GB∕T 43628-2023 空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法（正式版）

空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法metagenomicssequencing國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 25原理 26試劑 27儀器設(shè)備 28試驗步驟 39質(zhì)量控制 410空氣病原微生物鑒定 4附錄A(資料性)核酸提取方法 6附錄B(資料性)測序流程 7附錄C(資料性)參考基因組數(shù)據(jù)庫和病原微生物選取 8附錄D(資料性)鼠疫桿菌及SARS病毒測序數(shù)據(jù)比對分析示例 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國生化檢測標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本文件起草單位：中國計量科學(xué)研究院、深圳華大生命科學(xué)研究院、中國測試技術(shù)研究院生物研究所、北京慧榮和科技有限公司、南京市計量監(jiān)督檢測院。朱蕊。日常環(huán)境、公共場所、醫(yī)療衛(wèi)生環(huán)境以及生物安全實驗室的空氣中病原微生物的檢測與健康安全、環(huán)境保護密切相關(guān)。病原微生物可通過生物氣溶膠在空氣中傳播從而引起傳染病的流行?？諝庵胁≡⑸锏臏?zhǔn)確鑒別，對于傳染病預(yù)防與控制以及環(huán)境的監(jiān)測與保護具有重要的意義。由于空氣中病原微生物具有譜系多樣性、物種復(fù)雜性、較快的變異性等特點，使得具有高通量、快速、準(zhǔn)確等特點的宏基因組測序方法在空氣中病原微生物的鑒定中具有技術(shù)優(yōu)勢。針對空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法標(biāo)準(zhǔn)化的需求，本文件對空氣中重要病原微生物的檢測及鑒定方法，在空氣微生物氣溶膠采樣、前處理方法、文庫制備、測序、數(shù)據(jù)結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行了規(guī)定，滿足空氣病原微生物宏基因組測序方法的規(guī)范使用，以提升我國在病原微生物監(jiān)測上的能力。IN1空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法1范圍本文件規(guī)定了空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法的試驗條件、試驗步驟、質(zhì)量控制及鑒定。本文件適用于空氣中細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物的宏基因組測序鑒定及監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T18204.3公共場所衛(wèi)生檢驗方法第3部分：空氣微生物GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T39990顆粒生物氣溶膠采樣器技術(shù)條件GB/T40974核酸樣本質(zhì)量評價方法GB41918生物安全柜WS589病原微生物實驗室生物安全標(biāo)識3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。病原微生物pathogenicmicroorganism侵入生物體引起感染甚至傳染病的微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒等。宏基因組metagenome特定環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和，包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因組。測序sequencing對核酸分子中核苷酸堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)排列順序和組分的測定。注：序列通常從5'端到3'端表示。通過生物來源的、人工合成的或克隆技術(shù)等所得到的一個核苷酸亞分子群，如基因組文庫和互補24縮略語下列縮略語適用于本文件。cDNA:互補DNA(complementarydeoxyribonucleicacid)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)5原理利用氣溶膠采樣器采集空氣氣溶膠樣本，對樣本中的微生物進行核酸提取、文庫制備及宏基因組測序，得到微生物的核酸序列，并進行過程質(zhì)量控制。