基因工程知識(shí)要點(diǎn)

第一章1.基因工程:是在分子水平上進(jìn)行的遺傳操作，指將一種或多種生物體（供體）的基因或基因組提取出來(lái)，或者人工合成的基因，按照人們的愿望進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體（受體）的細(xì)胞內(nèi)，使之能在受體細(xì)胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術(shù)。2.基因工程的基本過(guò)程為哪些？切—接—轉(zhuǎn)—增—檢①獲得目的基因：從供體細(xì)胞分離出基因組DNA，用內(nèi)切酶將外源DNA切開(kāi)?！校ㄍ瑫r(shí)選擇運(yùn)載目的基因的載體）②目的基因與載體DNA拼接：用DNA連接酶將具有外源基因的DNA片段接到載體分子上，形成DNA重組分子?！英壑亟M體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞：借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中?！D(zhuǎn)④短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中?！觫莺Y選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞?！獧z3.哪些基因是真核生物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相應(yīng)的正常功能基因基本相同，但卻不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因。②基因家族：由功能相關(guān)的基因成套組合形成③反復(fù)序列哪些是原核生物特有的：插入序列。哪些是真核和原核共有的：移動(dòng)基因、重疊基因第二章1.寄主細(xì)胞控制的限制與修飾宿主控制限制——核酸限制性?xún)?nèi)切酶宿主控制修飾——修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶以λ(k)噬菌體侵染E.coliB菌株為例解釋寄主控制與修飾的現(xiàn)象。（簡(jiǎn)述寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。大多數(shù)細(xì)菌的噬菌體侵染都存在著一些功能性障礙。所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱(chēng)（R/M體系）。R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完畢的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶——修飾另一種是核酸內(nèi)切限制酶——限制R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解；2.簡(jiǎn)述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸內(nèi)切酶的基本特性。（1）Ⅰ型酶基本特性①有內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg2+輔助因子；③EcoB和EcoK是由三種不同亞基組成。γ多肽鏈：特異性亞基，辨認(rèn)DNA序列的活性。β多肽鏈：修飾亞基，具有甲基化酶活性。α多肽鏈：限制亞基：具有核酸內(nèi)切酶活性④有特定的辨認(rèn)位點(diǎn)⑤切割方式：結(jié)合在辨認(rèn)位點(diǎn)，以滾環(huán)形式沿著DNA分子轉(zhuǎn)位，從距辨認(rèn)位點(diǎn)5’一側(cè)幾千bp處隨機(jī)切割分子，無(wú)特異性。Ⅱ型酶：①有內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性——分開(kāi)反映②能辨認(rèn)專(zhuān)一的核苷酸序列，并在固定位置上切割③辨認(rèn)序列的核苷酸對(duì)順序呈回文結(jié)構(gòu)（那項(xiàng)具有回文結(jié)構(gòu)：辨認(rèn)位點(diǎn)的DNA序列呈雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)）④切割可形成兩種核苷酸切割末端————粘性末端和平末端。粘性末端定義：指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，能通過(guò)互補(bǔ)堿基間配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。（3）Ⅲ型酶：①由兩個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，即同時(shí)具有內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性②需Mg2+、ATP、SAM輔助因子③可辨認(rèn)特定堿基順序，并在這一順序的3’端24～26bp處切開(kāi)ＤＮＡ，所以它的切割位點(diǎn)也是沒(méi)有特異性的4.同尾酶：指來(lái)源不同、辨認(rèn)靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。運(yùn)用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。