第24章 皰疹病毒案例課件

皰疹病毒

herpesviruses,HV

第24章第24章皰疹病毒案例掌握皰疹病毒的致病性熟悉皰疹病毒的生物學(xué)性狀了解皰疹病毒的檢查方法和防治原則教學(xué)目的第24章皰疹病毒案例皰疹病毒(Herpesvirus)是一類中等大小、結(jié)構(gòu)相似、有包膜的DNA病毒。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)114種，分3個(gè)亞科已知的人類皰疹病毒有：?jiǎn)渭儼捳畈《?型和2型 （HSV1&2）水痘—帶狀皰疹病毒 （VZV）巨細(xì)胞病毒 （CMV）EB病毒 （EBV）人類皰疹病毒6型、7型、8型（HHV6,7,8）第24章皰疹病毒案例正式命名常用名病毒亞科重要生物學(xué)性狀所致疾病人類皰疹病毒1型（HHV-1）單純皰疹病毒1型（HSV-1）

繁殖快、殺細(xì)胞性感染感覺神經(jīng)節(jié)中潛伏唇皰疹、齦口炎、角膜結(jié)膜炎、腦炎等人類皰疹病毒2型（HHV-2）單純皰疹病毒2型（HSV-2）

同上生殖器皰疹、新生兒皰疹人類皰疹病毒3型（HHV-3）水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）

同上水痘、帶狀皰疹、腦炎人類皰疹病毒4型（HHV-4）Epstein-Barr病毒（EBV）

淋巴細(xì)胞中繁殖與潛伏傳染性單核細(xì)胞增多癥、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（?）等人類皰疹病毒5型（HHV-5）人類巨細(xì)胞病毒

常在淋巴細(xì)胞、腎臟及分泌腺體中潛伏先天性巨細(xì)胞包涵體病、單核細(xì)胞增多癥、間質(zhì)性肺炎、先天性畸形、肝炎人類皰疹病毒6型（HHV-6）人類皰疹病毒6型

同人巨細(xì)胞病毒嬰兒急疹、間質(zhì)性肺炎、骨髓抑制人類皰疹病毒7型（HHV-7）人類皰疹病毒7型

同人巨細(xì)胞病毒未明確人類皰疹病毒8型（HHV-8）人類皰疹病毒8型

同EB病毒Kaposi肉瘤彌猴皰疹病毒1猿猴B病毒

同HSV脊髓炎、出血性腦炎第24章皰疹病毒案例皰疹病毒的共同特征病毒顆粒呈球形，120～300nm。核衣殼約100nm。20面體立體對(duì)稱，有包膜雙鏈線形DNA第24章皰疹病毒案例除EB病毒及HHV-6、HHV-7和HHV8外，均能在人二倍體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生明顯CPE，并有核內(nèi)嗜酸性包涵體，形成多核巨細(xì)胞多種感染類型:顯性感染潛伏感染整合感染先天性感染第24章皰疹病毒案例Herpessimplexvirus,HSV第一節(jié)單純皰疹病毒第24章皰疹病毒案例單純皰疹病毒案例

