nm,觀察面積為140mm×110mm。5.13玻璃試管：直徑×長度為18mm×180mm的平口玻璃試管。5.14金屬網(wǎng)篩：孔徑包括0.30mm、0.20mm、0.15mm。5.15安瓿管：內(nèi)徑8mm,長度不小于100mm的中性玻璃管。5.16塑料凍存管：材料為聚丙烯，或其他可耐121℃高溫和液氮的塑料管，容積大于或等于5mL。5.17電轉(zhuǎn)化儀：最大輸出電壓2500V,輸出電壓可在50V～2500V范圍內(nèi)調(diào)整，最大輸出電流6125A,電弧時限定值1500A。5.18脈沖場電泳儀系統(tǒng)：最高輸出電壓350V,電壓連續(xù)可調(diào)，最大輸出電流0.5A,轉(zhuǎn)換范圍50ms到18h,轉(zhuǎn)換角度為0°~360°,包括電泳儀、水浴循環(huán)儀、電泳槽。6一般規(guī)定6.1深海微生物樣品前處理工作程序包括：深海生物樣品現(xiàn)場處理、深海微生物菌種分離和分類、深海微生物遺傳物質(zhì)提取、深海微生物宏基因組DNA提取、深海生物樣品及微生物資源保藏。6.2深海微生物樣品前處理程序中除了深海生物樣品現(xiàn)場處理以外，其他操作均應(yīng)在超凈工作臺中進行。6.3微生物樣品應(yīng)從原位海水或未與上層海水發(fā)生交換的深海沉積物中獲取。水樣應(yīng)選用CTD采水器采集的樣品，沉積物樣品應(yīng)選用多管采樣器、箱式采樣器采集的樣品。6.4在深海微生物樣品前處理討程中.除特別說明.滅菌處理均指于高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min處理的過程。7樣品現(xiàn)場處理7.1技術(shù)要求7.1.1采水器在入水前應(yīng)用原位海水沖洗3次，采泥器在入水前應(yīng)用原位海水將其上附著的泥樣完全洗凈，以防止不同站點之間樣品的交叉污染。7.1.2用于分樣的器具均應(yīng)滅菌，如無法高壓高溫滅菌的，應(yīng)用乙醇溶液處理后使用。7.1.3分樣過程應(yīng)于2h內(nèi)完成，若無法立即處理，應(yīng)暫時于4℃保存，但不應(yīng)超過24h。7.1.4分樣后保存的沉積物樣品每份不少于30g。7.2樣品適用范圍7.2.1箱式采樣器采集的樣品不應(yīng)用于需要分層次的微生物分析中。7.2.2多管采樣器采集的沉積物樣品及上覆水可應(yīng)用于各種微生物分析。7.2.3CTD采水器采集的水樣主要用于生態(tài)學分析，采集時應(yīng)設(shè)計好采水的層次。7.3沉積物樣品的現(xiàn)場處理7.3.1箱式采樣器樣品的現(xiàn)場處理刮去表層3cm的沉積物樣，插入無菌取樣管(口徑5cm～15cm)。將取樣管拔出，用經(jīng)滅菌處理過的50mL小離心管(見5.2)插入柱狀樣中取樣后密封，分兩份分別于4℃和—20℃保存。另取一份樣品用于微生物的現(xiàn)場分離培養(yǎng)，分離步驟見8.3、8.4、8.5和8.6。7.3.2多管采樣器樣品的現(xiàn)場處理將采樣管置于超凈工作臺前，用滅菌后的導管吸出上覆水置于采水瓶中。將沉積物樣品頂出，每隔3cm用無菌不銹鋼板分層取樣，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺中。7去除外圈1cm的沉積物樣品，將中心的沉積物樣品分成三份裝入無菌采樣瓶，分別于4℃、—20℃和液氮罐保存。另取一份樣品用于微生物的現(xiàn)場分離培養(yǎng)，分離步驟見8.3、8.4、8.5和8.6。7.4海水樣品的現(xiàn)場處理根據(jù)水深設(shè)置采樣層次，每個站位按500m間隔取樣，例如：1000m、1500m、2000m、2500m、3000m、離底200m、離底50m和離底5m。CTD采水器上甲板后，按水深設(shè)置用采樣瓶從CTD采水器的各對應(yīng)管中分裝水樣。7.4.3水樣濾膜過濾每5L水樣經(jīng)0.45μm和0.22μm濾膜兩級過濾后，將0.22μm的濾膜放入凍存管中，分別于4℃、7.4.4用于熒光直接計數(shù)的水樣處理按20mL/L的比例在50mL水樣中加入甲醛溶液(見4.27)固定樣品，于2℃~8℃低溫保存。固定后的樣品宜立即分析，或在4℃中避光保存，保存期限不宜超過一周。7.4.5用于培養(yǎng)基平板計數(shù)的水樣處理按10mL/L的比例在水樣中加入滅菌處理過的吐溫一80,于—20℃保存。7.4.6用于細菌生產(chǎn)力分析的水樣處理取3支50mL帶蓋培養(yǎng)管，各加入20mL水樣，其中一管加1mL甲醛溶液混勻作為對照，再向各管加入[甲基-3H]胸腺嘧啶核苷工作液(見4.28)作為示蹤劑，使其在樣品中的最終濃度為250nmol/L,混勻，置于原位現(xiàn)場溫度下培養(yǎng)1h,再加入1mL甲醛溶液搖勻，保存于2℃~8℃中。上述步驟中示蹤劑可用[4,5-3H]亮氨酸工作液(見4.29)代替。7.4.7用于微生物異養(yǎng)活性測定的水樣處理取3個125mL培養(yǎng)瓶，各加入100mL水樣，其中1瓶加入5mL甲醛溶液作對照，再向各瓶中加入1mLD-[UL-4C]葡萄糖工作液(見4.30),混勻后置于原位現(xiàn)場溫度下培養(yǎng)1h,加入5mL甲醛溶7.4.8用于生態(tài)呼吸率測定的水樣處理將水樣按溶解氧測定方法的要求注入4個250mLBOD培養(yǎng)瓶中。其中兩瓶立即進行溶解氧的固定，用吸管插入溶解氧瓶的液面下加入1mL硫酸錳溶液(4.46)、2mL堿性碘化鉀溶液(4.47),蓋好瓶塞。顛倒混合數(shù)次，靜置。待棕色沉淀物降至瓶內(nèi)一半時，再顛倒混合1次，靜置至沉淀物下降到瓶底。另兩瓶置暗處于原位現(xiàn)場溫度下培養(yǎng)1d后，取出溶解氧的固定的BOD培養(yǎng)瓶。7.5資料處理8參數(shù)記錄于深海樣品采樣記錄表(參見表A.1)。數(shù)據(jù)資料處理記錄應(yīng)按HY/T058的要求歸檔。8深海微生物菌種分離8.1總則本章規(guī)定了從所采集的沉積物、水等樣品中分離微生物菌株，包括低溫菌、常溫菌和嗜熱菌。菌種分離的工作程序包括：樣品稀釋、涂布于培養(yǎng)基平板、挑菌、復篩、菌株生長溫度確定、菌株培養(yǎng)。所有菌株操作均在常壓下進行，如進行耐壓微生物的分離可參見附錄B。8.2技術(shù)要求8.2.1進行微生物菌種分離應(yīng)選用4℃保存的樣品，或用剛采集的樣品進行現(xiàn)場分離。8.2.2所有的小離心管(5.2)、槍頭(5.3)、配制的溶液均應(yīng)滅菌處理，冷卻后使用。8.2.3培養(yǎng)基的配置應(yīng)采用下列海水之一進行：a)現(xiàn)場原位海水，經(jīng)0.45μm濾膜過濾。