同裂酶：指來(lái)源不同但辨認(rèn)相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。星號(hào)活性：同一限制酶當(dāng)某些反映條件變化時(shí)酶的專(zhuān)一性發(fā)生改變，即酶切位點(diǎn)專(zhuān)一性改變的活性。包裝上標(biāo)“＊”注明。5.DNA缺口平移、取代反映的概念DNA缺口平移：在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。（概念：當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但PolⅠ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個(gè)鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)。）②用途：通過(guò)DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。取代反映：假如在反映混合物中僅存在一種dNTP，則此酶的3’→5’的外切酶活性將從dsDNA的3’端降解，直到互補(bǔ)于該dNTP的堿基出現(xiàn)為止，然后在該位置發(fā)生合成和取代反映。6.各DNA聚合酶的基本特性及其區(qū)別；（1）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）的酶活性①5’→3’的聚合酶活性：需Mg2+②5’→3’的外切酶活性：可以從游離的5’-OH末端水解DNA分子(修復(fù)作用)③3’→5’的外切酶活性（較低）：從DNA鏈的3’-OH末端向5’水解DNA(校對(duì)作用)用途：重要功能參與DNA的合成，起到修復(fù)作用；PolⅠ同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。（2）PolⅠ的Klenow片斷①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性③無(wú)5’→3’外切酶活性。Klenow片斷的重要用途：①修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；②標(biāo)記DNA片斷的末端；③cDNA克隆中的第二條鏈c DNA的合成；④DNA序列的測(cè)定。（3）PolⅡ（參與DNA修復(fù)過(guò)程）酶活性：①5’→3’的聚合酶活性：規(guī)定模板是雙鏈DNA，中間有空隙的單鏈DNA部分，且空隙部分不長(zhǎng)于100bp；②具有3’→5’的外切酶活性，無(wú)5’→3’外切酶活性；③重要在DNA的損傷修復(fù)中有一定的作用（4）PolⅢ①聚合作用：是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所必需的；②3’→5’的外切酶活性，底物是單鏈DNA；③5’→3’外切酶活性，底物是單鏈DNA。（5）T4DNA聚合酶①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性；③無(wú)5’→3’外切酶活性；④取代反映:在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止；（6）T7DNA聚合酶①5’→3’的聚合酶活性；②3’→5’的外切酶活性（是klenow片段的1000倍）；③無(wú)5’→3’外切酶活性；（7）耐熱DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）（選擇題）①具耐高溫的特性，最適活性溫度為72℃，連續(xù)保溫30min仍有活性，一次加酶即可滿(mǎn)足PCR反映全過(guò)程的需求；②Mg2+依賴(lài)酶；③具有聚合酶活性；④具有5’→3’外切酶活性，無(wú)3’→5’外切酶活性⑤SDS完全克制其酶活性。（8）反轉(zhuǎn)錄酶依賴(lài)RNA的DNA的聚合酶。α多肽鏈——具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和RNaseH活性；β多肽鏈——具有以RNA-DNA雜交分子為底物的5’→3’脫氧核酸外切酶活性。以mRNA為模板合成cDNA；在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條cDNA。7.連接酶所需的條件——供能分子、磷酸基團(tuán)和羥基。概念：可以催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶。即可以將DNA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在供能分子的作用下，形成磷酸二酯鍵。需要三種成分參與：3’-OH，5’-P，提供能量的分子供能分子：NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核酸）——在E.coli等細(xì)菌中選用ATP（腺苷三磷酸）——?jiǎng)游锛?xì)胞、噬菌體中選用注：①只能連接缺口（nick）；②不能連接裂口（gap）；③并且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。8.缺口：在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。