患者，女，20歲。因經(jīng)常出現(xiàn)口唇黏膜處水皰而就診，患者發(fā)熱時(shí)口唇周圍常起針頭大小的小皰，常為一群，也有兩三群，自覺有輕度燒灼感，歷時(shí)1周左右可自愈，反復(fù)發(fā)作多次，并伴有口腔潰瘍、咽炎、舌炎等現(xiàn)象。第24章皰疹病毒案例思考題：1該患為何種病原體感染？病原體存在于何處？2潛伏感染的定義是什么？第24章皰疹病毒案例單純皰疹病毒單純皰疹病毒，由于在感染急性期發(fā)生水皰性皮疹即所謂單純皰疹而得名包括兩個(gè)血清型HSV-1HSV-2第24章皰疹病毒案例一、生物學(xué)性狀第24章皰疹病毒案例生物學(xué)性狀典型的皰疹病毒科病毒特征HSV有兩個(gè)血清型，即HSV-1和HSV-2。兩者DNA的同源性約為50%病毒體有六個(gè)包膜相關(guān)糖蛋白：gpB、gpC、gpD、gpE、gpG和gpH。gpC是型特異抗原，只有HSV-1有。gpD是病毒中和抗原，是亞單位疫苗的備選蛋白第24章皰疹病毒案例在多種細(xì)胞增殖，病毒復(fù)制快（48h），出現(xiàn)細(xì)胞腫脹變圓和核內(nèi)嗜酸性包涵體CPE第24章皰疹病毒案例二、致病性與免疫性第24章皰疹病毒案例性接觸垂直傳播傳播途徑密切接觸傳播：唾液、陰道分泌物、皰疹液，接吻，共用杯子，牙刷等。第24章皰疹病毒案例HSV感染較普遍

密切接觸和性接觸

經(jīng)粘膜和破損皮膚上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，水皰漿液充滿病毒顆粒，細(xì)胞碎片，基底部多核巨細(xì)胞；神經(jīng)細(xì)胞則為潛伏感染。皮膚損傷性水皰第24章皰疹病毒案例

原發(fā)感染

表現(xiàn)：粘膜與皮膚的局部皰疹HSV-1：腰以上感染為主唇皰疹齦口炎角膜結(jié)膜炎等

第24章皰疹病毒案例HSV-2：腰以下及生殖器感染為主

生殖系統(tǒng)皰疹、新生兒皰疹等第24章皰疹病毒案例

潛伏感染

原發(fā)感染后,HSV由感覺神經(jīng)

感覺神經(jīng)節(jié)

HSV-1:三叉神經(jīng)節(jié)和頸上神經(jīng)節(jié)

HSV-2:骶神經(jīng)節(jié)

潛伏的HSV不復(fù)制，對(duì)抗病毒藥物不敏感第24章皰疹病毒案例復(fù)發(fā)性感染

非特異性刺激：發(fā)熱、月經(jīng)、感染等激活潛伏病毒沿感覺神經(jīng)纖維下行到末梢感染粘膜或皮膚上皮細(xì)胞免疫記憶反應(yīng)病程短,組織損傷輕,感染更局限

第24章皰疹病毒案例先天性感染及新生兒感染：妊娠期婦女（HSV-1）

影響胚胎細(xì)胞的有絲分裂胎兒畸形、智力低下、流產(chǎn)。分娩--------新生兒皰疹第24章皰疹病毒案例HSV-2可能引起宮頸癌患過生殖器皰疹的婦女，宮頸癌發(fā)病率高用免疫熒光檢查癌組織HSV-2抗原患者HSV-2抗體效價(jià)高宮頸皰疹與宮頸癌好發(fā)部位相似分子雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSV-2基因片段尚不能作出結(jié)論。HSV-2可能是一種輔助致癌因子，或是一種與之無關(guān)的“過客”病毒第24章皰疹病毒案例

免疫IFN和NK細(xì)胞：限制原發(fā)感染發(fā)展中和抗體：阻斷病毒擴(kuò)散及潛伏感染細(xì)胞免疫：控制和消除HSV感染第24章皰疹病毒案例三、微生物學(xué)檢查法第24章皰疹病毒案例檢測(cè)核酸

PCR或原位雜交檢測(cè)抗原

熒光素或酶標(biāo)記抗體染色分離病毒

標(biāo)本：水皰液、唾液細(xì)胞：BHK-21，Vero

CPE：細(xì)胞腫脹；融合細(xì)胞；包涵體第24章皰疹病毒案例防治原則預(yù)防避免同患者接觸防止醫(yī)院內(nèi)感染剖腹產(chǎn)預(yù)防新生兒感染