b)避光保存3個月以上的天然海水，經(jīng)0.45μm濾膜過濾的濾液。c)人工海水。8.2.4分離菌株時除選用相應(yīng)的培養(yǎng)基外，還應(yīng)用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)。8.3基本操作8.3.1沉積物樣品中微生物的分離培養(yǎng)沉積物樣品中微生物的分離培養(yǎng)步驟如下：a)取1mL的沉積物樣品，用滅菌處理的海水稀釋到10mL,制成10-1樣品稀釋液，振蕩均勻，備用；b)取1mL8.3.1a)溶液，用滅菌處理的海水稀釋到10mL,制成10-2樣品稀釋液，振蕩均勻，備用；c)按8.3.1a)和8.3.1b)的步驟依次稀釋成10-3～10-°的樣品梯度稀釋液，振蕩均勻，備用；d)取各梯度樣品梯度稀釋液分別涂布于培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，選取菌落在50個～100個之間的培養(yǎng)基平板進行分離培養(yǎng)。低溫菌培養(yǎng)溫度為2℃~8℃,高溫菌培養(yǎng)溫度為55℃,培養(yǎng)時間宜為72h以上。8.3.2含菌濾膜中微生物的分離培養(yǎng)取按7.4.3處理的含菌濾膜，在超凈工作臺中剪碎裝入50mL小離心管中，浸泡于經(jīng)滅菌處理的海水中，充分振蕩制成菌懸液，除去濾膜，菌懸液經(jīng)8000r/min離心10min后除去上清液，另加入1mL經(jīng)滅菌處理的海水，將沉淀充分混勻，按8.3.1中的方法進行分離培養(yǎng)。8.3.3菌株生長溫度的確定從培養(yǎng)基平板上分離得到的單菌落經(jīng)鏡檢為純種后，接種于LB液體培養(yǎng)基(見4.48)或2216E液體培養(yǎng)基(4.50)中培養(yǎng)。在0℃~40℃的范圍內(nèi)進行培養(yǎng)，溫度分別設(shè)置為4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃和40℃,每個溫度設(shè)三個平行樣。工作臺中吸出1mL菌液，測定600nm處的OD值。9根據(jù)測定結(jié)果確定菌株的最適生長溫度和生長溫度范圍。8.4低溫菌分離8.4.1技術(shù)要求所有操作均應(yīng)在無菌條件下進行。所有操作應(yīng)在低于10℃的條件下進行。用于分離篩選的沉積物樣品、水樣均應(yīng)選用在4℃保存的樣品。細菌的分離篩選采用2216E培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和相應(yīng)的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基。放線菌的分離篩選采用高氏一號培養(yǎng)基(4.51)和相應(yīng)的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基。真菌的分離篩選采用PDA培養(yǎng)基(4.52)、YPD培養(yǎng)基(4.53)和相應(yīng)的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基。8.4.2菌株分離步驟按8.3.1和8.3.2的規(guī)定制備樣品梯度稀釋液，取200μL各梯度樣品梯度稀釋液涂布于相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上。在10℃中放置直到涂布的樣品梯度稀釋液完全滲透入培養(yǎng)基中后，將培養(yǎng)基平板倒置，于10℃培養(yǎng)直至長出菌落。將長出的單菌落分別轉(zhuǎn)接至新的相同培養(yǎng)基平板上，并做好相應(yīng)的記號，于10℃中培養(yǎng)。將培養(yǎng)基平板上長出的單菌落多次劃線分離培養(yǎng)，根據(jù)平板上的菌落形態(tài)和顏色，以及鏡檢檢測，直至獲得純的單菌落。根據(jù)菌落形態(tài)差別進行菌株的區(qū)分，排除重復的菌株。對形態(tài)近似的菌落，通過比較細菌和放線菌的16SrRNA基因序列，或真菌的18SrRNA基因序列，進行分子鑒定(步驟參見附錄C),排除重復的菌株。8.5常溫菌分離常溫菌分離步驟按8.4的規(guī)定進行，其培養(yǎng)溫度為37℃。8.6嗜熱菌分離用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，所用的濕盒(5.9)應(yīng)每天加水或更換濕棉球。用液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時，瓶口應(yīng)采用通氣的硅膠塞代替紗布進行密封。選用的固體培養(yǎng)基應(yīng)采用高熔點瓊脂粉，其濃度為8g/L。細菌的分離篩選采用2216E培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和相應(yīng)的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基。放線菌的分離篩選采用高氏一號培養(yǎng)基和相應(yīng)的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基。真菌的分離篩選采用PDA培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基和相應(yīng)的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基。8.6.2菌株分離步驟吸取500μL10-1樣品稀釋液[8.3.1a]]于培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂抹均勻。將培養(yǎng)基平板裝入濕盒中，置于高溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度應(yīng)根據(jù)采樣現(xiàn)場的溫度和待形成菌落后，挑單菌落進行多次劃線轉(zhuǎn)接，根據(jù)平板上的菌落形態(tài)和顏色，以及鏡檢檢測，直至獲得純的單菌落。對形態(tài)近似的菌落，通過比較細菌和放線菌的16SrRNA基因序列，或真菌的18SrRNA基因序列，進行分子鑒定后(步驟參見附錄C),排除重復的菌株。8.7資料處理將所分離的菌株來源、種類、培養(yǎng)條件等相關(guān)參數(shù)記錄于深海微生物分離鑒定記錄表(參見表A.2)。數(shù)據(jù)資料處理記錄應(yīng)按HY/T058的要求歸檔。9深海微生物基因組DNA提取9.1總則本章規(guī)定了從深海微生物菌株中提取基因組DNA的方法，包括細菌、放線菌、真菌。