WS-T 478-2024 血清25-羥基維生素D2和D3檢測 同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS11.020CCSC50WS代替WS/T478—2015Measurementofserum25-hydroxyvitaminD2andD3——IsotopediluliquidchromatographytandemmassspecIWS/T478—2024本標準為推薦性標準。本標準代替WS/T478—2015《血清25-羥基維生素D3檢測操作指南同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》，與WS/T478—2015相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術變化如下：——更改了“范圍”（見第1章，2015年版的第1章）；——更改了“術語和定義”（見第3章，2015年版的第3章）；——更改了“符號與縮略語”（見第4章，2015年版的第4章）；——更改了“檢測原理和方法”（見第5章，2015年版的第5章——更改了“試劑和配制”（見第6章，2015年版的第6章）；——更改了“儀器”（見第7章，2015年版的第7章——更改了“樣品”（見第8章，2015年版的第8章——更改了“檢測系統(tǒng)和分析部分的準備”（見第第9章，2015年版的第9章——更改了“方法的評價”（見第10章，2015年版的第10章）。本標準由國家衛(wèi)生健康標準委員會臨床檢驗標準專業(yè)委員會負責技術審查和技術咨詢,由國家衛(wèi)生健康委醫(yī)療管理服務指導中心負責協(xié)調(diào)性和格式審查,由國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)政司負責業(yè)務管理、法規(guī)司負責統(tǒng)籌管理。本標準起草單位：首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院、中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院、上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院、北京醫(yī)院/國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心、中南大學湘雅醫(yī)院、北京大學人民醫(yī)院、天津醫(yī)科大學總醫(yī)院、鄭州大學第三附屬醫(yī)院。本標準主要起草人：張曼、劉娜、邱玲、李水軍、張江濤、易斌、岳志紅、門劍龍、袁恩武、周慧。本標準于2015年首次發(fā)布，本次為第一次修訂。1WS/T478—2024血清25-羥基維生素D2和D3的檢測同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法本標準規(guī)定了血清25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3檢測的常規(guī)方法-同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的技術要求，包括試劑配制、樣品制備、儀器檢測、數(shù)據(jù)分析等內(nèi)容。本標準適用于醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室利用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血清25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本標準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1內(nèi)標internalstandard在定量分析時，加入到樣品中作為參比物的已知量的化合物純品。3.2檢出限limitofdetection檢測方法在規(guī)定的實驗條件下所能檢出分析物的最低濃度。3.3定量檢測下限lowerlimitofmeasuringinterval在滿足實驗室對準確性和精密度要求的前提下，檢測方法在規(guī)定的實驗條件下所能準確定量檢測分析物的最低可測量濃度或量。3.4線性linearity在給定的測量范圍內(nèi)，使測定結(jié)果與樣品中分析物的量直接成比例的能力。此處的測定結(jié)果指最終的分析結(jié)果，而非儀器輸岀的原始信號。[來源：WS/T408—2012,定義2.2]3.5線性范圍linearrange使實驗系統(tǒng)的最終分析結(jié)果為可接受的線性的濃度范圍，此時非線性誤差應低于允許誤差。2WS/T478—2024[來源：WS/T408—2012,定義2.3]3.6基質(zhì)效應matrixeffect標本中除分析物之外的樣品性質(zhì)對分析物測定結(jié)果的影響。4符號與縮略語下列符號與縮略語適用于本標準。