裂口：在雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的單鏈斷裂。9、堿性磷酸酶：將DNA末端的5’端磷酸基除去，使其5’端變成3羥基，能防止自身環(huán)化。作用：（1）去除DNA和RNA的5”--磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用[γ—32P]ATP進(jìn)行末端標(biāo)記，繼而進(jìn)行序列分析。（2）去除載體DNA5”--磷酸基，防止自身環(huán)化，減少本底，提高重組DNA檢出率。發(fā)夾結(jié)構(gòu)：10、末端轉(zhuǎn)移酶特性：①催花dNTP添加到3’-OH端，且不需模板；②需Co2+。用途：①給載體或cDNA加上互補(bǔ)的同聚尾；②標(biāo)記3’末端。第三章1、基因載體：離開(kāi)染色體的外源DNA不能復(fù)制，而插入的外源DNA可作為復(fù)制子的一部分在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，這種復(fù)制子就是外源基因的載體。2、報(bào)告基因：有特殊意義的基因，重組子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，可依據(jù)報(bào)告基因從其他細(xì)胞中辨認(rèn)區(qū)分甚至挑選出來(lái)。2、載體應(yīng)具有的特性：①能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制，插入外源基因后，仍保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)；②易于從宿主細(xì)胞中分離，并行純化；③載體DNA序列中有單一的酶切位點(diǎn)，并位于DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)；④具有可以觀測(cè)的表型特性，如報(bào)告基因（遺傳標(biāo)記），插入外源DNA后，這些特性可以作為重組DNA選擇標(biāo)志。3、載體的致死效應(yīng)：運(yùn)用載體進(jìn)行克隆時(shí)，有時(shí)也許對(duì)大量的克隆化基因和克隆化基因產(chǎn)物也許有害，宿主細(xì)胞呈現(xiàn)致死效應(yīng)。如大量表達(dá)目的蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。3、R1質(zhì)粒和ColE1-K30質(zhì)粒

R1質(zhì)粒ColE1-K30E.Coli中嚴(yán)緊型松弛型奇異變形桿菌中松弛型嚴(yán)緊型4、質(zhì)粒構(gòu)型：常見(jiàn)的構(gòu)型:SC>L>OCA.共價(jià)閉合環(huán)形DNA(cccDNA):呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型B.開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA):即OC型。C.線性DNA(lDNA):即L型。根據(jù)寄主細(xì)胞所含的拷貝數(shù)多少質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型和松弛型。5、質(zhì)粒的種類(lèi)F質(zhì)粒：又叫F因子、性質(zhì)?；蛑掠|(zhì)粒。是最具代表性的單拷貝的接合型質(zhì)粒，共編碼著19個(gè)轉(zhuǎn)移基因。R質(zhì)粒：又稱(chēng)抗藥性因子，它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因。Col質(zhì)粒：產(chǎn)生大腸桿菌素因子，編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。屬非結(jié)合質(zhì)粒。6、ColE1質(zhì)粒的遷移作用：由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移的過(guò)程。其中參與遷移的有兩種基因：bom基因：位于ColE1DNA上的特異位點(diǎn)mob基因：ColE1質(zhì)粒特有的，其編碼的核酸酶作用于bom位點(diǎn)7、細(xì)菌質(zhì)粒的不相容性在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)具有兩種不同的質(zhì)粒。也稱(chēng)為質(zhì)粒的不親和性。是指在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不可以在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。8、質(zhì)粒的報(bào)告基因應(yīng)用類(lèi)型：插入失活效應(yīng)；α—互補(bǔ)簡(jiǎn)述如何應(yīng)用插入失活和α-互補(bǔ)（藍(lán)白篩選）來(lái)篩選重組子pBR322質(zhì)粒載體有:抗氨芐青霉素基因(ampr);抗四環(huán)素基因(tetr)②α—互補(bǔ)：LacZ（半乳糖苷酶基因）有兩個(gè)重要的亞基，α亞基和ω亞基，α與ω相結(jié)合就能表現(xiàn)出半乳糖苷酶活性，能將無(wú)色底物X-Gal變成藍(lán)色。