使用序列分析軟件將測序獲得的核酸序列與微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫序列信息進行比對分析，獲得數(shù)據(jù)庫中比對到的微生物信息，根據(jù)設(shè)定的閾值對樣本中微生物進行鑒定。6試劑生物學(xué)試劑應(yīng)為分子生物學(xué)級別的試劑，化學(xué)試劑應(yīng)為分析純試劑及以上，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的要求。6.1采樣試劑選擇與采樣器配套使用的采樣液，應(yīng)無菌、無核酸，如高壓高溫滅菌水、中性磷酸鹽緩沖溶液等。6.2核酸提取試劑采用商業(yè)化的核酸提取試劑盒，應(yīng)滿足痕量核酸提取，核酸提取總量不低于50ng。6.3文庫構(gòu)建試劑采用商業(yè)化測序平臺的建庫試劑盒。采用商業(yè)化測序平臺的測序試劑盒。6.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品宜選擇國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/有證標(biāo)準(zhǔn)樣品、質(zhì)量控制物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)包含核酸準(zhǔn)確量值、標(biāo)稱特性和微生物的譜系信息。7儀器設(shè)備7.1氣溶膠采樣器：流量達50L/min(過濾式采樣器)、不小于300L/min(離心式采樣器或大流量采樣器),采樣流量示值誤差應(yīng)不超過士5%,采樣效率不小于70%。7.2離心機：最大離心力不小于12000g。7.3熒光定量PCR儀：溫度設(shè)置范圍為0℃~99℃。37.4渦旋振蕩儀。7.5測序儀：測序通量不小于1Gb。7.6—80℃超低溫冰箱。7.7水浴鍋或金屬?。簻囟确秶鸀?0℃~100℃。7.8核酸蛋白定量儀：熒光原理，最低檢測樣品體積為1μL,DNA最低濃度為10pg/μL。7.9生物分析儀：DNA的分離范圍為25bp～12000bp;DNA和總RNA的分析靈敏度分別為7.10Ⅱ級以上生物安全柜：應(yīng)符合GB41918的要求。8試驗步驟8.1樣本采集8.1.1采樣點設(shè)置按照GB/T18204.3中的要求進行采樣布點。將氣溶膠采樣器(以下簡稱采樣器)放在距離地面1.2m～1.5m的位置，采樣器使用按照說明書要求進行。采樣前采樣容器/采樣膜應(yīng)無菌。使用離心式采樣器或大流量采樣器以不小于300L/min的流量采集10min～60min到采樣液中，或使用過濾式采樣器以不小于50L/min的流量采集40min~60min到濾膜上，采集后的樣本轉(zhuǎn)移和保存應(yīng)注意防止采樣以外的微生物污染。將采樣液轉(zhuǎn)移到離心管中，或?qū)⒉蓸訛V膜用無菌水溶解在離心管中，離心管應(yīng)無菌、無核酸殘留。將所獲得離心管中的采樣液保存于一80℃超低溫冰箱中。如需運輸，應(yīng)在低于一20℃條件下保存，建議使用干冰運輸，時間不超過24h。8.2核酸提取宜采用痕量核酸提取試劑盒進行采集樣本微生物核酸的提取，詳細(xì)提取方法及步驟按照試劑盒說明書或參考附錄A。進行RNA的提取時，應(yīng)在生物安全柜中并注意在人少時進行，防止空氣中RNA酶的污染，所用設(shè)備和耗材應(yīng)無RNA酶污染，并在使用前用紫外燈照射。提取核酸后，需加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品進行質(zhì)量控制。滿足實驗要求的DNA樣本應(yīng)置于-20℃以下條件保存，一般不超過7天，超過7天應(yīng)保存于一80℃超低溫冰箱中；RNA樣本應(yīng)置于一80℃條件保存。核酸樣本使用時，取樣不應(yīng)超過3次，避免樣本反復(fù)凍融。按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,充分降解RNA后，合成雙根據(jù)樣本種類及測序儀要求選擇合適的建庫試劑盒，按照建庫試劑盒說明書對符合要求的核酸進行文庫制備。同時為了得到高質(zhì)量的測序結(jié)果，需要對PCR擴增產(chǎn)物和文庫分別進行質(zhì)量檢測。文庫濃度和文庫片段長度需達到文庫質(zhì)量檢測合格的條件，滿足測序的需要。48.5測序按照測序的標(biāo)準(zhǔn)化流程進行。測序讀長在50bp～300bp范圍內(nèi)時，參照GB/T30989,見附錄B。將達到質(zhì)量檢測合格的待測序文庫，選擇合適的測序讀長，并對每個樣本添加標(biāo)簽，分別進行測序反9質(zhì)量控制9.1實驗室工作條件9.1.1實驗室的工作條件應(yīng)符合GB/T30989的規(guī)定。