25(OH)VD2：25-羥基維生素D2(25-HydroxyvitaminD2)25(OH)VD3：25-羥基維生素D3(25-HydroxyvitaminD3)BSA：牛血清白蛋白(bovineserumalbumin)CV：變異系數(shù)(coefficientofvariation)LOD：檢出限(limitofdetection)LLMI：定量檢測下限(lowerlimitofmeasuringinterval)MRM：多反應監(jiān)測(multiplereactionmonitor)S/N：信噪比(signaltonoiseratio)5檢測原理和方法本標準建立的25(OH)VD2和25(OH)VD3檢測方法以同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測原理。方法是以穩(wěn)定同位素標記的25(OH)VD2和25(OH)VD3為內(nèi)標添加至血清中，內(nèi)標與血清均勻混合后，通過加入碳酸鹽緩沖溶液釋放出與蛋白結(jié)合的25(OH)VD2和25(OH)VD3，加入正己烷-乙酸乙酯混合溶液將其從血清當中萃取出來，將萃取液用氮氣吹干，用流動相初始比例溶液進行復溶。利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分離并檢測血清25(OH)VD2、25(OH)VD3和內(nèi)標特異的離子對。通過建立的標準品工作曲線以25(OH)VD2、25(OH)VD3與各自內(nèi)標峰面積比計算血清25(OH)VD2和25(OH)VD3濃度。6試劑和配制6.1試劑可選用的試劑如下：a)水：除非有特別說明，應使用GB/T6682定義的一級水；b)甲醇：色譜純；c)正己烷：色譜純；d)甲酸：色譜純；e)乙酸乙酯：色譜純；f)磷酸氫二鈉七水合物(Na2HPO4?7H2O)：分析純，CAS號：7782-85-6；g)磷酸二氫鈉一水合物(NaH2PO4?H2O)：分析純，CAS號：10049-21-5；h)氯化鈉：分析純，CAS號：7647-14-5；i)碳酸鈉：分析純，CAS號：497-19-8；j)碳酸氫鈉：分析純，CAS號：144-55-8；k)牛血清白蛋白(BSA):純度≥98Mr=66kDa，CAS號：9048-46-8；l)氫氧化鈉：分析純，CAS號：1310-73-2；m)25(OH)VD2標準品：純度≥98CAS號：21343-40-8；n)25(OH)VD3標準品：純度≥98CAS號：19356-17-3；o)25(OH)VD2-[2H3]：同位素標記純度≥97CAS號：1217467-39-4p)25(OH)VD3-[2H3]：同位素標記純度≥97CAS號：140710-94-73WS/T478—20246.2配制溶液6.2.1空白基質(zhì)溶液模擬人血清基質(zhì)的條件，選擇適當離子強度、適當pH及蛋白成分的物質(zhì)進行配制，盡量模擬人血清基質(zhì)的環(huán)境。如獲得人血清純化后無25(OH)VD2和25(OH)VD3的空白基質(zhì)為更佳。適用時，可釆用下述方法進行：a)稱量2.14gNa2HPO4?7H2O，0.268gNaH2PO4?H2O，0.9g氯化鈉，5g牛血清白蛋白；b)溶解于約75mL水中；c)用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到7.4；d)轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中；e)加水定容至100mL。該溶液2℃~8℃穩(wěn)定期為1個月，長期保存應加入防腐劑。6.2.2碳酸鹽緩沖溶液配制適用時，可采用下述方法進行配制：分別配制濃度為0.1g/mL的NaHCO3溶液10mL，0.1g/mLNa2CO3溶液40mL，在不斷攪拌的情況下向NaHCO3溶液中逐滴加入Na2CO3溶液，同時測量混合溶液的pH值，直到混合溶液的pH值為10.0，室溫密封避光保存，穩(wěn)定3個月。6.2.3正己烷-乙酸乙酯混合溶液適用時，可采用下述方法進行配制：將200mL正己烷和200mL乙酸乙酯混合得到體積比為50:50的正己烷-乙酸乙酯混合溶液，室溫密封避光保存可穩(wěn)定3個月。6.2.4內(nèi)標溶液及標準溶液的制備可根據(jù)生產(chǎn)廠商說明進行符合要求的相應調(diào)整，適用時，可采用下述方法進行配制。6.2.4.1內(nèi)標工作液配置方法如下：分別取同位素標記的25(OH)VD2和25(OH)VD3，加入甲醇，配置濃度為50ng/mL內(nèi)標工作液。6.2.4.2標準品工作液配制方法如下：分別取25(OH)VD2和25(OH)VD3標準品，加入甲醇及空白基質(zhì)溶液，配置濃度為5ng/mL,10ng/mL,20ng/mL,50ng/mL,100ng/mL,200ng/mL的標準品工作液。6.2.5流動相A適用時，可釆用含0.1％甲酸的水溶液，配制方法為移取300mL水，加入0.3mL甲酸，混勻后超聲排除液體中氣泡。流動相宜根據(jù)每日使用量新鮮配制。6.2.6流動相B適用時，可釆用含0.1％甲酸的甲醇溶液，配制方法為移取300mL甲醇，加入0.3mL甲酸，混勻后超聲排除液體中氣泡。由于甲醇為易揮發(fā)溶劑，宜根據(jù)每日使用量進行配制。6.2.7質(zhì)控品質(zhì)控品與待測樣品應具有相似或相同的基質(zhì)，具有較好的均勻性和穩(wěn)定性。