ω片段基因——coli基因組α-肽基因——質(zhì)粒將具有α-肽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到coli上（α-互補(bǔ)），形成藍(lán)色菌落；插入外源基因，使α-肽編碼區(qū)被破壞，LacZ失活則形成白色菌落。運(yùn)用α-互補(bǔ)（藍(lán)白斑篩選）進(jìn)行重組子的篩選。9、如何對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行人工改造，使其成為載體。（1）減小分子量：可容納外源DNA更長(zhǎng)；（2）改造內(nèi)切酶位點(diǎn)，具有若干限制酶切單一位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)（人工合成且密集排列）；（3）插入外源基因后，較易導(dǎo)入宿主菌內(nèi)復(fù)制和表達(dá)，且不會(huì)因接觸而轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌；（4）具有一個(gè)或幾個(gè)報(bào)告基因?？寺≥d體：復(fù)始起始點(diǎn)、遺傳標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)10、pBR322和pUC質(zhì)粒的各組成部分的來(lái)源分別是什么？（1）pBR322重要組成部分的來(lái)源親本：pMB1和pSF2124;②ampr基因來(lái)源于pSF2124；③tetr基因來(lái)源于Psc101;④復(fù)制起點(diǎn)（ori）ColE111、穿梭質(zhì)粒：是指一類(lèi)由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。專(zhuān)題——核酸分子的提取及核酸凝膠電泳2、簡(jiǎn)述提取質(zhì)粒DNA的原理及環(huán)節(jié)。堿變性法原理：運(yùn)用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)成分離的目的。環(huán)節(jié)：①材料的準(zhǔn)備②破碎細(xì)胞或包膜，使內(nèi)容物釋放③核酸分離、純化④沉淀或吸附核酸，去除雜質(zhì)⑤核酸溶解在適量緩沖液或水中3、如何防止RNase污染？①塑料器皿用0.1%DEPC水溶液浸泡12h以上，高溫滅菌后，180℃烘干6h以上。②在超凈工作臺(tái)上操作。③操作時(shí)帶一次性手套和口罩。④提取緩沖液中加入RNase克制劑。1、溫和噬菌體：既可引起宿主細(xì)胞的裂解死亡，又可將其核算整合到細(xì)菌染色體上，使細(xì)菌細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，并被溶溶原化的噬菌體。烈性噬菌體：將噬菌體感染的記住細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠”，能產(chǎn)生出大量子代噬菌體。溶原化：用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過(guò)程。噬箘粒：由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列，稱(chēng)為噬菌粒載體。柯斯質(zhì)粒：一類(lèi)由人工構(gòu)建的具有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類(lèi)型的質(zhì)粒載體。載體，也稱(chēng)粘粒、柯斯載體。4、PAGE、瓊脂糖凝膠電泳和脈沖電泳的區(qū)別及其應(yīng)用范圍。電泳技術(shù)用途區(qū)別瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA或總RNA的完整性、對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)以及對(duì)核酸進(jìn)行回收和純化分辨100bp~50kb的核酸片段聚丙烯酰胺凝膠電泳生物多樣性檢測(cè)以及親子鑒定等分辨1bp~1000bp的核酸片段脈沖電場(chǎng)凝膠電泳分離大分子量的DNA分子分辨>50kb的核酸片段2、λ噬菌體的繁殖方式①溶菌性方式：λ噬菌體運(yùn)用宿主的酶類(lèi)和原料，λDNA復(fù)制成子代λDNA，并裝配呈子代λ噬菌體，最后裂菌，釋放出許多新的λ噬菌體。②溶源性方式：感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為細(xì)菌DNA的一個(gè)組成部分。3、λ噬菌體的類(lèi)型及體外包裝程序（二）體外包裝程序①包裝反映的底物，按照滾環(huán)復(fù)制機(jī)理合成多連體形式的DNA，在具有噬菌體頭部前體的條件下，從cos位點(diǎn)處被切割成單體分子。②將線性單體分子裝填到頭部外殼里，由于具有粘性末端而發(fā)生環(huán)化。③把頭部和分別組裝的尾部結(jié)構(gòu)連成一體，形成成熟的λ噬菌體顆粒。4、M13載體的優(yōu)點(diǎn)和用途;優(yōu)點(diǎn)：①只含單鏈DNA，因此可用作對(duì)DNA測(cè)序的模板及其它基因克隆實(shí)驗(yàn)，如異源雙鏈DNA分析，互補(bǔ)RNA的分離及DNA序列分析等；②可用來(lái)產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補(bǔ)的RNA；③RF型是雙鏈DNA，便于限制酶的辨認(rèn)和切割；④RF型DNA經(jīng)包裝后分泌到細(xì)胞外而不溶菌；⑤不存在包裝限制問(wèn)題。