轉錄組測序技術的應用及發(fā)展綜述

轉錄組測序技術的應用及發(fā)展綜述摘要：轉錄組測序（RNA-Seq）作為一種新的高效、快捷的轉錄組研究手段正在改變著人們對轉錄組的認識。RNA-Seq利用高通量測序技術對組織或細胞中所有RNA反轉錄而成cDNA文庫進行測序，通過統(tǒng)計相關讀段(reads)數(shù)計算出不同RNA的表達量，發(fā)現(xiàn)新的轉錄本；如果有基因組參考序列，可以把轉錄本映射回基因組，確定轉錄本位置、剪切情況等更為全面的遺傳信息，已廣泛應用于生物學研究、醫(yī)學研究、臨床研究和藥物研發(fā)等。文章主要比較近年來轉錄組研究的幾種方法和幾種RNA-Seq的研究平臺，著重介紹RNA-Seq的原理、用途、步驟和生物信息學分析，并就RNA-Seq技術面臨的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展前景進行了討論及在相關領域的應用等內(nèi)容，為今后該技術的研究與應用提供參考。關鍵詞:RNA-Seq；原理應用；方法；挑戰(zhàn)；發(fā)展前景Abstract：Transcriptomesequencing(RNA-Seq)isakindofhighefficiency,quicktranscriptomeresearchmethodsarechangingourunderstandingoftranscriptome.RNA-Seqtousehigh-throughputsequencingoftissuesorcellsofallRNAreversetranscriptionintocDNAlibraryweresequenced,throughstatisticalcorrelationreadparagraph(reads)numberswerecalculatedfromtheexpressionofdifferentRNAtranscripts,findnew;ifthegenomereferencesequence,thetranscriptsmappedtogenomic,determinethepositionofthetranscriptionshearcondition,moregeneticinformation,hasbeenwidelyusedinbiologicalresearch,medicalresearch,clinicalresearchanddrugdevelopment.ThispapercomparedseveralmethodsofplatformtranscriptomestudiesandseveralkindsofRNA-Seqinrecentyears,RNA-Seqfocusesontheprinciple,purpose,stepsandbioinformaticsanalysis,anddiscussestheRNA-Seqtechnologychallengesandfuturedevelopmentprospectandtheapplicationinrelatedfieldandothercontent,providethereferencefortheresearchandapplicationofthetechnologyfuture.Keyword：RNA-Seq;application;principle;method;challenge;developmentprospects前言：轉錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉錄出來的所有RNA的集合。轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構，揭示特定生物學過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理。轉錄組測序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量測序技術進行cDNA測序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本。隨著后基因組時代的到來，轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等各種組學技術相繼出現(xiàn)，其中轉錄組學是率先發(fā)展起來以及應用最廣泛的技術[1]。遺傳學中心法則表明，遺傳信息在精密的調控下通過信使RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質。