7儀器4WS/T478—20247.1液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（以三重四極桿質(zhì)譜儀為例）應滿足以下使用要求：a)高效液相色譜儀；b)三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，裝配穩(wěn)定的離子源，如大氣壓化學電離源(APCI)、電噴霧電離源(ESI)等，各項參數(shù)指標符合正常工作的要求。7.2液相色譜柱液相色譜柱應滿足使用以下要求:a）反相五氟苯基色譜柱或C18色譜柱等分離能力相當者，具有良好穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；b）規(guī)格內(nèi)徑和理論塔板數(shù)滿足使用要求。7.3天平萬分之一天平（最小分度0.1mg），應校準合格并在檢定周期內(nèi)。十萬分之一天平（最小分度0.01mg），應校準合格并在檢定周期內(nèi)。7.4離心機水平轉(zhuǎn)頭離心機，離心力應滿足14000g。7.5旋渦式混合器適用于尖底離心管、圓底小玻璃瓶等的旋渦式混合裝置。7.6吹干裝置可連接氮氣源的吹干裝置。7.7微量移液器一支。7.8通風設備應配有必要的通風設備，如排風罩、通風櫥等。8樣品8.1通則本方法適用于新鮮、冰凍或凍干血清樣品的25(OH)VD2和25(OH)VD3濃度檢測。在處理樣品時，應嚴格遵從對潛在生物傳染性樣品處理的相關規(guī)定，操作時遵循生物安全規(guī)則，并根據(jù)規(guī)定對廢物進行處理。8.2樣品用量最小取樣量不宜低于0.1mL。8.3樣品的保存新鮮血清樣品若不立即檢測，應于2℃~8℃避光保存，保存時間不超過1周。-20℃及以下避光可穩(wěn)定保存28天，可根據(jù)試劑說明書進行符合要求的相應調(diào)整。使用前應在室溫下避光將血清融化、充分混勻。凍干樣品應按照說明書描述的使用期限和條件保存，臨用前按照說明復融重組，充分混勻。8.4樣品前處理（包括標準品工作液和待測血清樣品）5WS/T478—2024可根據(jù)生產(chǎn)廠商說明進行符合要求的相應調(diào)整，適用時，可采用下述方法進行樣品前處理：a)移取血清樣品或標準品工作液0.1mL，分別加入0.1mL內(nèi)標工作液、0.1mL碳酸鹽緩沖溶液，充分混勻后靜置10min；b)加入正己烷-乙酸乙酯混合溶液0.8mL，在渦旋混合儀上混勻2min；c)3130g條件下離心5min；d)充分吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；e)將離心管置于氮吹儀中，適合的氣流下氮氣吹干；f)加入流動相初始比例溶液0.1mL，在渦旋混合儀上混勻1min；g)14000g條件下離心5min；h)取0.08mL上清液至進樣瓶中待測。9檢測系統(tǒng)和分析部分的準備9.1液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)的準備9.1.1液相系統(tǒng)部分準備檢測前應對液相系統(tǒng)進行準備，包括：a）流動相準備：按照本標準第6.2.5條，第6.2.6條準備流動相A，流動相B，超聲除氣10min~15min；b）色譜柱的平衡：用合適的流動相比例（例如初始流動相比例）平衡色譜柱一定時間，直至色譜柱壓力達到平衡。9.1.2質(zhì)譜系統(tǒng)部分的準備檢測前應對質(zhì)譜系統(tǒng)進行性能檢查，包括：a）最近6個月內(nèi)進行過質(zhì)量校準；b）裝配穩(wěn)定的離子源，如大氣壓化學電離源(APCI)、電噴霧電離源(ESI)等，運行正常；c）真空度達到正常工作要求的范圍，所需輔助氣體純度和壓力（流量）符合要求、供應充足、氣路通暢。9.2檢測方法9.2.1液相色譜條件9.2.1.1液相色譜儀器條件使用者可以實現(xiàn)目標物與其他分析物有效分離并獲得良好峰型為原則進行條件優(yōu)化，包括：a)色譜柱：見本標準第7.2條；b)流動相：見本標準第9.1.1條；c)流速：0.5mL/min；e)柱溫：40℃;f)進樣器溫度：6℃。9.2.1.2液相色譜洗脫條件使用者可根據(jù)實驗需要進行條件優(yōu)化，見表1。6WS/T478—2024表1液相色譜洗脫條件%%010409.2.2質(zhì)譜條件使用者可以有效提高離子化效率為原則，優(yōu)化離子源的類型、溫度，以及霧化氣、干燥氣溫度和流量等參數(shù)；以有效提高離子傳輸效率為原則，優(yōu)化錐孔電壓，碰撞能量等參數(shù)，進而實現(xiàn)提高檢測靈敏度的目的，合理選擇反應模式，使用者可根據(jù)實驗需要進行條件優(yōu)化，包括：a)離子源：APCI；b)離子化電壓：5500V；c)氣簾氣：25psi；d)碰撞氣：Medium；e)霧化電流：5μA；f)霧化溫度：350℃;g)霧化氣：60psi；h)駐留時間：0.1s；i)離子對(MRM模式)：見表2表2質(zhì)譜條件25(OH)VD-[H]25(OH)VD-[H]9.2.3液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測按照以下步驟進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測：a)按照本標準第8.4條的方法對25(OH)VD2和25(OH)VD3標準品工作液和待測血清樣品進行前處理，按照本標準第9.2.1條和第9.2.2條的條件進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)設置和優(yōu)化；b)標準品工作液經(jīng)前處理后，按照濃度由低到高順序進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析；7WS/T478—2024c)待測血清樣品進行前處理后，進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。