用于靈敏檢測(cè)廢水中ermB的便攜式生物傳感器

正文抗生素抗性基因（ARG）是廣泛存在的污染物，對(duì)環(huán)境和公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，尤其是廢水中的ARG是環(huán)境中ARG的重要來(lái)源。因此，監(jiān)測(cè)和評(píng)估廢水中的ARG豐度對(duì)于環(huán)境管理具有重要意義。這里，將LAMP與CRISPR/Cas12a結(jié)合，建立了用于檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗性基因ermB的便攜式視覺(jué)平臺(tái)，首先設(shè)計(jì)了LAMP的6個(gè)引物和CRISPR/Cas12a的crRNA，用LAMP進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，并通過(guò)堿基配對(duì)引導(dǎo)Cas12a識(shí)別ermB。由于CRISPR/Cas12a在擴(kuò)增子識(shí)別后具有反式切割活性，使用報(bào)告分子修飾的ssDNA探針通過(guò)側(cè)流試紙條和熒光進(jìn)行可視化檢測(cè)。經(jīng)過(guò)磁珠簡(jiǎn)單的核酸提取后，所構(gòu)建的生物傳感器具有優(yōu)異的靈敏度和選擇性，使用熒光和廢水中的流條可以低至2.75×103

copies/μL，實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏的可視化現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。如Fig.1a所示，該生物傳感器的檢測(cè)過(guò)程包括以下步驟：過(guò)濾和裂解預(yù)處理、磁珠提取、LAMP預(yù)擴(kuò)增、CRISPR/Cas12a系統(tǒng)識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)、熒光和橫向檢測(cè)。作者首先設(shè)計(jì)了針對(duì)

ermB

基因的LAMP引物，接下來(lái)，設(shè)計(jì)了Cas12crRNA來(lái)特異性識(shí)別和檢測(cè)LAMP預(yù)擴(kuò)增的ermB基因。以一段crRNA為指導(dǎo)RNA，Cas12a可以識(shí)別與crRNA識(shí)別片段互補(bǔ)的ermB片段。目標(biāo)序列被識(shí)別后，其對(duì)ssDNA探針進(jìn)行非特異性切割的反式切割活性被激活。之后，設(shè)計(jì)了用熒光和相應(yīng)的猝滅劑修飾的單鏈DNA探針(5′?6-FAM-TTATT-BHQ1–3′)和用熒光和生物素分子修飾的單鏈DNA探針(5′?6-FAM-TTATTATT-Biotin-3′)分別用于熒光和側(cè)流裝置中的可視化檢測(cè)。在熒光檢測(cè)中，在Cas12a反式切割存在的情況下，ssDNA熒光探針解離，釋放猝滅劑以恢復(fù)熒光信號(hào)。結(jié)果可以通過(guò)熒光讀數(shù)裝置或特定光源激發(fā)來(lái)直觀地讀?。‵ig.1b）。相反，在沒(méi)有靶標(biāo)的情況下，由于缺少激活的Cas12a，ssDNA探針不會(huì)被切割,因此，沒(méi)有產(chǎn)生熒光信號(hào)。在可視化的側(cè)流檢測(cè)中，側(cè)流探針的每一側(cè)都用FAM和生物素進(jìn)行了預(yù)修飾。比色側(cè)流試紙條通常由帶有g(shù)t抗FAM抗體修飾的金納米顆粒(AuNP)的樣品墊、一條用鏈霉親和素標(biāo)記以捕獲生物素的對(duì)照線和一條帶有標(biāo)記的抗gt抗體以捕獲gt抗體的測(cè)試線組成。如果沒(méi)有特異性的LAMP產(chǎn)物，ssDNA探針保持完整，并且由于生物素和鏈霉親和素的結(jié)合，AuNP可以固定到對(duì)照線上，導(dǎo)致紅色沉積。相反，AuNPs復(fù)合物通過(guò)AuNPs和生物素的分離以及gt抗體與抗gt抗體的結(jié)合而固定在測(cè)試線上，形成紅色條帶。為了評(píng)估LAMP在檢測(cè)ermB基因時(shí)的靈敏度，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的目標(biāo)DNA片段以10倍梯度稀釋。結(jié)果Fig.2所示，熒光LAMP成功檢測(cè)到ARG

ermB，LOD為2.75×10

3

copies/μL。DNA濃度與循環(huán)閾值時(shí)間（CT）之間存在良好的線性關(guān)系，線性范圍跨越8個(gè)數(shù)量級(jí)，最高可達(dá)2.75×10

10

copies/μL。為了進(jìn)一步提高分析方法的特異性，研究人員將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)引入檢測(cè)中，以解決潛在的假陽(yáng)性問(wèn)題并提高靈敏度（Fig

3.a,b）。接著，為了滿足復(fù)雜現(xiàn)場(chǎng)條件下可視化的各種可能要求，使用熒光和側(cè)流試紙進(jìn)行可視化檢測(cè)分析(Fig

3.c,d)。之后，為了驗(yàn)證構(gòu)建的基于CRISPR/Cas12a的視覺(jué)平臺(tái)的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)原廢水進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)（Fig.4）。結(jié)果表明，構(gòu)建的CRISPR/Cas12a可視化平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)廢水中ARGs的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)?？偨Y(jié)：開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a的便攜式可視化生物傳感器，用于快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和評(píng)估廢水中的ARG。從取樣到出結(jié)果的檢測(cè)過(guò)程在2小時(shí)內(nèi)完成，不需要復(fù)雜的儀