因此，mRNA被認為是DNA與蛋白質之間生物信息傳遞的一個“橋梁”，而所有表達基因的身份以及其轉錄水平，綜合起來被稱作轉錄組(Transcriptome)[2]。轉錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)[2,3]。轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發(fā)點,了解轉錄組是解讀基因組功能元件和揭示細胞及組織中分子組成所必需的，并且對理解機體發(fā)育和疾病具有重要作用。整個轉錄組分析的主要目標是：對所有的轉錄產(chǎn)物進行分類；確定基因的轉錄結構，如其起始位點，5′和3′末端，剪接模式和其他轉錄后修飾；并量化各轉錄本在發(fā)育過程中和不同條件下(如生理/病理)表達水平的變化[2,3]。在過去的十幾年里，雜交技術的發(fā)展，再加上以標簽序列為基礎的方法的應用，第一次使研究人員對這一領域有了深入的了解，但毋庸置疑，隨著新一代測序(Next-generationsequencing，NGS)平臺的市場化，RNA-Seq(RNAsequencing)技術的應用已經(jīng)徹底改變了轉錄組學的思維方式。RNA-Seq，即RNA測序又稱轉錄組測序，是最近發(fā)展起來的利用深度測序技術進行轉錄組分析的技術[3]，該技術能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，在分析轉錄本的結構和表達水平的同時，還能發(fā)現(xiàn)未知轉錄本和稀有轉錄本，精確地識別可變剪切位點以及cSNP(編碼序列單核苷酸多態(tài)性)，提供更為全面的轉錄組信息。相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，RNA-Seq無需預先針對已知序列設計探針，即可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具，已廣泛應用于生物學研究、醫(yī)學研究、臨床研究和藥物研發(fā)等。本文在扼要介紹支持RNA-Seq的究，如microRNA、非編碼長RNA(IncRNA)、RNA編輯；(4)轉錄本結構變異研究，如可變剪接、基因融合；(5)開發(fā)SNPs和SSR等。表2三種轉錄組研究方法的比較[10]表3RNA-Seq與其他轉錄組學技術比較3、RNA一Seq的主要用途[11]RNA一seq技術能夠在單核昔酸水平對特定物種的整體轉錄活動進行檢測,從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本信息。由于轉錄組測序可以得到全部RNA轉錄本的豐度信息，加之準確度又高，使得它具有十分廣泛的應用領域。主要應用于：(l)檢測新的轉錄本，包括未知轉錄本和稀有轉錄本；(2)基因轉錄水平研究，如基因表達量、不同樣本間差異表達；(3)非編碼區(qū)域功能研究，如microRNA、非編碼長RNA(IncRNA)、RNA編輯；(4)轉錄本結構變異研究，如可變剪接、基因融合；(5)開發(fā)SNPs和SSR等。4、RNA一Seq的基本步驟[11]提取樣本總RNA后,根據(jù)所測RNA種類進行分離純化。再進而片段化為所用測序平臺所需的長度(或反轉錄后片段化)，反轉錄后連接測序接頭。接著利用PCR擴增達到一定豐度上機測序，直到獲得足夠的序列。所得序列通過與參考基因組比對或從頭組裝(denovoassembling)形成全基因組范圍的轉錄譜。試驗流程,如圖1所示。圖1RNA一eq試驗流程4.1、送樣要求1)請?zhí)峁┱執(zhí)峁㎡D260/280介于1.8～2.2之間，濃≥250ng/μl，總量≥40μg的總RNA，并確保RNA無降解，無污染；或提供濃度≥50ng/μl，總量≥400ng的mRNA。2)送樣管務必標清樣品編號，管口使用Parafilm膜密封。3)樣品保存期間切忌反復凍融。4)送樣時使用干冰運輸。5)質檢以我方電泳膠圖、紫外分析儀定量為準。6)請?zhí)顚懲暾乃蜆佑唵危⑻峁㏑NA電泳檢測照片，用自封袋密封后隨同樣品一起送樣。5、序言轉錄組技術在生物學、醫(yī)學、農(nóng)學中的應用隨著第二代測序技術的迅猛發(fā)展，其高通量、快速、低成本的特點成為越來越多的生物學研究者在解決生物學問題時的首選，尤其在轉錄組測序方面更顯示出極大的潛力。轉錄組（transcriptome）是指特定生物體在某種狀態(tài)下所有基因轉錄產(chǎn)物的總和，轉錄組研究是功能基因組研究的一項重要內(nèi)容。