用途：①制備測(cè)序用單鏈DNA模板；②用于制備雜交探針；③用于定點(diǎn)突變。6、質(zhì)粒、λ噬菌體和柯斯質(zhì)粒的包裝限制。（1）λ噬菌體的包裝能力控制在為野生λ噬菌體DNA長(zhǎng)度（約48.5kb）的75%-105%。①蛋白質(zhì)外殼容納DNA的能力②λ噬菌體載體克隆外源DNA的能力（2）柯斯質(zhì)粒：可運(yùn)用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，運(yùn)用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)?？寺〉耐庠椿蚩蛇_(dá)45kb，比λ噬菌體大許多。由于包裝限制的緣故，存在最低限值（>30kb）。:噬箘粒特點(diǎn)：噬菌粒載體的分子量較小，約3000bp；既有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)又有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。在寄主內(nèi)，可以按正常的雙鏈質(zhì)粒DNA形式復(fù)制，形成的雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)，具有常規(guī)的質(zhì)粒特性（選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體，包裝成噬菌體顆粒后被擠出寄主細(xì)胞。用噬箘?？寺NA進(jìn)行測(cè)序，免去從質(zhì)粒到噬菌體這一亞克隆環(huán)節(jié)。（分子量小、克隆能力大；能穩(wěn)定遺傳；可用來(lái)制備單、雙鏈DNA。）（一）聚合酶鏈?zhǔn)椒从常≒CR）原理：雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱時(shí)便會(huì)分離成兩條單鏈的DNA分子，然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，引物與互補(bǔ)DNA結(jié)合后，經(jīng)單鏈雜交復(fù)性，并運(yùn)用反映混合物中的四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）按5’→3’方向?qū)⒁镅由?，合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。反映過(guò)程：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定期間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反映作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反映原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保存復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。變性：通過(guò)熱解決將待擴(kuò)增模板的雙鏈DNA變性裂解成單鏈DNA;退火：減少溫度，使單鏈靶序列與寡核苷酸引物雜交結(jié)合；延伸：在適當(dāng)條件下，DNA聚合酶使引物延伸，產(chǎn)生新的雙鏈。72℃3、反映體系和反映條件PCR反映體系：模板：DNA；引物：P1P2；DNA聚合酶：Taq；原料：dNTP；反映緩沖液；輔助因子：Mg2+Mg2+的作用：①M(fèi)g2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度為0.5-2.5mmol/L反映體系。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過(guò)高影響反映特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反映體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反映中游離的Mg2+濃度。引物二聚體：一條引物在另一條引物序列上進(jìn)行延伸所形成的與二條引物長(zhǎng)度相近的雙鏈DNA片段。（引物之間或引物自身存在互補(bǔ)序列）7、Southern雜交的原理——毛細(xì)管作用：用限制性?xún)?nèi)切酶將DNA消化成一定大小的片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化片段，再用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移等方法將變性的DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后用標(biāo)記的ssDNA（單鏈DNA）或RNA探針對(duì)固定在濾膜上的DNA進(jìn)行雜交。操作程序：①用凝膠電泳分離DNA片段②用堿變性也預(yù)解決凝膠，并將其放在兩端浸在緩沖液中的濾紙上③在凝膠上覆蓋一張濾膜④濾膜上加一疊干濾紙，并放上重物⑤穩(wěn)定DNA片段，并用X光膠片曝光后得放射自顯影照片，并與凝膠譜帶比較為什么在轉(zhuǎn)移之前需要進(jìn)行堿變性解決凝膠？使DNA片段保持單鏈狀態(tài)而易于同探針?lè)肿影l(fā)生雜交作用。