HSV有致癌可能性，減毒活疫苗和死疫苗不宜用于人體包膜蛋白（提純的gG、gD）亞單位疫苗基因重組疫苗、多肽疫苗治療正研制國(guó)內(nèi)用HSVgCgD單克隆抗體制成滴眼液，用于治療皰疹性角膜炎，取得顯著療效無環(huán)鳥苷（ACV）對(duì)皰疹病毒選擇性很強(qiáng)的藥物第24章皰疹病毒案例單純皰疹病毒案例

患者，女，20歲。因經(jīng)常出現(xiàn)口唇黏膜處水皰而就診，患者發(fā)熱時(shí)口唇周圍常起針頭大小的小皰，常為一群，也有兩三群，自覺有輕度燒灼感，歷時(shí)1周左右可自愈，反復(fù)發(fā)作多次，并伴有口腔潰瘍、咽炎、舌炎等現(xiàn)象。第24章皰疹病毒案例思考題：1該患為何種病原體感染？病原體存在于何處？2潛伏感染的定義是什么？第24章皰疹病毒案例案例提示

根據(jù)臨床表現(xiàn)為單純皰疹病毒——1型感染。不同的皰疹病毒其體內(nèi)潛伏部位不同，ＨＳＶ——1主要潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)或頸上神經(jīng)節(jié)，ＨＳＶ——2潛伏于骶神經(jīng)節(jié)，ＥＢＶ主要潛伏于Ｂ淋巴細(xì)胞內(nèi)。第24章皰疹病毒案例

原發(fā)感染后少數(shù)病毒不被清除，以非活化狀態(tài)存留于機(jī)體內(nèi)。病毒不增殖，也不破壞細(xì)胞，與宿主細(xì)胞處于暫時(shí)平衡狀態(tài)。一旦病毒被再激活，可轉(zhuǎn)為顯性感染，疾病復(fù)發(fā)。第24章皰疹病毒案例Varicellazostervirus（VZV）第二節(jié)水痘-帶狀皰疹病毒第24章皰疹病毒案例水痘帶狀皰疹病毒案例患者，男，58歲。因感冒發(fā)熱2天后胸部皮膚產(chǎn)生水皰疹，水皰逐漸增多并顯著疼痛就診。查體見患者胸部皮膚有片狀水皰，沿肋緣分布形成帶狀。第24章皰疹病毒案例思考題：1該患為何種病原體感染？2該病怎樣進(jìn)行預(yù)防和治療？第24章皰疹病毒案例水痘－帶狀皰疹病毒（VZV）在兒童初次感染時(shí)引起水痘（Varicella），恢復(fù)后病毒潛伏在體內(nèi)，青春期或成年以后少數(shù)人復(fù)發(fā)可引起帶狀皰疹（Zoster），故稱為水痘－帶狀皰疹病毒（Varicella-ZosterVirus）第24章皰疹病毒案例與HSV相似：