9.1.2實驗室的設(shè)施設(shè)備、實驗室人員的要求、實驗活動的管理、樣本的運輸與管理、消毒與滅菌、廢棄物的處置、應(yīng)急預(yù)案與意外事故的處置等應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。9.1.3實驗室應(yīng)按照WS589的要求，在實驗室相應(yīng)區(qū)域設(shè)置正確的標(biāo)識。9.2核酸提取質(zhì)量控制在核酸提取過程中，同時使用空白采樣液作為陰性對照、具有代表性的非致病性微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品作為陽性對照同時進行提取。按照GB/T40974的要求對提取的核酸進行檢測與質(zhì)量控制，并選擇加入內(nèi)參物質(zhì)(如斑馬魚基因組核酸)后的核酸濃度需達到10ng/μL～1μg/μL。9.3建庫質(zhì)量控制建庫時加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。9.4數(shù)據(jù)質(zhì)量控制測序數(shù)據(jù)量宜大于1Gb。選擇合適的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制軟件，對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制。質(zhì)量控制內(nèi)容包括但不限于去除重復(fù)序列、低質(zhì)量數(shù)據(jù)、接頭序列等。合格測序數(shù)據(jù)應(yīng)滿足以下條件?！獪y序讀長在50bp～300bp范圍內(nèi)時，堿基質(zhì)量值大于或等于20(即Q20:堿基識別錯誤率不大于1%)的占比在90%以上；測序讀長大于1kb時，堿基質(zhì)量值大于或等于7(即Q7:堿基識別錯誤率不大于20%)的占比為100%。——接頭序列污染比例不超過1%。——過濾低質(zhì)量序列、接頭序列后的剩余序列長度大于35bp。10空氣病原微生物鑒定10.1病原微生物參考基因組的數(shù)據(jù)庫選取病原微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫是與試驗數(shù)據(jù)比對的參比數(shù)據(jù)集，可利用在線公共數(shù)據(jù)庫(驗證)或若自行構(gòu)建病原微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫，應(yīng)進行數(shù)據(jù)信息的挑選、整理、分類，過濾公共數(shù)據(jù)庫的潛在錯誤(包括注釋錯誤及其他數(shù)據(jù)庫錯誤),收錄信息應(yīng)能覆蓋空氣中的主要病原微生物(種類包括細(xì)菌、病毒及真菌),確保每條收錄的序列數(shù)據(jù)準(zhǔn)確完整，同時定期進行自建數(shù)據(jù)庫的信息維護和更新。從空氣中分離的未知微生物的基因組序列，若在公共數(shù)據(jù)庫中不存在時，可采用大規(guī)模并行測序后的數(shù)據(jù)納入自行構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫中，作為參考基因組。5GB/T43628—202310.2病原微生物基因組序列比對及鑒定10.2.1使用序列分析軟件快速準(zhǔn)確地分類比對宏基因組序列，將樣本的序列比對到病原微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫的序列上，將比對結(jié)果按照序列的數(shù)量進行排序。序列分析軟件對測序數(shù)據(jù)比對分析參考附錄D中的示例。10.2.2統(tǒng)計陰性樣本、微生物陽性對照樣本和待測樣本的測序深度、基因組覆蓋度及各種病原微生物的占比，根據(jù)試驗結(jié)果設(shè)定的閾值，確定本批次實驗的有效性，鑒定空氣中病原微生物。6(資料性)核酸提取方法A.1宏基因組DNA提取宏基因組DNA提取可使用磁珠法或等效的核酸提取試劑盒。核酸提取試劑盒應(yīng)實現(xiàn)微生物細(xì)胞壁破裂、核酸釋放、分離、純化等。磁珠法提取微生物DNA的具體步驟描述如下。a)取1mL采樣液，12000g離心5min收集微生物，吸棄900μL上清液。加入100μL溶菌酶b)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL),再加入300μL裂解液，振蕩混勻后將離心管放置于恒溫混勻儀上，轉(zhuǎn)速控制在800r/min～1000r/min,溫度控制在65℃,孵育15min～30min直至液體變澄清。c)加入350μL異丙醇，振蕩混勻后再加入20μL磁珠，振蕩混勻，室溫靜置5min,中間混勻1次～2次。d)將離心管放置磁力架上靜置2min,磁珠完全吸附后，小心吸棄上清液體。