8、Southern用途：（1）掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置；（2）構(gòu)建DNA分子的遺傳圖（3）分析基因組DNA消化片段、互相關(guān)系及長(zhǎng)度的多樣性（4）轉(zhuǎn)基因生物基因組中外源基因整合及整合位點(diǎn)的鑒定（5）基因操作過(guò)程中復(fù)雜基因構(gòu)件的分析鑒定Nornthernblotting（RNA印跡雜交）用途;檢測(cè)真核基因的轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄子的分子大小及相對(duì)豐度；是研究真核細(xì)胞基因表達(dá)的強(qiáng)有力手段。注意：防止RNA的降解8、原位雜交（菌落或噬菌斑雜交）的概念及原理：生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按照其本來(lái)的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。第六章基因文庫(kù)的構(gòu)建一、基因文庫(kù)的概念基因文庫(kù)：將某種生物的所有基因組的遺傳信息貯存在可以長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時(shí)可以隨時(shí)應(yīng)用它分離所需要的目的基因，這種保存基因組遺傳信息的材料稱(chēng)為基因文庫(kù)。注：基因文庫(kù)與基因庫(kù)的區(qū)別cDNA文庫(kù):指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的mRNA所有經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆集合。與基因組文庫(kù)的區(qū)別：cDNA文庫(kù)不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列一、cDNA文庫(kù)的特性①不含真核基因的間隔序列及調(diào)控區(qū)，不是真正意義上的基因；②僅包含某種組織或細(xì)胞正在表達(dá)的基因；③基因總量比基因組文庫(kù)小得多，易于篩選克??；④具有時(shí)效性，在轉(zhuǎn)錄水平上反映該生物在某一特定發(fā)育時(shí)期，某一特定組織在某種環(huán)境條件下的基因表達(dá)情況，不能涉及該生物體的所有基因。三種分離mRNA的方法傳統(tǒng)的分離方法是用oligo(dT)-纖維素柱分離總RNA；（2）把oligo(dT)-磁珠同總RNA混合，在強(qiáng)磁場(chǎng)下分離mRNA（3）用蔗糖梯度離心mRNA核糖體復(fù)合體（溶解細(xì)胞）來(lái)分離mRNAcDNA的合成:第一鏈的合成:mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶oligo(dT)核酸末端轉(zhuǎn)移酶，dNTPs：1.oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA合成法2.隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法第二鏈的合成:用RNaseH酶降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA，加入聚合酶Ⅰ，以第一條cDNA鏈為模板，降解的mRNA的段片段為引物合成第二鏈。cDNA文庫(kù)構(gòu)建的程序：（1）分離細(xì)胞總RNA，從中純化出重要含mRNA的分部；（2）合成第一鏈cDNA；（3）將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA分子；（4）將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞增殖。（三）cDNA克隆的優(yōu)越性①以mRNA為材料；（一些RNA病毒，不通過(guò)DNA中間體，對(duì)其研究，cDNA是唯一可行的方法）②cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)樸易行；③由于每一個(gè)cDNA克隆都具有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性的幾率比較低；④克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因，用作基因序列的測(cè)定和發(fā)育過(guò)程中或組織中基因特異表達(dá)一、應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）原理：用3’-端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈；用3’-端錨定引物和5’-端10-mer隨機(jī)引物組成引物對(duì)，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（DDRT-PCR），在標(biāo)準(zhǔn)的序列膠中電泳2~3小時(shí)，可顯示出50~100條長(zhǎng)度在100~5000bp之間的DNA條帶。2.建立文庫(kù)的目的，應(yīng)用范圍目的：①便于目的基因的保存、擴(kuò)增和純化；②分離克隆目的基因的重要途徑；③是復(fù)雜基因組作圖的重要依據(jù)。應(yīng)用范圍：①研究基因的結(jié)構(gòu)、功能和篩選基因工程目的基因；②基因定位、基因調(diào)控等方面研究。