①潛伏神經(jīng)細(xì)胞，引起復(fù)發(fā)感染②細(xì)胞免疫限制和防止重癥水痘③皮膚損傷以水皰為特征與HSV不同：

①呼吸道感染

②通過病毒血癥播散至皮膚一、生物學(xué)性狀第24章皰疹病毒案例水痘和帶狀皰疹二、致病性與免疫性第24章皰疹病毒案例致病性傳染源主要是患者，水痘患者急性期水皰內(nèi)容物及上呼吸道分泌物、或帶狀皰疹患者水皰內(nèi)容物都含有病毒病毒借飛沫經(jīng)呼吸道或接觸傳播好發(fā)年齡為3～9歲，多在冬季春季流行第24章皰疹病毒案例原發(fā)感染：水痘，一般病情較輕潛伏感染：原發(fā)感染后，病毒潛伏于脊髓后根神經(jīng)節(jié)或顱神經(jīng)的感覺神經(jīng)節(jié)。以后如機(jī)體免疫力下降，病毒被激活，病毒沿神經(jīng)軸突下行到所支配的皮膚細(xì)胞內(nèi)增殖，發(fā)生皰疹，排列呈帶狀，稱帶狀皰疹發(fā)生于身體的一側(cè)，以軀干中線為界，好發(fā)部位為胸、腹和面部多見于成年人，特別是40歲以上成年人第24章皰疹病毒案例水痘(ChickenPox)病毒經(jīng)呼吸道、結(jié)膜、皮膚等處侵入人體先在局部淋巴結(jié)增殖進(jìn)入血液散布到各個(gè)內(nèi)臟繼續(xù)大量增殖2～3周潛伏期皮膚廣泛發(fā)生丘疹，水皰疹和膿皰疹第24章皰疹病毒案例帶狀皰疹（Shingles）兒童時(shí)期患過水痘愈合病毒潛伏在脊髓后根神經(jīng)節(jié)或腦感染神經(jīng)節(jié)中機(jī)體免疫力下降等條件刺激病毒沿感覺神經(jīng)軸索下行該神經(jīng)所支配的皮膚細(xì)胞內(nèi)增殖在皮膚上沿著感覺神經(jīng)的通路發(fā)生串聯(lián)的水皰疹，形似帶狀第24章皰疹病毒案例免疫性兒童患水痘后，機(jī)體產(chǎn)生持久的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，極少再患水痘病毒中和抗體和細(xì)胞免疫不能有效地清除潛伏于神經(jīng)節(jié)中的病毒，故不能阻止病毒被激活而發(fā)生帶狀皰疹第24章皰疹病毒案例診斷：似HSV治療：①無環(huán)鳥苷②IFN：限制疾病預(yù)防：減毒活疫苗三、微生物學(xué)檢查法與防治第24章皰疹病毒案例防治原則VZV減毒活疫苗預(yù)防水痘感染和傳播有良好效果治療可用無環(huán)鳥苷、阿糖腺苷和高劑量干擾素第24章皰疹病毒案例水痘帶狀皰疹病毒案例患者，男，58歲。因感冒發(fā)熱2天后胸部皮膚產(chǎn)生水皰疹，水皰逐漸增多并顯著疼痛就診。查體見患者胸部皮膚有片狀水皰，沿肋緣分布形成帶狀。第24章皰疹病毒案例思考題：1該患為何種病原體感染？2該病怎樣進(jìn)行預(yù)防和治療？第24章皰疹病毒案例提示根據(jù)臨床表現(xiàn)為單純皰疹病毒——2型感染。第24章皰疹病毒案例提示VZV減毒活疫苗預(yù)防水痘感染和傳播有良好效果，接種對(duì)象為1歲以上末患過水痘的兒童和成人。對(duì)免疫功能低下者可用高效價(jià)人免疫球蛋白進(jìn)行緊急預(yù)防。治療可用無環(huán)鳥苷、阿糖腺苷和高劑量干擾素第24章皰疹病毒案例Humancytomegalovirus（HCMV）第三節(jié)人巨細(xì)胞病毒第24章皰疹病毒案例人類巨細(xì)胞病毒（HCMV）1956年Smith等首先用組織培養(yǎng)方法從患者腺體組織培養(yǎng)中分離出病毒。由于感染的細(xì)胞腫大并具有巨大的核內(nèi)包涵體故得名是巨細(xì)胞包涵體病的病原體CMV多為潛伏感染，常可由懷孕、器官移植、免疫抑制、艾滋病等因素被激活第24章皰疹病毒案例形態(tài)結(jié)構(gòu)：與HSV極相似宿主范圍：