轉錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能（蛋白質組）的必然紐帶，同時相對于真核生物全基因組測序來說，轉錄組測序得到的序列不含有內(nèi)含子及其它非編碼序列，因此轉錄組測序有著無可比擬的高性價比優(yōu)勢。研究基因組結構的復雜性及遺傳語言的根本規(guī)律，更需要對測序所得的海量數(shù)據(jù)進行精準且全面的揭示和分析，于是生物信息學便成為一門迅速興起的交叉學科，它位于生物、計算機、數(shù)學等多個領域的交叉點上，不斷深入去探索堿基序列數(shù)據(jù)背后的生物學意義。目前轉錄組測序及分析技術可以解決新基因的深度發(fā)掘、低豐度轉錄本的發(fā)現(xiàn)、轉錄圖譜繪制、可變剪接的調控、代謝途徑確定、基因家族鑒定及進化分析等各方面的問題。轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發(fā)點，已經(jīng)被廣泛應用于生物學、醫(yī)學、農(nóng)學等許多領域。5.1、轉錄組技術在生物學中的應用快速獲得您感興趣的細胞、組織或生物體內(nèi)的mRNA種類及其豐度，幫助您發(fā)現(xiàn)由于可變剪接或者可變多聚腺苷化位點選擇所產(chǎn)生的新mRNAisoforms；快速獲得您感興趣的不同細胞或者不同組織內(nèi)的mRNA種類及其豐度，分析mRNA的差異表達信息。通過差異表達基因功能分析，可以發(fā)現(xiàn)在細胞分化，特別是胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞分化，機體發(fā)育，信號轉導等生物學過程中基因表達調控改變的整體特征；如果您希望研究某種基因如何通過改變細胞的基因表達調控網(wǎng)絡來發(fā)揮其生物學功能，您可以對該基因進行突變、敲除或敲低，然后對照組和實驗組的細胞內(nèi)的RNA-seq分析，通過差異表達分析即可以快速全面獲得您需要的信息。5.1.1、哺乳動物組織的轉錄組分析[12]哺乳動物基因組的巨大性和復雜性給其轉錄組研究帶來嚴峻挑戰(zhàn)。Mortazavi等研究員結合Illumina測序平臺，對成年小鼠的腦、肺、骨骼肌組織RNA進行轉錄組高通量測序及分析，獲得1.4億數(shù)據(jù)，約90%的位置與已知外顯子相匹配，同時也發(fā)現(xiàn)了未見報道的序列信息。約3000個新鑒定的3’UTR，可能在microRNA介導的轉錄后水平和翻譯水平調控中起重要作用；約3000個新鑒定的5’外顯子，提示有新的啟動子序列被利用。尤其在RNA剪接方面，該研究利用高通量測序獲得的海量數(shù)據(jù)，對比到約2×105種可能剪接方式的數(shù)據(jù)庫，鑒定出1.45×105種不同的剪接方式，其中可變剪接占主導，3500個基因擁有至少一種內(nèi)部剪接方式。該研究成果表明：高通量測序技術不僅能夠檢測到低豐度轉錄本，而且可以發(fā)現(xiàn)未知轉錄本，精確識別可變剪接位點，提供全面的轉錄組信息，這些均是芯片雜交技術或SAGE文庫測序技術無法比擬的，是目前深入研究轉錄組復雜性的有力工具。5.2、轉錄組技術在醫(yī)學中的應用在癌變和其他復雜疾病發(fā)生和發(fā)展過程中，細胞內(nèi)的基因表達模式會發(fā)生顯著改變。如果您是臨床醫(yī)生或者從事相關研究的科學家，希望快速全面掌握您感興趣的癌癥或者其他疾病發(fā)生中基因表達模式的改變，對該疾病的診斷和治療提供重要解決策略；那么，RNA-seq可以通過對照正常樣本和疾病樣本中表達模式發(fā)生顯著變化的基因，及其功能分析快速為您提供正確答案。在細菌和病毒侵染時，細胞內(nèi)的基因表達模式也會發(fā)生顯著變化。這些變化對機體的抗感染功能至關重要。如果您是從事相關研究的醫(yī)生或者科學家，希望快速全面掌握在某病毒或者細菌侵染過程中細胞基因表達模式的改變特征，為有效抵抗病原侵染提供重要解決策略；那么RNA-seq可以通過對照正常樣本和侵染樣本中表達模式發(fā)生顯著變化的基因，及其功能分析為您提供正確答案。5.2.1、癌細胞和組織中的基因融合[13]2009年美國密歇根大學醫(yī)學院的ChristopherA.Maher等研究者采用轉錄組高通量測序技術對癌細胞進行測序分析，以期找到新的基因融合。該研究成功“重新發(fā)現(xiàn)”了慢性粒細胞白血病細胞中BCR-ABL110的基因融合、前列腺癌細胞和前列腺癌組織中TMPRSS2-ERG2基因融合。另外，研究者還驗證了在癌細胞和腫瘤組織中導致嵌合轉錄的新的基因融合（SLC45A3-ELK4）。