e)將離心管從磁力架上取下，加入500μL含無水乙醇的洗滌液，振蕩混勻，室溫靜置2min。f)將離心管放置磁力架上靜置1min,磁珠完全吸附后，小心吸棄上清液體。g)將離心管從磁力架上取下，加入600μL含無水乙醇的洗滌液，室溫靜置1min。h)將離心管放置磁力架上靜置1min,磁珠完全吸附后，小心吸棄上清液體。i)重復(fù)步驟a)～h)一次，盡可能吸棄離心管中殘留的液體。j)將離心管放置磁力架上，開蓋室溫干燥10min,確保乙醇揮發(fā)干凈。k)將離心管從磁力架上取下，加入100μL洗脫液，振蕩混勻置于56℃金屬浴中，孵育5min,期間旋渦振蕩2次～3次，取出旋渦振蕩15s。1)將離心管放置磁力架上，靜置1min,待磁珠完全吸附后，小心吸取45μL～95μLDNA溶液轉(zhuǎn)移至一個新的收集管中，做好標(biāo)記并于一80℃保存。A.2宏基因組RNA提取采用微生物RNA提取試劑盒進行痕量RNA的提取。詳細(xì)操作步驟按照試劑盒說明書進行。7(資料性)B.1測序文庫的制備將待測序的核酸(DNA、cDNA或RNA)片段制備成兩端連有接頭(含有與擴增及測序引物互補的序列)、中間有短序列標(biāo)簽結(jié)構(gòu)的標(biāo)簽文庫，集合成為基因文庫；然后對基因文庫進行大規(guī)模平行擴增，得到含有待測核酸樣品的測序文庫。B.2待測核酸樣品的表面固定將待測序文庫中的待測核酸樣品固定于測序介質(zhì)中。B.3堿基循環(huán)測序B.3.1測序錨引物與待測序標(biāo)簽序列的結(jié)合通過待測核酸樣品上攜帶的接頭，將測序所用的測序錨引物與待測核酸序列進行結(jié)合。加入底物核苷酸，通過DNA聚合酶的作用，使得結(jié)合在待測核酸序列上的測序錨引物進行單堿基延伸，并利用信號收集儀器采集延伸過程中的信號或延伸后結(jié)合在測序錨引物上的底物核苷酸上的標(biāo)記物被激發(fā)出的信號。信號采集結(jié)束后，重復(fù)B.3.2的步驟，直至將所有信號采集完成。B.3.4分析采集的信號，輸出堿基序列通過信號分析軟件，對采集得到的信號進行分析，得到物理通量、有效通量、測序讀長、測序深度和平均覆蓋深度等基因測序儀運行參數(shù)，并最終得出待測標(biāo)簽序列的堿基序列信息。若所待測核酸樣品的核苷酸序列已有參考序列(即重測序),還能獲得測序覆蓋度，并通過與參考序列的比對，得到待測核酸樣品的核苷酸序列的SNP信息。8(資料性)參考基因組數(shù)據(jù)庫和病原微生物選取直接利用或者自行構(gòu)建數(shù)據(jù)庫所采用的基因組序列信息的公共數(shù)據(jù)庫，推薦從公共數(shù)據(jù)庫下載空氣微生物基因組序列，不限于如下推薦的數(shù)據(jù)庫。a)國內(nèi)數(shù)據(jù)庫推薦：——國家生物信息中心(CNCB):——國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(CNGB):——國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(NGDC):——國家微生物數(shù)據(jù)科學(xué)中心(NMDC):b)國外數(shù)據(jù)庫推薦：——美國食品藥品監(jiān)督局監(jiān)管級微生物序列數(shù)據(jù)庫(FDA-ARGOS):/medical-devices/science-and-research-medical-devices/database-reference-grade-microbial-sequences-fda-argos——全球微生物數(shù)據(jù)中心(WDCM):——綜合微生物基因組數(shù)據(jù)庫(IMG):/cgi-bin/m/main.cgi/m/main.cgi——基因組分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(GTDB):——美國國家生物信息中心(NCBI):——精選宏基因組數(shù)據(jù)庫(curatedMetagenomicData):/waldronlab/cu-ratedMetagenomicData在構(gòu)建數(shù)據(jù)庫后，如果有多個參考序列，在參考基因組注釋信息都比較完善的情況下，優(yōu)先推薦比對率高的基因組參考序列，在只有一個物種的情況下，結(jié)合基因組組裝水平、發(fā)布時間、注釋完整性來進行選擇。C.2構(gòu)建數(shù)據(jù)庫中病原微生物的選取在數(shù)據(jù)比對過程中，如需自行構(gòu)建病原微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫，建議參考我國傳染病防治法中甲、乙、丙類傳染病能通過空氣傳播的病原、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)中呼吸系統(tǒng)病原以及臨床檢驗中常見病原。