提取的工作9.2技術(shù)要求9.2.1基因組DNA應(yīng)達到的指標為：OD?sa/OD的比值應(yīng)在1.8～2.0之間，且OD2so/OD?a的比值應(yīng)大于2.0。9.2.2經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠(4.11)電泳檢測，以λDNA/EcoRI+HindⅢ為分子量標記，所提的DNA大小應(yīng)與標記物中最大的一條帶位置相近。9.2.3所提取的微生物基因組DNA以每管20μL～50μL的體積分裝于小離心管中，于一80℃保存，不應(yīng)反復凍融。9.2.4所用的小離心管、槍頭均應(yīng)滅菌，冷卻后使用。9.3基因組DNA提取按照8.3.3確定菌株生長溫度，挑取菌落接種入5mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，裝入1.5mL小離心管中，用小離心機5000r/min離心5min,棄上清液，重復分批進行離心，將5mL培養(yǎng)液的菌體完全收集下來。在收集后的菌體沉淀物中加入1.5mL水，懸浮菌體，用小離心機5000r/min離心5min,棄上清液重復操作1次。加入500μL～1mL鹽酸胍溶液(4.32),輕輕混勻后靜置5min,直至菌液裂解清亮，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(4.31),混勻，13000r/min離心5min,將上層水相移入新管，在新管內(nèi)緩慢加入等體積異丙醇，混勻后放置5min。13000r/min離心15s,吸去上清液，用乙醇溶液(4.14)洗沉淀物兩次，放置超凈工作臺內(nèi)吹干，加入200μLTE溶液(4.20),放置5min溶解沉淀。等體積加入異丙醇，再按10mL/L的比例加入MgCl?溶液(4.45),輕輕混勻，于-20℃中放置30min。并重復1次，然后將沉淀物放置超凈工作臺內(nèi)吹干后加入50μLTE溶液，于一20℃保存。用分光光度計測定純度。如純度達不到9.2.1中所列要求，應(yīng)按9.4的規(guī)定采用凝膠回收方法進行進一步純化。用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的大小，如未達到9.2.2中要求，應(yīng)重新提取DNA。注：細菌基因組DNA可采用商用試劑盒提取。按照8.3.3確定菌株生長溫度，挑取菌落接種入5mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，裝入1.5mL小離心管中，用小離心機5000r/min離心5min,棄上清液，重復分批進行離心，將5mL培養(yǎng)液的菌體完全收集下來。在收集后的菌體沉淀物中加入1.5mL水，懸浮菌體，用小離心機5000r/min離心5min,棄上清液重復操作1次。K溶液(4.34),混勻，于37℃水浴1h。加入100μLNaCl溶液，充分混勻，再加入80μLCTAB溶液(4.36),混勻，于65℃水浴10min,加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分混勻，13000r/min離心5min。將上清液轉(zhuǎn)入新管中，如果難以移出上清液，先用無菌接種針除去界面物質(zhì)，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分混勻，13000r/min離心5min,將上清液轉(zhuǎn)入新管中。按等體積加入異丙醇，按10mL/L的比例加入MgCl?溶液，混勻，于一20℃中放置30min。13000r/min離心5min,去除上清液，加入并重復1次，然后將沉淀物用放置超凈臺內(nèi)吹干后加入50μLTE溶液，于一20℃保存。用分光光度計測定純度，如純度達不到9.2.1中要求，應(yīng)按9.4的規(guī)定采用凝膠回收方法進行進一步純化。用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的大小，如未達到9.2.2中要求，應(yīng)重新提取DNA。注：放線菌基因組DNA可采用商用試劑盒提取。按照8.3.3確定菌株生長溫度，挑取菌落接種入5mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，裝入1.5mL小離心管中，用小離心機5000r/min離心5min,棄上清液，重復分批進行離心，將5mL培養(yǎng)液的菌體完全收集下來。在收集后的菌體沉淀物中加入1.5mL水，懸浮菌體，用小離心機5000r/min離心5min,棄上清液重復操作1次。往沉淀物中加入0.5mL甘露醇緩沖液(4.24),懸浮菌體沉淀，加入20μL蛋白酶K溶液和10000r/min離心2min,棄上清液，往沉淀中加入0.5mLTE溶液，懸浮菌體沉淀，加入20μLSDS溶液，混勻，于65℃水浴1h。加入0.2mL醋酸鉀溶液(4.38),于0℃中水浴1h,14000r/min離心10min,移取上清液至新的小離心管中。等體積加入異丙醇，按10mL/L的比例加入MgCl?溶液，混勻，于一20℃中放置30min。13000r/min離心5min,去除上清液，加入200μL無水乙醇，放置3s～5s后棄去無水乙醇，并重復1次，然后將沉淀物放置超凈工作臺內(nèi)吹干后加入50μLTE溶液，于一20℃保存。用分光光度計測定純度，如純度達不到9.2.1中要求，應(yīng)按9.4的規(guī)定采用凝膠回收方法進行進一步純化。用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的大小，如未達到9.2.2中要求，應(yīng)重新提取DNA。注：真菌基因組DNA可采用商用試劑盒進行提取。9.4DNA凝膠回收9.4.1將凝膠放在紫外透射儀(5.12)上將目的基因所對應(yīng)的條帶切下，稱重。9.4.2每克條帶加入3mLNaI溶液(4.17),55℃水浴至膠完全溶解。9.4.3加入5μLSilica漿液(4.40),在0℃水浴30min,充分振蕩數(shù)次。9.4.414000r/min離心20s,棄上清液。9.4.5加入400μL凝膠回收洗滌液(4.23),充分懸浮沉淀物，14000r/min離心20s,棄上清液。9.4.6重復步驟9.4.5一次，吸干液體，并放置于超凈工作臺內(nèi)，進一步吹干殘余液體。9.4.7加入10μL水，55℃水浴5min后14000r/min離心5min。9.4.8吸取上清液至新的小離心管中，用分光光度計(5.11)測定DNA含量，于一20℃保存。9.5資料處理將所提取的微生物種類、DNA濃度、純度等相關(guān)參數(shù)記錄于深海微生物基因組DNA提取記錄表(見表A.3)。