表征癌細胞中特定基因組失常在確定癌癥的治療目標中有重要的作用，因此確定誘發(fā)癌癥的基因失常是癌癥研究的一個主要手段。由癌細胞中染色體重新排列而導致的基因融合被認為是一些最普遍的“癌癥基因”產(chǎn)生的主要原因。由于它們在致癌過程中的誘發(fā)作用和精確地癌細胞局限性，融合基因可以描繪出理想的診斷標記物和合理的治療目標物。周期性基因融合，與血液惡性腫瘤、罕見骨腫瘤及軟組織腫瘤密切相關，并且最近還發(fā)現(xiàn)了其在一些常見的實體瘤中的作用，如：前列腺癌和肺癌。ChristopherA.Maher等人通過對不同細胞系進行轉錄組測序及后續(xù)的qRT-PCR、FISH、ArrayCGH或高密度SNPArray的驗證，證實了轉錄組測序對于檢測基因融合是一個非常有效地工具。另外，在ChristopherA.Maher等人用IlluminaGenomeAnalyzer進行轉錄組測序的研究中，為了消除假陽性數(shù)據(jù)，克服缺少長讀子的深度及減少局部基因定位排列中的短讀子的難度，長讀子和短讀子的序列數(shù)據(jù)被并入到一起進行分析。結果證明，這種整體化的處理方法極有效地減少了假候選基因并大大增加了試驗可行的候選基因的比率。一個重要的局限性則是，當鄰側的兩個基因只引起調控序列的融合而不是轉錄序列的時候，則不能使用轉錄組測序這個方法。但無論如何，該研究建立了基于轉錄組高通量測序技術發(fā)現(xiàn)新基因融合的可靠方法路線，為系統(tǒng)界定癌癥相關突變開辟了重要途徑。5.3、轉錄組技術在農(nóng)業(yè)中的應用在植物的正常生長，抗旱、抗逆、以及優(yōu)良品系培育等過程中細胞的基因表達模式會發(fā)生顯著變化。如果您是從事農(nóng)業(yè)研究的科學家或農(nóng)學家，RNA-seq可以通過對照正常樣本和您感興趣樣本中表達模式發(fā)生顯著差異的基因讓您快速全面掌握在您感興趣的植物性狀中起重要功能的基因，給力您育種或者相關農(nóng)業(yè)應用研究的進程。5.3.1、擬南芥可變剪接研究[14]SergeiA.Filichkin等研究者采用轉錄組高通量測序技術對擬南芥進行可變剪接分析，發(fā)現(xiàn)42%以上具有內(nèi)含子的基因具備可變剪接形式，這個數(shù)據(jù)遠遠高于EST測序方法（20%-30%）?？勺兗艚愚D錄本多數(shù)具有提前終止密碼子（PTC+），PTC+可作為無義介導的mRNA降解監(jiān)控機制（NMD）的靶標，或通過調控非預期剪接和轉錄機制（RUST）來調控功能轉錄本水平。該研究還發(fā)現(xiàn)在不同環(huán)境因素脅迫下，PTC+及相關剪接變體的相對比率會隨之發(fā)生轉變。研究成果還提示，和動物體內(nèi)類似，NMD和RUST同樣在植物體內(nèi)的基因表達中廣泛存在并扮演非常重要的角色。6、轉錄組測序技術面臨的挑戰(zhàn)和展望前景隨著測序技術的不斷進步，我們能夠對轉錄組開展更為深入的測序工作，能夠發(fā)現(xiàn)更多、更可靠的轉錄子，目前的大規(guī)模并行測序技術已經(jīng)徹底改變了我們對轉錄組的研究方法，測序結果的質量也在不斷提高，得到的信息量也在爆炸式增長。然而和其他所有新生技術一樣，RNA-Seq技術也面臨著一系列新問題：其一是龐大的數(shù)據(jù)量所帶來的信息學難題，比如如何最好地詮釋和比對鑒定多個類似的同源基因，如何確定最佳測序量，獲得高質量的轉錄圖譜等[15]；其二是如何針對更復雜的轉錄組來識別和追蹤所有基因中罕見RNA亞型的表達變化。有可能提前實現(xiàn)這一目標的將是使用配對末端測序和單分子測序等更新的測序技術，以及使用更長的讀段來增加測序深度和覆蓋度[16]；其三，目前的高通量測序技術大都需要較多的樣品起始量，這使得來源極為有限的生物樣品分析受到限制，因此如何對單細胞或少量細胞進行轉錄組測序是一個亟待解決的問題。最近這方面的研究也取得了一定進展，如Tang等[17]建立了一種mRNA-Seq方案，它以PCR為基礎擴增單個細胞的mRNA轉錄組，成功分析了取自小鼠四細胞胚胎時期的單個卵裂球的轉錄組。然而該方法只能捕捉帶有poly(A)尾巴的mRNA，也不能檢測絕大多數(shù)較長的mRNA(大于3kb)的5′末端,同時也不能保留原轉錄子的方向信息。除此之外還有一些新的針對低數(shù)量細胞進行轉錄組研究的技術正在不斷被開發(fā)[18]。最后，標準的RNA-Seq技術不能提供序列轉錄的方向信息，而這對于轉錄組注釋尤為重要，采用single-strandsequencing[19]和strandspecificsequencing[20]技術能很好的解決這一問題,或將成為RNA-Seq技術發(fā)展的一個重要方向。