部分病原微生物可參考表C.1。表C.1數(shù)據(jù)庫中空氣微生物參考列表病原名稱拉丁名類別傳染類別庖疹病毒Herpesvirus病毒臨檢重要病原腺病毒Humanadenovirus病毒臨檢重要病原腮腺炎病毒Mumpsrubulavirus病毒丙類[5風(fēng)疹病毒Rubellavirus病毒丙類[5]甲型流感病毒病毒乙類[5]9表C.1數(shù)據(jù)庫中空氣微生物參考列表(續(xù))病原名稱拉丁名類別傳染類別麻疹病毒Measlesmorbillivirus病毒乙類[5]非典型肺炎病毒(SARS病毒)Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus病毒乙類[5]新型冠狀病毒Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2病毒重大影響中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS)MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus病毒重大影響銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa細(xì)菌臨檢重要病原鮑曼不動桿菌Acinetobacterbaumannii細(xì)菌臨檢重要病原金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus細(xì)菌臨檢重要病原肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae細(xì)菌臨檢重要病原肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae細(xì)菌臨檢重要病原，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[6]麻風(fēng)分枝桿菌Mycobacteriumleprae細(xì)菌丙類[5],醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[6]鼠疫耶爾森菌Yersiniapestis細(xì)菌甲類[5]嗜肺軍團菌Pseudomonasaeruginosa細(xì)菌醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[6]流感嗜血桿菌Haemophilusinfluenzae細(xì)菌醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[6]炭疽桿菌Bacillusanthracis細(xì)菌乙類[5]腦膜炎球菌Neisseriameningitidis細(xì)菌乙類[5],臨檢重要病原結(jié)核分支桿菌Mycobacteriumtuberculosis細(xì)菌乙類[,臨檢重要病原，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[6]百日咳鮑特菌Bordetellapertussis細(xì)菌乙類[5],醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[6]白喉棒狀桿菌Corynebacteriumdiphtheriae細(xì)菌乙類[5],醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[]布魯氏菌Brucellasubtilis細(xì)菌乙類[],重大影響肺炎衣原體Chlamydiapneumoniat衣原體臨檢重要病原鸚鵡熱衣原體Chlamydiapsittaci衣原體臨檢重要病原耶氏肺孢子菌Pneumocystisjirovecii真菌臨檢重要病原煙曲霉Aspergillusfumigatus真菌臨檢重要病原白色念珠菌Candidaalbicans真菌臨檢重要病原肺炎支原體Mycoplasmapneumoniae支原體臨檢重要病原(資料性)鼠疫桿菌及SARS病毒測序數(shù)據(jù)比對分析示例D.1軟件中構(gòu)建數(shù)據(jù)庫使用Kraken軟件的“-kraken-build”進行建庫參數(shù)選擇，“-standard”為標(biāo)準(zhǔn)庫，“-special”為自定義庫，分別進行NCBI標(biāo)準(zhǔn)庫與新型冠狀病毒自定義庫的構(gòu)建。注：Kraken為基于精確比對的超快速宏基因組序列分類軟件。D.2將質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進行比對分析D.2.1參數(shù)設(shè)置“-db”為選擇上一步構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