數(shù)據(jù)資料處理記錄應(yīng)按HY/T058的要求歸檔。10深海微生物宏基因組DNA提取本章規(guī)定了從深海沉積物、含菌濾膜、大型生物中提取微生物宏基因組DNA的方法。工作程序包10.2.1合格的宏基因組DNA應(yīng)達到的指標為：OD?o/OD的比值應(yīng)在1.8～2.0之間，且OD?so/OD?a?的比值應(yīng)大于2.0。10.2.2用于構(gòu)建Cosmid或者Fosmid文庫的宏基因組DNA大小經(jīng)脈沖電泳檢測后應(yīng)在35kb~45kb之間。10.2.3用于構(gòu)建小片段(小于10kb)基因文庫的宏基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，以λDNA/EcoRI+HindⅢ為分子量標記，所提的DNA大小應(yīng)與標記物中最大的一條帶位置相近。10.2.4用于宏基因組DNA提取的深海樣品，宜采用一80℃或液氮罐保存，不應(yīng)采用常溫保存。10.3.1沉積物樣品可直接用于提取宏基因組DNA,每次提取所用的沉積物量宜為2g～5g(濕重)。10.3.2將含菌濾膜(7.4.3)剪成約1cm×1cm的小片，浸泡于裝有水的50mL小離心管中，充分振蕩制成菌懸液，除去濾膜，菌懸液經(jīng)8000r/min離心10min后除去上清液，加入1mL水將沉淀充分混勻。泡于水中，用毛刷將消化道內(nèi)部的附著物洗至水中，除去組織，將混合液經(jīng)8000r/min離心10min后除去上清液，加入1mL水，將沉淀充分混勻。10.3.4管狀蠕蟲樣品應(yīng)先在超凈工作臺中去除外殼，用水洗凈蟲體，用滅菌后的剪刀剪開蟲體，將蟲體浸泡于水中，用毛刷將蟲體內(nèi)部的附著物洗至水中，除去蟲體，將混合液經(jīng)8000r/min離心10min后除去上清液，加入1mL水，將沉淀物充分混勻。10.4宏基因組DNA提取10.4.1在處理好的樣品(10.3)中加入5mLDNA抽提緩沖液(4.41),混勻，于37℃,225r/min條件下振蕩30min。10.4.2加入1mLTE溶液和0.5mL溶菌酶貯液，繼續(xù)振蕩30min,加入0.5mLSDS溶液，65℃水浴10.4.36000r/min離心10min,將上清液移入新的小離心管。10.4.4往沉淀中加入5mLDNA抽提緩沖液(4.22)和0.5mLSDS溶液，65℃水浴10min,6000r/min離心10min,將上清液與10.4.2中的上清液合并于同一離心管中。10.4.5重復10.4.3步驟，將上清液與10.4.3中的上清液合并于同一離心管中。10.4.6測量合并后的上清液體積，加入RNaseA貯液至RNaseA的終濃度為200μg/mL,37℃水浴15min,等體積加入酚/氯仿/異戊醇，輕輕混勻，13000r/min離心15min,將上層水相移入新的離心管。10.4.7等體積加入異丙醇，于一20℃中沉淀1h,4℃13000r/min離心10min,棄上清液。10.4.8加入200μL無水乙醇，放置3s～5s后棄去無水乙醇，并重復1次，然后將沉淀物放置超凈工作臺內(nèi)吹干后溶解于50μLTE溶液或水中，即為DNA粗提液，于一20℃保存。10.4.9DNA粗提液的大片段DNA(大于等于35kb)應(yīng)采用10g/L低熔點瓊脂糖凝膠(4.13)電泳檢測，用瓊脂糖酶(4.7)進行回收純化。DNA粗提液的小片段DNA(小于35kb)按9.4的要求采用凝膠回收純化。注1:小片段DNA(小于35kb)也可用商用試劑盒進行純化。注2:宏基因組DNA也可采用商用試劑盒進行提取。注3:瓊膠糖酶回收純化的方法可參見瓊膠糖酶商品的說明書。將所提取宏基因組DNA的來源、站位、大小、純度、圖譜等數(shù)據(jù)記錄于深海樣品宏基因組DNA提取記錄表(參見表A.4)。數(shù)據(jù)資料處理記錄應(yīng)按HY/T058的要求歸檔。11深海生物樣品及微生物資源保存11.1.1深海生物樣品、微生物菌株、DNA資源的保存應(yīng)有詳細的記錄，資源的共享應(yīng)有入庫、出庫記錄。11.1.2同一菌株應(yīng)選用兩種或兩種以上方式進行保藏。11.1.3只能采用一種保藏方法的菌株、DNA資源應(yīng)備份并存放于兩個以上的保藏設(shè)備中。11.1.4菌株應(yīng)定期檢查保藏效果，有污染或退化跡象時，應(yīng)及時純化分離、復壯，每次檢查均應(yīng)有詳細記錄。11.1.5微生物菌株和DNA資源的分離、提取、保存和分裝等所有操作均應(yīng)在無菌條件下進行。11.2深海生物樣品保藏11.2.1船上現(xiàn)場分樣并按不同溫度保存的沉積物樣品、水樣品、熱液煙囪樣品，在運輸轉(zhuǎn)移入樣品庫11.2.2深海小型蝦、魚、蟹等樣品應(yīng)首先在無菌水中充分洗凈，取含有微生物的消化道組織進行保存，保存時應(yīng)加入的甘油溶液(4.18),使甘油的終濃度為150mL/L,于一80℃保存。11.2.3樣品出庫時如需進一步分樣操作，應(yīng)在各自保存溫度下進行。11.2.4保存條件應(yīng)包括4℃、-20℃、一80℃和液氮等四種。在樣品量較少的情況下，應(yīng)優(yōu)先保證4℃保存和一80℃保存的樣品。11.3微生物菌種資源保藏本方法適用于大多數(shù)細菌和真菌的短期保存?？瞻仔泵媾囵B(yǎng)基應(yīng)盡快使用，放置時間不應(yīng)超過7d。.2.1選擇所保存菌株的最適生長培養(yǎng)基，先在燒杯中放適量海水，按培養(yǎng)基配方稱取各種材加熱溶解。.2.2配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求用稀酸溶液或稀堿溶液調(diào)節(jié)pH至所需要的規(guī)定值，加酸或堿液時應(yīng)緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導致測量不準確和營養(yǎng)成分被破壞。.2.3將瓊脂加入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至溶解，再補足所蒸發(fā)水分，在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量應(yīng)為玻璃試管高度的1/4(4mL～5mL),穿刺培養(yǎng)基分裝量應(yīng)為玻璃試管高度的1/2,玻璃試管加棉塞后，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，分裝過程中培養(yǎng)基不應(yīng)沾污到管口或棉塞上。