雖然RNA-Seq技術還面臨著種種困難，但作為一個剛剛起步的新技術RNA-Seq已經(jīng)顯示出其他轉錄組學技術無可比擬的優(yōu)勢：既能提供單堿基分辨率的轉錄組注釋又能提供全基因組范圍的“數(shù)字化”的基因表達譜，而且其成本通常比芯片和大規(guī)模的SangerEST測序要低,有人甚至提出了RNA-Seq最終取代基因芯片的猜測。然而就目前來看，作為兩個高通量的轉錄組學研究技術，在應用的某些方面既存在重疊和競爭也存在優(yōu)勢互補，一種技術能彌補另一種技術遺漏的部分,通常對一個生物學問題的回答需要不同實驗技術的協(xié)同配合，例如序列捕獲(SequenceCapture)技術就是結合了芯片和深度測序，利用芯片探針捕獲待測片段，再用深度測序技術分析核酸序列。但基因芯片的缺點，就在于它是一個“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)；而RNA-Seq的強項，就在于它是一個“開放系統(tǒng)”，它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力從本質上高于芯片技術，相信隨著相關學科的進一步發(fā)展和測序成本的進一步降低，RNA-Seq必將在轉錄組學研究領域占主導地位。參考文獻：[1]LockhartDJ,WinzelerEA.Genomics,geneexpressionandDNAarrays.Nature,2000,405(6788):827–836.[2]CostaV,AngeliniC,DeFeisI,CiccodicolaA.UncoveringthecomplexityoftranscriptomeswithRNA-Seq.JBiomedBiotechnol,2010,2010:853916.[3]WangZ,GersteinM,SnyderM.RNA-Seq:arevolutionarytoolfortranscriptomics.NatRevGenet,2009,10(1):57–63.[4]許波,張偉強,馮曉曦,等.轉錄組測序技術在玉米中的應用研究進展[J].玉米科學,2014,22(1):67～72,78.[5]MaherCA,Kumar-sinhaC,CaoXH,etal.TrancriptomeSequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009,458(7234):97一101.[6]周曉光,任魯風,李運濤,等.下一代測序技術:技術回顧與展望[J].中國科學生命科學,2010,40(1);23-37[7].ZhouXG,RenLF,LiYT,etal.Thenext-generationsequencingtechnology:atechnologyreviewandfutureperspective[J].ScientiaSinicaVitae,2010,40(1):23-37.[8]SchusterSC.Next-generationsequencingtransformstoday'sbiology[J].Nature,2008,200(8):16-18.[9]WangZ,GersteinM,SnyderM.RNA-Seq:arevolutionarytoolfortranscriptomics[J].NatureReviewsGenetics,2009,10(1):57-63.[10]楊曉玲,施蘇華,唐恬.新一代測序技術的發(fā)展及應用前景[J].生物技術通報，2010(10):76-81.[11]張春蘭,秦孜娟,王桂芝,等.轉錄組與RNA一Seq技術.生物孩術通報,2012年第12期,[12]祁云霞,劉永斌,榮威恒.轉錄組研究新技術:RNA一seq及其應用.遺傳,2011,33(11):1191一1202.[13]AliMottazavi,WilliamsBA,McCueK,etal.MappingandquantifyingmammaliantranscriptomesbyRNA-seq.NatMethods,2008,5(7):621-8.[14]MaherCA,SinhalCK,CaoXH,etal.Transcriptomesequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009,458:97-101.

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