較窄，不感染其它動(dòng)物；僅成纖維細(xì)胞中增殖。一、生物學(xué)性狀第24章皰疹病毒案例生物學(xué)性狀典型皰疹病毒結(jié)構(gòu)對(duì)宿主或培養(yǎng)的組織細(xì)胞感染有高度的種屬特異性：即HCMV只能感染人。只能在人成纖維細(xì)胞增殖復(fù)制周期為36～48h（增殖緩慢），其特點(diǎn)是細(xì)胞變圓、膨脹、核變大、形成巨大細(xì)胞，核內(nèi)出現(xiàn)周圍繞有一輪鷹眼狀大型嗜酸性包涵體（Owl’seyeinclusionbody）第24章皰疹病毒案例致病性潛伏部位唾液腺、乳腺、腎臟、白細(xì)胞及其他腺體長(zhǎng)期或間歇地從尿液、唾液、淚液、乳汁、精液、宮頸及陰道分泌物排出病毒第24章皰疹病毒案例傳播環(huán)節(jié)傳染源患者及無癥狀隱性感染者傳染方式胎盤產(chǎn)道密切接觸，通過口口或手口傳播輸血器官移植第24章皰疹病毒案例先天性感染（宮內(nèi)感染）通過胎盤感染胎兒。發(fā)生率為0.5%~2.5%，CMV是能引起先天性感染的主要病毒之一只有少部分（<10%）感染者表現(xiàn)癥狀，主要臨床表現(xiàn)是巨細(xì)胞包涵體?。S疸、肝脾腫大、溶血性貧血、紫癜等），極少數(shù)患兒表現(xiàn)為先天性畸形（小頭智力低下、神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)障礙、耳聾、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎等）第24章皰疹病毒案例經(jīng)產(chǎn)道感染，或出生后數(shù)周由母體的病毒（尿或乳汁中的病毒），或護(hù)理人員排出的病毒所引起的感染多數(shù)無癥狀或癥狀輕微，表現(xiàn)為輕聲度或明顯呼吸障礙、肝功損害通常不表現(xiàn)神經(jīng)損傷，預(yù)后良好圍生期感染第24章皰疹病毒案例免疫功能低下的病人感染發(fā)生于長(zhǎng)期免疫抑制劑治療、器官移植、AIDS、白血病、淋巴瘤等患者是由于體內(nèi)原有的潛伏HCMV被激活癥狀主要是肺炎、視網(wǎng)膜炎、腦炎、腦膜炎等，預(yù)后不好第24章皰疹病毒案例輸血感染輸入大量含有CMV的新鮮血液，可發(fā)生輸血后的單核細(xì)胞增多癥和肝炎等HCMV導(dǎo)致的單核細(xì)胞增多癥檢測(cè)不到嗜異性抗體和EBV相關(guān)抗體，可籍此區(qū)別與EBV所致的單核細(xì)胞增多癥預(yù)后良好第24章皰疹病毒案例接觸感染唾液、乳汁、尿、精液、宮頸分泌物存在HCMV，通過接吻、性接觸、哺乳等方式傳染。第24章皰疹病毒案例細(xì)胞轉(zhuǎn)化與致癌潛能HCMV基因組的DNA片段，體外可轉(zhuǎn)化地鼠胚和人胚成纖維細(xì)胞。接種乳鼠可形成腫瘤。宮頸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和Kaposi肉瘤組織檢出HCMV的DNA序列。第24章皰疹病毒案例細(xì)胞培養(yǎng)：成纖維細(xì)胞中增殖，生長(zhǎng)慢，CPE需2～6周。ELISA：HCMV-IgM；近期感染；胎兒感染HCMVCPE