將制好的固體培養(yǎng)基經(jīng)滅菌處理，及時擺放斜面，斜面長度不應(yīng)超過玻璃試管管長的1/2,將滅菌的固體培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗，通常為30℃培養(yǎng)1d～3d,無菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。斜面接種分為以下幾種：a)點接：把待保藏菌種點接在斜面培養(yǎng)基中部偏下方處。此方法適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌(如毛霉、根霉等)。b)中央劃線：從斜面培養(yǎng)基中央自下而上劃一直線。此方法適用于細菌和酵母菌等。c)稀波狀蜿蜒劃線法：從斜面培養(yǎng)基底部自下而上劃之字形線。此方法適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。d)密波狀蜿蜒劃線法：從斜面培養(yǎng)基底部自下而上劃密之字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，此方法適用于細菌和酵母菌等。e)挖塊接種法：挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上。此方法適用擔子菌類真菌。用接種針從待保藏菌種挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底(勿穿到管底),然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。此方法適用于細菌和酵母菌等。挑取少量待保藏菌種或用無菌滴管吸取液體待保藏菌種(接種量與接種體積比不超過100mL/L)接種于空白液體培養(yǎng)基中。接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在各菌株的最適生長溫度下培養(yǎng)至細胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。培養(yǎng)好的菌種于4℃保存，相對濕度應(yīng)為50%～70%。視菌株在培養(yǎng)基上的生長狀況每兩個月移植1次，菌種應(yīng)保藏相繼三代的培養(yǎng)物以便對照，防止因意外和污染所造成的損失。本方法適用于不能分解液體石蠟的酵母菌、某些細菌(如芽孢桿菌屬、醋酸桿菌屬等)和某些絲狀真.1選用液體石蠟(4.8),將其分裝到玻璃試管中，加塞，并用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進行滅菌：a)滅菌處理，置40℃恒溫箱中干燥2h;b)160℃干熱滅菌2h。.2將滅菌的液體石蠟冷卻至室溫，隨機選取三管液體石蠟，無菌條件下用無菌吸管吸取少量液體石蠟滴入空白麥芽汁平板上，涂布后于30℃條件下培養(yǎng)1d～3d,檢查無菌落長出后方可使用，如有雜菌長出則需重新滅菌。在無菌條件下將液體石蠟注入按和處理的斜面菌種上，液面高出斜面頂部1cm注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫(4℃)干燥處保藏，保藏時間2年～10年。保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時補充滅菌的液體石蠟。如發(fā)現(xiàn)異常應(yīng)選新的斜面菌種按和的規(guī)定處理后恢復培養(yǎng)時，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的空白培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接1次。本方法適用于產(chǎn)孢類放線菌、芽孢桿菌、梭菌、曲霉屬、青霉屬及少數(shù)酵母如隱球酵母和紅酵母等。石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用1mol/L鹽酸浸泡，如河沙中有機物較多應(yīng)用2mol/L鹽酸浸泡24h后倒去鹽酸，用水洗泡數(shù)次至中性，將沙子烘干或曬干。.3將處理后的沙、土按質(zhì)量比2:1混合，混勻的沙土分裝入安瓿管(5.15)或玻璃試管中，高度1cm,塞好棉塞，經(jīng)高壓滅菌鍋中121℃濕熱滅菌30min,隨機選取三支滅菌好的沙土管，無菌條件下取少許沙土至LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h,檢查無微生物生長后方可使用。按和的要求培養(yǎng)待保藏菌種，如培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基則注入3mL～5mL水，洗下細胞或孢子制成菌懸液。如培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，離心后棄去部分上清液，將菌體沉淀懸浮制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2mL～0.5mL,用真空泵連續(xù)抽氣3h～4h,加速干燥，用手輕拍可使沙土均勻散開則為完全干燥，放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。將沙土管用火焰熔封后存放于低溫(4℃)干燥處保藏，每隔半年檢查1次菌種存活性及純度，或?qū)⑸惩凉苤苯佑门Ｆぜ埢蛩芰霞埌茫酶稍锲鲀?nèi)保存，保藏時間2年～10年。在無菌條件下打開保藏的沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出菌落后再轉(zhuǎn)接1次，或取沙土粒于適宜的液體培養(yǎng)基中，按.3和的規(guī)定增殖培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基。冷凍干燥法保藏適用于大多數(shù)細菌、放線菌、病毒、噬菌體、部分絲狀真菌和酵母菌等。.1保護劑的種類、搭配、濃度及pH值應(yīng)根據(jù)所保藏的菌種進行選擇與配制。.2厭氧微生物冷凍干燥所用的保護劑在使用前應(yīng)在100℃的沸水中煮沸15min左右，脫氣后放入0℃的冰水混合物中急冷。常用保護劑類型及種類包括以下幾種：.2.1直接采用牛奶作為保護劑時，按0.2g/L的濃度加入碳酸鈣溶液煮沸20min～30min,冷卻至室溫，3500r/min離心10min,去除上層油脂。分裝后用常壓或高壓法滅菌，常壓法在100℃間歇煮沸2次～3次，每次10min～30min。高壓法為用高壓滅菌鍋于116℃滅菌20min,取出后置于37℃保溫箱中培養(yǎng)24h做無菌檢驗，檢驗無菌后于4℃保存。.2.2將脫脂奶粉按0.2g/mL的比例加水溶解，然后用高壓滅菌鍋于116℃滅菌15min~20min,滅菌后于37℃培養(yǎng)24h,檢查是否滅菌徹底，檢驗無菌后于4℃保存。