第七章目的基因的制取2.保護(hù)基團(tuán)的作用保證合成反映可以定向地進(jìn)行，將不需要參與反映的基團(tuán)，用保護(hù)基選擇性地保護(hù)起來(lái)，以獲得特定序列。（二）磷酸三酯法原理對(duì)于參與縮合反映的帶5’端保護(hù)基團(tuán)的單核苷酸，其磷酸分子中的一個(gè)-OH基團(tuán)已帶上適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)。余下的另一個(gè)具有活性的-OH與另一個(gè)帶有3’端保護(hù)基團(tuán)的單核苷酸的5’-OH縮合形成具磷酸三酯鍵的二核苷酸分子。（四）用寡核苷酸片段組裝基因的方式1.小片段粘接法：將待合成的目的基因提成若干小片段，每段長(zhǎng)12~15bp，兩條互補(bǔ)鏈分別設(shè)計(jì)成交錯(cuò)覆蓋的兩套小片段，然后通過(guò)化學(xué)方法合成，并退火形成雙鏈DNA大片段。小片段粘接法：根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)合成的DNA片段小，收率高；缺陷：各段的互補(bǔ)序列較短，易在退火時(shí)發(fā)生錯(cuò)配。2.補(bǔ)丁延長(zhǎng)法將目的基因的一條鏈提成若干40~50bp大小的片段，另一條鏈設(shè)計(jì)成與上述大片段交錯(cuò)互補(bǔ)的小片段（約20bp的補(bǔ)丁）。兩組不同大小的DNA單鏈片段退火后，用klenow酶將空缺部分補(bǔ)齊，最后用T4DNA連接酶修復(fù)缺口補(bǔ)丁延長(zhǎng)法：根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成20堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段以及40-50堿基長(zhǎng)的單鏈DNA中片段優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)合成與酶促合成相結(jié)合的方法減少寡聚核苷酸的合成工作量；能保證互補(bǔ)序列的足夠長(zhǎng)度。3.大片段酶促法將目的基因兩條鏈均提成40-50bp的單鏈DNA片段，分別進(jìn)行化學(xué)合成，然后用klenow和T4DNA連接酶補(bǔ)平。優(yōu)點(diǎn)：減少拼接模塊數(shù)，合用于較大的目的基因合成。大片段酶促法：根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長(zhǎng)的單鏈DNA片段上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對(duì)較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個(gè)單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%。四．基因的組裝：按設(shè)計(jì)規(guī)定用許多寡核苷酸片段裝配成完整基因的過(guò)程。（三）固相亞磷酸三酯法操作環(huán)節(jié)：DNA體外重組與基因轉(zhuǎn)移體外重組：靠DNA連接酶將適當(dāng)切割的DNA即目的基因與其載體共價(jià)連接。體外連接DNA片段的方法：①用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段。②用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來(lái)，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具有平末端的DNA加上poly(dA)-poly(dT)尾巴后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái)。③先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái)。3.亞克?。喊袲NA片段從某一類(lèi)型的載體無(wú)性繁殖到另一類(lèi)型載體的過(guò)程稱(chēng)為亞克隆。用細(xì)菌堿性磷酸酶或小牛腸堿性磷酸酶酶切后的質(zhì)粒，堿性磷酸酶能水解5’-磷酸基團(tuán)產(chǎn)生5’-OH。4..銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10~12bp組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定限制酶辨認(rèn)和切割序列的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。2.銜接物進(jìn)行平末端鏈接程序：用連接酶將銜接物連接到外源片段兩端用限制酶酶切成粘性末端連接酶連接（2）DNA接頭：它是一類(lèi)人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。1.定向克?。菏雇庠碊NA片段定向插入到載體分子的克隆方案。3.定向克隆的連接方式：①經(jīng)酶切后得到黏端連接（粘-粘連接）②外源DNA與載體DNA的一側(cè)為黏端，另一側(cè)為平末端（粘-平連接）（三）平-粘端連接法①添補(bǔ)法：對(duì)5’突出黏端的補(bǔ)齊：用klenow酶補(bǔ)齊后，用堿性磷酸酶解決防止自身環(huán)化。