包涵體三、微生物學(xué)檢查法第24章皰疹病毒案例防治原則丙氧鳥苷（ganciclovirDHPG）有防止CMV擴(kuò)散作用耐丙氧鳥苷的CMV感染可選用磷甲酸鈉，但效果比前者差CMV病毒活疫苗致癌潛能的問題有待解決CMV包膜糖蛋白的亞單位疫苗是研究的方向第24章皰疹病毒案例第四節(jié)EB病毒Epstein-Barrvirus，EBV第24章皰疹病毒案例EB病毒（Epetein-Barrvirus）Burkkit先生在研究非洲中部的一種發(fā)生于兒童的惡性淋巴瘤時(shí)曾預(yù)測(cè)該病是一種病毒感染性疾病。1964年加拿大學(xué)者Epstein和Barr從這種惡性淋巴瘤體外培養(yǎng)的淋巴瘤細(xì)系中，用電鏡觀察到一種新的人類皰疹病毒，后被命名為EB病毒第24章皰疹病毒案例形態(tài)結(jié)構(gòu)類似HSV一、生物學(xué)性狀第24章皰疹病毒案例生物學(xué)性狀典型皰疹病毒，但抗原結(jié)構(gòu)與其他皰疹病毒不同常規(guī)方法不能培養(yǎng)。僅能在CD21+的B淋巴細(xì)胞中增殖，轉(zhuǎn)化為可長(zhǎng)期傳代的類淋巴母細(xì)胞株。是一種嗜B細(xì)胞的皰疹病毒CD21分子是該病毒的受體，故含CD21的粘膜上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞是該病毒的宿主第24章皰疹病毒案例增殖性感染產(chǎn)生的抗原：早期抗原（earlyantigen，EA）：

DNA聚合酶活性,表示EBV增殖

EA抗體：早期抗體,持續(xù)幾個(gè)月，表示近期感染。

第24章皰疹病毒案例衣殼抗原（VCA）：

結(jié)構(gòu)蛋白，存在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核VCA-IgM出現(xiàn)早，消失快

VCA-IgG出現(xiàn)晚，持續(xù)幾年EBV膜抗原（MA）：

在細(xì)胞表面，屬包膜糖蛋白

MA-IgM表示近期感染

MA-IgG可持續(xù)存在第24章皰疹病毒案例

潛伏感染

EBV感染B細(xì)胞或上皮細(xì)胞

潛伏感染細(xì)胞含EBV基因組(游離或整合)選擇性表達(dá)潛伏期抗原，刺激B細(xì)胞增生或永生化

第24章皰疹病毒案例

EBV潛伏期抗原核抗原（EBNA）

B細(xì)胞核內(nèi)，為DNA結(jié)合蛋白

感染細(xì)胞逃避CTL殺傷

與細(xì)胞永生化有關(guān)

EBNA抗體：感染晚期持續(xù)存在潛伏膜蛋白（LMP）

在B細(xì)胞表面,致癌蛋白

改變細(xì)胞功能,抑制細(xì)胞凋亡

阻止?jié)摲《炯せ罟δ艿?4章皰疹病毒案例二、致病性與免疫性EB病毒在人群中廣泛感染我國(guó)3～5歲兒童感染率達(dá)90%以上主要通過唾液傳播，也可經(jīng)輸血傳染EB病毒在口咽部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，然后感染B淋巴細(xì)胞感染B細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)可造成全身性感染病毒可長(zhǎng)期潛伏第24章皰疹病毒案例傳染性單核細(xì)胞增多癥初次感染大劑量病毒，多見青少年，是一種急性全身淋巴細(xì)胞增生性疾病癥狀為發(fā)熱、咽炎、頸淋巴腺炎、肝脾腫大、血液中大量異形淋巴細(xì)胞持續(xù)數(shù)月后自愈，預(yù)后良好致病性第24章皰疹病毒案例非洲兒童淋巴瘤（即Burkitt淋巴瘤）于中非、新幾內(nèi)亞和美洲溫?zé)釒У貐^(qū)呈地方性流行多見于5～12歲兒童好發(fā)部位為顏面、腭部所有BL病人血清均含EBV抗體，其中80%以上滴度高于正常人在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)EBV基因組100%死亡率第24章皰疹病毒案例鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）地區(qū)性分部，主要東南亞和華南廣東省40歲以上的中老年人從鼻咽癌活檢組織中找到EBV鼻咽癌患者血清EBV相關(guān)抗原的抗體效價(jià)高于正常人NPC患者EBV潛伏感染時(shí)間通常很長(zhǎng)，在30年左右還不能認(rèn)為EBV是鼻咽癌唯一致病因素，可能是多種綜合因素中的一種第24章皰疹病毒案例免疫性EBV在人群中廣泛存在，成人抗體的陽性率達(dá)90%以上出現(xiàn)中和抗體，能阻止外源性病毒再感染細(xì)胞和體液免疫不能清除體內(nèi)已經(jīng)潛伏的EBV第24章皰疹病毒案例異嗜性抗體的檢測(cè)EBV特異性抗體檢測(cè)