將30g葡萄糖溶于400mL牛血清中，用0.22μm的濾膜過濾滅菌，備用。.1冷凍干燥宜選用安瓿管，清洗安瓿管時，先用0.65mol/L的鹽酸浸泡過夜，然后用自來水.2在所保藏菌株的最適培養(yǎng)條件下，用液體培養(yǎng)基將細胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，6000r/min離心10min,收集菌體，棄去上清液，加入保護劑(每毫升培養(yǎng)物加1mL～2mL),將培養(yǎng)物與保護劑混勻，采用滴管直接將菌液滴入安瓿管或凍存管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量0.1mL~0.2mL。若是球形安瓿管，裝量為半個球部；.3分裝后用脫脂棉堵住安瓿管管口，分裝時間盡量要短，最好在1h～2h內(nèi)分裝完畢；對安瓿管進行預(yù)凍2h以上，溫度達到一40℃左右，將預(yù)凍后的樣品安瓿管迅速置于已充分預(yù)冷的冷凍干燥機樣品艙內(nèi)，按冷凍干燥機的操作說明完成冷凍干燥操作；.4確認冷凍干燥完畢后，緩慢打開放氣閥，取出樣品安瓿管，置于干燥器內(nèi)備用，冷凍干燥時間一般為8h～20h,冷凍干燥判斷已完全的指標如下：a)安瓿管內(nèi)凍干物呈酥松塊狀或松散片狀；b)真空度接近空載時的最高值；c)冷凍干燥機顯示的樣品溫度與艙內(nèi)溫度接近；d)蒸餾水對照管中的水分已完全揮發(fā)掉；e)從干燥器中取出冷凍干燥完全的安瓿管，在距管口5cm左右用噴射火焰(噴燈、焊槍等)將安瓿管拉細，然后將安瓿管口連接到與真空安瓿管泵相連的橡皮管上，打開真空泵，在真空條件下(一般真空度達到2.7Pa),用噴射火焰對準安瓿管細頸部加熱熔封，熔封后的干燥管應(yīng)采用高頻電火花真空測定儀檢測真空度。封口完全的冷凍干燥管應(yīng)在4℃中避光保藏，保藏周期可超過10年。每種菌株保存10管平行樣，每兩年隨即抽取一支按和的要求接種培養(yǎng)后，進行先用乙醇溶液擦拭安瓿管的上部，將安瓿管頂部燒熱，用無菌棉簽沾水，在頂部擦一圈，使頂部出現(xiàn)裂紋，用銼刀或鑷子頸部輕敲下已開裂的安瓿管的頂端，用水溶解菌塊，轉(zhuǎn)移入新配制的液體培養(yǎng)基中，按照所復蘇菌株的最適生長條件進行培養(yǎng)。低溫冷凍保藏方法適用于各類微生物。.1選用安瓿管或螺旋口的塑料凍存管(5.16)。清洗安瓿管時，先用0.65mol/L鹽酸溶液浸泡過夜，然后用自來水沖洗3次以上，最后用水沖洗、浸泡至pH中性，然后干燥。塑料凍存管用水浸泡，.2在所保藏菌株的最適培養(yǎng)條件下，用液體培養(yǎng)基將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，與保護劑混勻，無菌滴管吸取后滴入安瓿管或凍存管底部，不應(yīng)濺污上部管壁，每管分裝量0.1mL～0.2mL,若是球形安瓿管，裝量為半個球部；若為塑料凍存管，裝量不應(yīng)超過總體積的2/3;.3用脫脂棉堵住分裝后的安瓿管管口，應(yīng)在1h～2h內(nèi)分裝完畢，預(yù)凍分裝后的安瓿管或塑料凍存管，冷凍速度應(yīng)控制在1℃/min;溫度達到一40℃后，將預(yù)凍的樣品安瓿管或塑料凍存管迅速置液氮中保藏周期可為10年以上，-80℃保藏周期一般為1～2年。從一80℃保存或液氮中取出安瓿管或塑料凍存管，迅速放置在38℃~40℃溫水中快速復蘇并適當搖動90s,取出于室溫中至完全溶解，在無菌條件下開啟安瓿管或塑料凍存管，將管內(nèi)保藏物接種至所復蘇菌株的最適培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。11.4宏基因組文庫資源保藏所提取的深海樣品宏基因組DNA分裝成每管20μL～50μL,于一80℃保藏，不應(yīng)反復凍融。保藏期限不應(yīng)超過1年。11.4.2小片段宏基因組DNA文庫構(gòu)建及保藏小于35kb的宏基因組DNA適用于構(gòu)建小片段(5kb～10kb)宏基因組DNA文庫，所用的載體可為表達載體，例如pET-GST,pET-His,pTrc-CKS,pLLP-OmpA,pLLP-STI,pMBP-P,pQE等。冰浴中。.2在A管溶液中，加5μL10倍Sau3AI酶(4.5)反應(yīng)緩沖液，混勻。取5個小管，編號1～5,1號管取溶液9μL,加1μL上樣緩沖液，混勻，作為酶切時間為零的對照實液中，加2個單位Sau3AI酶，溫和混勻，置37℃水浴，分別于5min、10min、15min、20min取出溶液9μL,加1μL上樣緩沖液，混勻，置4℃水浴，待樣品取完后，用10g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，所用分子量標準為λDNA/EcoRI+HindⅢ,根據(jù)分子量標準的大小分析結(jié)果，觀察5kb～10kb范圍內(nèi)片段產(chǎn)量最多的管號，得到最適的酶切時間，一般最適的酶切時間宜為15min,應(yīng)根據(jù)酶切預(yù)實驗的時.3根據(jù)預(yù)酶切實驗結(jié)果，確定合適的酶量、酶切時間，然后將B管溶液進行酶解反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后立即加入等體積異丙醇，并加入MgCl?溶液至終濃度為10mmol/L,混勻，于一20℃中放置30min,13000r/min離心10min,DNA沉淀物用乙醇溶液洗3次，吸干乙醇，置超凈工作臺吹5min,加10μL～15μL水溶解。.4用Klenow酶(見4.6)酶切后的DNA進行半補齊反應(yīng)，在小離心管中加入50ngDNA沉水補足體積至50μL,在37℃反應(yīng)3h。.5半補齊產(chǎn)物用低熔點瓊脂糖電泳檢測，用瓊脂糖酶回收5kb～10kb的DNA片段。注：上樣緩沖液、反應(yīng)緩沖液均為購買商品酶時的配套溶液。將載體的DNA用限制性核酸內(nèi)切酶完全酶切，所用酶應(yīng)視所用載體的多克隆位點序列進行選擇，應(yīng)選擇酶切后能產(chǎn)生-TC堿基末端的酶，例如BamHI(4.3)或SalI(4.4)。如所用載體中無該類酶切位點，應(yīng)選取半補齊后能產(chǎn)生-TC堿基末端的酶。