9.2.4結(jié)果計算9.2.4.1保留時間25(OH)VD2和25(OH)VD3在液相色譜中保留時間可依使用的色譜柱性能不同而有差異，建議分析物與標準品溶液保留時間差值小于0.1min(6s)。9.2.4.2工作曲線的建立9.2.4.2.1直線擬合對25(OH)VD2和25(OH)VD3及同位素標記的25(OH)VD2和25(OH)VD3按表2分別提取MRM離子色譜圖，積分得各自的峰面積。以標準品定量離子峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，以標準品濃度與內(nèi)標物濃度的比值為橫坐標進行直線擬合，按式(1)得到工作曲線參數(shù)a,b值。式中：Astd——標準品工作液中25(OH)VD2或25(OH)VD3定量離子MRM積分峰面積；AIS——標準品工作液中25(OH)VD2或25(OH)VD3內(nèi)標物MRM積分峰面積；Cstd——標準品工作液中25(OH)VD2或25(OH)VD3的濃度；CIS——標準品工作液中25(OH)VD2或25(OH)VD3內(nèi)標物的濃度,本方案中此濃度為50ng/mL；a——擬合直線的斜率；b——擬合直線的截距。直線擬合的相關系數(shù)r＞0.99。9.2.4.2.2建立工作曲線將本標準第9.2.4.2.1條中擬合得到的參數(shù)a,b帶入式(2),得到工作曲線。式中：Atarget——血清樣品中25(OH)VD2或25(OH)VD3定量離子MRM積分峰面積；AIS——血清樣品中25(OH)VD2或25(OH)VD3內(nèi)標物MRM積分峰面積；Ctarget——血清樣品中25(OH)VD2或25(OH)VD3的濃度；CIS——血清樣品中25(OH)VD2或25(OH)VD3內(nèi)標物的濃度，本方案中此濃度為50ng/mL；a——按照本標準第9.2.4.2.1條中擬合得到的直線斜率；b——按照本標準第9.2.4.2.1條擬合得到的直線截距。9.2.4.3血清樣品中25(OH)VD2和25(OH)VD3濃度的計算對血清樣品中25(OH)VD2和25(OH)VD3及同位素標記的25(OH)VD2和25(OH)VD3按照表2分別提取MRM離子色譜圖，積分得各自的峰面積。根據(jù)本標準第9.2.4.2.2條得到的工作曲線，可計算得到式(2)中Ctarget值，即血清樣品中25(OH)VD2和25(OH)VD3的濃度。10方法驗證10.1說明實驗條件優(yōu)化后，需對方法進行多方面驗證，例如精密度、正確度、回收實驗、線性、LLMI和基質(zhì)效應等。10.2精密度8WS/T478—2024依據(jù)已發(fā)布的行業(yè)標準等規(guī)范性文件，對方法的精密度進行驗證，定量檢測下限濃度附近低值CV＜20％,其余濃度CV＜15％。10.3正確度適用時，可利用有證標準物質(zhì)或者其他規(guī)范性文件方案進行驗證，正確度驗證結(jié)果在靶值±15％范10.4回收實驗依據(jù)已發(fā)布的行業(yè)標準等規(guī)范性文件進行回收實驗，理論值為樣本中內(nèi)源性分析物與所加入的標準品濃度之和，檢測值應在靶值±15％范圍內(nèi)。10.5線性依據(jù)已發(fā)布的行業(yè)標準等規(guī)范性文件，對方法的線性進行驗證：例如檢測血清樣品的線性范圍5ng/mL～200ng/mL。如收集到足量的更低濃度血清樣品，經(jīng)驗證后，可擴大線性范圍的低限；如獲得加入純物質(zhì)的更高值人血清，經(jīng)驗證后，可擴大線性范圍的高限。注：受標本本身濃度限制，高值血清為人血清加入純物質(zhì)獲得，低10.6LLMI在S/N≥3條件下按照已發(fā)布的行業(yè)標準規(guī)范文件計算LOD,推薦使用3～5個接近LOD濃度的樣品，每個濃度至少檢測10次。LLMI和理論值偏差應在±15％以內(nèi)，CV應＜20％。10.7基質(zhì)效應應依據(jù)行業(yè)內(nèi)或?qū)I(yè)領域認可的規(guī)范性文件，評價不同濃度時的基質(zhì)效應。10.8穩(wěn)定性依據(jù)行業(yè)內(nèi)或?qū)I(yè)領域認可的規(guī)范性文件，評價樣品、質(zhì)控品及內(nèi)標等穩(wěn)定性，保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定可靠。9WS/T478—2024參考文獻[1]MinevaEM,SchleicherRL,Chaudhary-WebbM,etal.Acandidatereferencemeasurementpr