②消除法：對(duì)3’突出末端的削平:用T4DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性削平平-平端連接法用核酸連接酶給平末端加入一小段DNA序列后，成為粘端，再用DNA連接酶進(jìn)行連接。方法：（3）同聚物加尾法末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：能催化5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’－3’方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用品有的3’-OHDNA片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA細(xì)胞轉(zhuǎn)化：指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特性發(fā)生遺傳性改變的生命過(guò)程。五．大腸桿菌是基因工程重要的實(shí)驗(yàn)菌株，用CaCl2溶液解決大腸桿菌，誘導(dǎo)其呈現(xiàn)感受態(tài)。六.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)的E.coli細(xì)胞捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的生命過(guò)程。轉(zhuǎn)染：感受態(tài)的E.coli細(xì)胞捕獲和表達(dá)噬菌體載體DNA分子的生命過(guò)程。1.宿主菌的規(guī)定：①感受態(tài)細(xì)胞；需經(jīng)一定方法解決后，具有接受外源DNA能力的E.coli。②限制性?xún)?nèi)切酶缺陷型，外源DNA進(jìn)入受體菌不至于被降解；③DNA重組缺陷型，可以并保持外源DNA在受體內(nèi)的完整性；④符合安全標(biāo)準(zhǔn)，不適于非培養(yǎng)條件下生存。體外包裝轉(zhuǎn)染法:使用體外包裝體系的特殊的轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將外源重組DNA分子導(dǎo)入寄主細(xì)胞的方法。受體細(xì)菌的感受態(tài)感受態(tài)：是細(xì)菌吸取轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。方法：CaCl2解決，增長(zhǎng)細(xì)胞膜通透性，便于基因進(jìn)入細(xì)胞。外源目的基因向真核細(xì)胞轉(zhuǎn)入（一）借助載體的基因轉(zhuǎn)移常用重組的動(dòng)植物病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。(二）脂質(zhì)體導(dǎo)入法重要用于動(dòng)物細(xì)胞或植物的原生質(zhì)體。（三）血影細(xì)胞介導(dǎo)法哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞（四）電穿孔轉(zhuǎn)移法重要用于葉綠體或線粒體的基因工程操作（五）基因槍法重要用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染（六）微注射法重要用于動(dòng)物細(xì)胞或植物的原生質(zhì)體，第九章重組體的鑒定與文庫(kù)篩選一．插入失活效應(yīng):將外源基因片段插入到載體后，會(huì)使某些選擇記號(hào)基因（報(bào)告基因）失活的現(xiàn)象。1.抗藥性記號(hào)插入失活選擇法①外源DNA片段插入到載體的Tetr基因，使其失活；②將該重組子轉(zhuǎn)化給大腸桿菌的AmpsTets菌株，并涂布在Amp瓊脂平板上，可獲得該質(zhì)粒和重組子的寄主細(xì)胞均可長(zhǎng)成菌落；③將Amp瓊脂平板上的菌落原位影印在Tet瓊脂上生長(zhǎng)，對(duì)比這兩個(gè)平板的菌落生長(zhǎng)情況，凡在Amp平板上生長(zhǎng)而在Tet平板上不能生長(zhǎng)的菌落，即帶有重組體質(zhì)粒的陽(yáng)性克??；④挑出陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增分離帶有外源DNA插入片段的重組體質(zhì)粒。外源基因的表達(dá)一．外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)對(duì)的表達(dá)的基本條件①外源基因不能帶有間隔序列，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA；②必須運(yùn)用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)；③外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成對(duì)的的開(kāi)放閱讀框架；④通過(guò)表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；⑤運(yùn)用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的毒害。原核表達(dá)系統(tǒng)常用的強(qiáng)啟動(dòng)子：lac(乳糖啟動(dòng)子)、trp(色氨酸啟動(dòng)子)、λPR(λ噬菌體右向啟動(dòng)子)、λPL(λ噬菌體左向啟動(dòng)子)、t