從新鮮的瓊脂板上挑取一個大腸桿菌單菌落，接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃,250r/min振蕩培養(yǎng)12h。.2將兩份25mL的上述培養(yǎng)物分別接種到盛有500mL經(jīng)37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃,250r/min振蕩培養(yǎng)，每隔20min測量一次600nm處的OD值，當OD值達到0.4時，迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中15min～30min,不時緩慢搖勻直至完全冷卻。.3將細菌轉(zhuǎn)移至已在冰上預(yù)冷的離心管中，4℃下1000r/min離心15min,棄上清液，用500mL4℃的水重懸沉淀。.44℃下1000r/min離心20min,棄上清液，用30mL4℃的甘油溶液重懸沉淀，4℃下1000r/min離心20min,棄上清液，用1mL4℃的甘油溶液重懸沉淀，4℃下1000r/min離心20min,緩慢倒掉上清液，吸去管壁上的殘留液體，加1mL4℃的GYT培養(yǎng)基(4.25)重懸沉淀。.5用4℃的GYT培養(yǎng)基稀釋至600nm處OD值為0.8～1。上述懸液轉(zhuǎn)移到4℃的電轉(zhuǎn)化儀(5.17)的電擊杯中(0.2cm間隙),檢查電擊時是否有短路現(xiàn)象，如果有，則剩下的細胞懸液用4℃的GYT培養(yǎng)基洗一次，使細菌懸液的電導小于5mEq再進行分裝。.7感受態(tài)細胞懸液按40μL/管的體積分裝，保藏于一80℃中備用。需要用時，從一80℃保存中取出，室溫下完全融解后將管轉(zhuǎn)移至冰上備用。.1在離心管中加入制備好的DNA、載體、連接酶、緩沖液，混勻后在16℃下連接過夜，DNA和載體的摩爾比為(3:1)～(10:1)。.2將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化條件應(yīng)按照所用電轉(zhuǎn)化儀的操作說明書設(shè)定，脈沖電擊結(jié)束后，盡可能快地取出樣品池，室溫下加入1mLSOC培養(yǎng)基(4.26),將細胞在37℃,100r/min振蕩培養(yǎng)1h。液(4.43)的含Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上，放置于室溫下，待培養(yǎng)基平板中的液體被完全吸收后，倒置培養(yǎng)基平板于37℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化克隆應(yīng)在12h～16h內(nèi)出現(xiàn)。按式(1)進行文庫質(zhì)量評估，插入的外源片段大小按7.5kb計算，基因組片段大小按25kb計算，P值需達到90%以上方為合格：N=ln(1-P)/ln(1-F)…(1)P——任意段DNA順序在文庫中出現(xiàn)的幾率；F——插入片段的長度與基因組片段長度的比值；N——重組克隆總數(shù)。將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液進行涂布，每50μL培養(yǎng)液用水稀釋成200μL后涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上，放置于室溫下，待培養(yǎng)基平板中的液體被完全吸收后，倒置培養(yǎng)基平板于37℃培養(yǎng)12h~16h,將各平板上長出的菌落用含Amp的LB液體培養(yǎng)基洗下，按500μL一管分裝于小離心管，每管中加入115μL甘油溶液，混勻后于一80℃保存。11.4.3大片段宏基因組DNA文庫(大于或等于35kb)構(gòu)建及保藏大于或等于35kb的宏基因組DNA可用于構(gòu)建大片段宏基因組文庫。.1采用直徑10μm的微量注射器對深海微生物宏基因組DNA進行吸打，通過調(diào)整吸打次數(shù)來獲得最佳大小范圍的DNA片段，預(yù)實驗的結(jié)果需通過PFGE進行DNA大小的驗證。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果用微量注射器對深海樣品宏基因組DNA進行吸打，并與花青素核酸染料混勻。.2配制低熔點瓊脂糖凝膠，設(shè)定脈沖場電泳儀系統(tǒng)(5.18)的相應(yīng)運行程序：電壓450V,脈沖時間0.8s,電流110mA～120mA,時間3h～4h。啟動脈沖場電泳儀配套的電泳系統(tǒng)中的水浴循環(huán)儀，使水冷卻至8.5℃,倒入已預(yù)冷至8.5℃的TBE電泳緩沖液(4.44),保持電泳槽四壁通電處干燥。.4在凝膠加樣孔中加入已與花青素核酸染料混合的DNA樣品，在相鄰加樣孔中加入試劑盒配套的分子量標準，將凝膠放入電泳槽內(nèi)，啟動水浴循環(huán)功能，打開高壓電源和脈沖電場電源，運行預(yù)先設(shè)定好的程序，運行結(jié)束后，退出程序，關(guān)閉脈沖場電泳儀系統(tǒng)。.5將低熔點瓊脂糖凝膠從托盤上割下放置于保鮮膜上，并在可觀察花青素核酸染料的凝膠觀察儀上進行觀察，將30kb～45kb之間的目的DNA膠條切割下來。.6將含有目的DNA片段的膠條用TE溶液洗滌3次，移除上清液，用瓊脂糖酶進行回收，將所得的DNA溶解于50μL水中，用分光光度計測定DNA的濃度及純度。.7用末端補平酶對所獲得的DNA片段進行末端補平，在25℃下反應(yīng)45min,將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至70℃水浴10min。沉淀物，用分光光度計測定DNA濃度。參照附錄D,將制備好的DNA與載體連接、包裝、文庫評估和保藏。注：所用載體可為Cosmid,Fosmid等。各載體均有成熟的試劑盒，可按照試劑盒說明書操作，附錄C給出了用Epicentre公司的pWEB::TNCTMCosmidCloningKit構(gòu)建宏基因組文庫的步驟，給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。11.5資料處理11.5.1數(shù)據(jù)資料處理記錄應(yīng)按HY/T058要求歸檔。11.5.2將所保藏的深海樣品類型、來源、數(shù)量、出入庫等信息整理記錄于深海樣品保藏記錄表(參見表A.5)。11.5.3將所保存的深海細菌菌種、來源、保存方式等信息進行整理，將信息記錄于深海細菌保藏記錄表(參見表A.6)。11.5.4將所保存的深海放線菌菌種、來源、保存方式等信息進行整理，將信息記錄于深海放線菌保藏記錄表(參見表A.7)。11.5.5將所保存的深海真菌菌種、來源、保存方式等信息進行整理，將信息記錄于深海真菌保藏記錄表(參見表A.8)。11.5.6將所構(gòu)建的宏基因組文庫大小、所用載體、宿主菌、效率等信息整理記錄于深海樣品宏基因組DNA文庫記錄表(參見表A.9)。(資料性附錄)深海微生物樣品前處理記錄表格式站位采樣方式采樣時間采樣器型號規(guī)格緯度經(jīng)度沉積環(huán)境類型水深/m溫度/℃鹽度分樣方式樣品體積(水樣)樣品重量(沉積物樣)保存方式備注采樣人記錄人校對人表A.2深海微生物分離鑒定記錄表菌株編號菌株來源培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)壓力GB/T30744—2014菌株種屬16SrRNA基因序列編號分離日期分離人鑒定日期鑒定人校對人表A.3深海微生物基因組DNA提取記錄表菌株編號菌株種屬站位OD?6a/280電泳圖譜提取日期備注提取人校對人樣品類型站位電泳圖譜DNA片段大小提取日期備注提取人校對人樣品類型站位數(shù)量保存位置采集日期入庫日期出庫記錄1日期數(shù)量取用人經(jīng)手人樣品用途樣品使用成果2日期數(shù)量取用人經(jīng)手人樣品用途樣品使用成果菌株保藏編號采集地學名分離基物中文名稱培養(yǎng)基收藏時間培養(yǎng)溫度、pH等條件保存方式生物危害程度分離人16SrRNA基因序列號鑒定人功能特性特征特性信息表型信息個體形態(tài)特征形狀、大小培養(yǎng)特征菌落形態(tài)芽孢，莢膜菌落質(zhì)地運動性菌落顏色鞭毛菌落大小革蘭氏染色反應(yīng)其他培養(yǎng)特征其他形態(tài)特征其他信息菌落形態(tài)圖細胞形態(tài)圖表A.7深海放線菌保藏記錄表菌株保藏編號采集地學名分離基物中文名稱培養(yǎng)基收藏時間培養(yǎng)溫度、pH等條件保存方式生物危害程度分離人16SrRNA基因序列號鑒定人功能特性特征特性信息表型信息個體形態(tài)特征菌落形態(tài)基內(nèi)菌絲大小有無橫隔、是否斷裂表面狀況直徑大小顏色孢囊形狀氣生菌絲基絲顏色有無氣生菌絲可溶性色素直徑大小其他顏色孢子孢子著生方式孢子形狀孢子絲孢子表面特征形態(tài)孢囊顏色孢囊特征其他特征形態(tài)描述所用培養(yǎng)基特征特性信息表型信息培養(yǎng)特征所用的培養(yǎng)基在培養(yǎng)基上生長狀況與顏色氣絲基絲可溶性色素其他培養(yǎng)特征其他信息菌落形態(tài)圖細胞形態(tài)圖菌絲形態(tài)圖基本信息菌株保藏編號采集地學名分離基物中文名稱培養(yǎng)基收藏時間培養(yǎng)溫度、pH等條件保存方式生物危害程度分離人16SrRNA基因序列號鑒定人功能特性特征特性信息菌落形態(tài)菌絲形態(tài)產(chǎn)孢特征培養(yǎng)溫度最高℃;最適℃;最低℃最高最適最低生長速度生理生化特征特殊遺傳標記其他信息菌落形態(tài)圖細胞形態(tài)圖菌絲形態(tài)圖GB/T30744—2014編號所用載體插入片段大小文庫滴度總克隆數(shù)保存的單克隆數(shù)構(gòu)建日期構(gòu)建人校對人(資料性附錄)耐壓菌株分離B.1.2用巴斯德吸管吸取懸浮液，裝樣管和進樣管中均不能含有氣泡。B.1.3在離裝樣管1cm～2cm處的進樣管上用封口機加熱封口數(shù)次使得管道自然分離。B.1.4將封口后的巴斯德吸管放入壓力罐中，加入水至限壓孔，若試驗的溫度低于或者是高于室溫，則應(yīng)先往壓力罐中加入水并將整個系統(tǒng)的溫度調(diào)至所需溫度方可進行下一步操作。B.1.5將O形圈緩慢撥到進壓器的指定位置，然后將裝好O形圈的進壓器垂直壓入壓力罐中，在壓入的過程中不可轉(zhuǎn)動進壓器。B.1.6緩慢調(diào)整進壓器使得進壓器兩側(cè)的孔與高壓罐上的限壓孔相一致，插入限壓棒。B.1.7往進樣容器中加入水，水位至少需超過進樣口5cm。B.1.8連接好進壓管道，打開開關(guān)保持管道通路，打開耐震壓力表開關(guān)，其他未使用的管道和放壓管道應(yīng)處于關(guān)閉狀態(tài)。B.1.9通過升壓裝置使壓力升至所需壓力，關(guān)閉進壓器開關(guān)，打開放壓開關(guān)，至壓力值將為0后松開進壓管道，將壓力罐放入所需的溫度中培養(yǎng)至試驗結(jié)束。吸管垂直放置，直至沉積物中的固體自然沉降。B.1.11用滅菌的剪刀緩慢剪開管道，緩慢擠壓巴氏德管，將混合樣緩慢擠壓到所需要的培養(yǎng)基平板上進行涂布。至獲得單克隆純培養(yǎng)物。B.2菌株耐壓特征的驗證B.2.1基本操作B.2.1.1吸取培養(yǎng)12h的純培養(yǎng)物以體積分數(shù)0.1%的比例接種至新鮮培養(yǎng)液中，接種后培養(yǎng)液的OD??值應(yīng)小于0.005。B.2.1.2根據(jù)實驗需要設(shè)定不同的壓力，利用巴斯德吸管進行各壓力條件下的培養(yǎng)，培養(yǎng)步驟見B.1。B.2.1.3培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)液，觀察培養(yǎng)液是否呈明顯渾濁，測定培養(yǎng)液的ODsoo值，在顯微鏡下鏡檢菌株是否存活并觀察菌體特征。B.2.1.4根據(jù)培養(yǎng)液的ODo值、顯微鏡鏡檢結(jié)果確定菌株的最大耐受壓力和最適耐受壓力。B.2.2特征驗證菌株耐壓特征的驗證應(yīng)同時設(shè)定一組常壓下的對照，如果常壓下生長，而高壓下未生長，可認為該菌株耐壓陰性。如果在常壓和高壓下均未生長，則應(yīng)重新調(diào)整壓力進行驗證。(資料性附錄)微生物菌種分子鑒定C.1微生物16SrRNA基因和18SrRNA基因序列PCR擴增通用引物C.1.1用于微生物16SrRNA基因序列擴增的通用引物序列C.1.1.1正向通用引物正向通用引物如下：a)fD1:5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3';b)fD2:5'AGAGTTTGATCATGGCTCAG3';c)fD3:5'AGAGTTTGATCCTGGCTTAG3';d)fD4:5'AGAATTTGATCTTGGTTCAG3'。反向通用引物如下：a)rD1:5'AAGGAGGTGATCCAGCC3';b)rP1:5'ACGGTTACCTTGTTACGACTTc)rP2:5'ACGGCTACCTTGTTACGACTTd)rP3:5'ACGGATACCTTGTTACGACTTC.1.1.3各通用引物適用范圍各通用引物對均有適用范圍，如用一對引物無法擴增出產(chǎn)物，應(yīng)選用其他的引物對。各引物所適用的微生物種類見表C.1。表C.116SrRNA基因通用引物的適用范圍引物"革蘭氏陽性菌及相關(guān)菌，包括：芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌(Clostridium)、葡萄球菌(Staphylococcus)、利斯特氏小菌(Listeria)、乳桿菌(Lactobacillus)、鏈球菌(Streptococcus)枝原體(Myc