三、微生物學(xué)檢查法第24章皰疹病毒案例微生物學(xué)檢查EBV分離培養(yǎng)困難可用核酸雜交和PCR等方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)EBV基因組及其表達(dá)產(chǎn)物血清學(xué)診斷

EBV特異性抗體的檢測(cè)檢測(cè)病毒VCA－IgA或EA－IgA抗體，滴度≥1：5～1：10有診斷意義異嗜性抗體凝集試驗(yàn)用于傳染性單核白細(xì)胞增多癥的輔助診斷第24章皰疹病毒案例防治原則我國(guó)用基因工程方法構(gòu)建的同時(shí)表達(dá)EBVgp320和HBsAg的疫苗，重點(diǎn)使用在鼻咽癌高發(fā)區(qū)gp320膜蛋白疫苗，正在英國(guó)大學(xué)生患者中作小規(guī)模接種，以期觀察該疫苗是否能降低傳染性單核細(xì)胞增多癥的發(fā)病率第24章皰疹病毒案例臨床病原教研室：孫艷EB病毒感染與多發(fā)性硬化癥的關(guān)系研究第24章皰疹病毒案例

課題來源該課題分別列為黑龍江省教育廳一般科研項(xiàng)目和齊齊哈爾市科技局指令項(xiàng)目，獲項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)1.5萬元，學(xué)院配備1.5萬元。第24章皰疹病毒案例

研究工作概述

該課題于2006年9月啟動(dòng)2008年12月完成全部實(shí)驗(yàn)第24章皰疹病毒案例研究工作概述1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相關(guān)抗體的檢測(cè)及EBV核酸的PCR檢測(cè)2.小鼠MS動(dòng)物模型制備及EB病毒感染導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)病理變化的研究第24章皰疹病毒案例研究背景多發(fā)性硬化癥（MultipleSclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘性疾病，病變累及的部位為腦和脊髓。特點(diǎn)為病灶多發(fā)，常有緩解和復(fù)發(fā)，病殘性大。表現(xiàn)為多種神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和體征。有復(fù)發(fā)緩解型、繼發(fā)進(jìn)展型、原發(fā)進(jìn)展型、復(fù)發(fā)進(jìn)展型和良性MS等數(shù)種類型，多見于歐洲及北美國(guó)家，在西方社會(huì)MS是造成青壯年神經(jīng)性殘疾中僅次于外傷的第二大因素。第24章皰疹病毒案例

過去認(rèn)為此病在我國(guó)較罕見，但近年來隨著診斷手段和醫(yī)療水平的不斷提高，陸續(xù)有此類病例報(bào)道，并且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其是在我國(guó)高緯度地區(qū)，如黑龍江發(fā)病率較高。盡管目前對(duì)MS的病因及病理機(jī)制尚未完全明了，但認(rèn)為MS的發(fā)病與遺傳、病毒、免疫、環(huán)境地理等因素有關(guān)，是多因素共同作用的結(jié)果。第24章皰疹病毒案例關(guān)于EB病毒感染與多發(fā)性硬化癥的關(guān)系研究，國(guó)外研究只證明，EBV感染與MS發(fā)病高度相關(guān)，而國(guó)內(nèi)目前尚屬空白，至今沒有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明EBV感染可以導(dǎo)致MS二者研究的報(bào)道，如果我們能開展此項(xiàng)研究將能填補(bǔ)國(guó)內(nèi)研究領(lǐng)域的空白。第24章皰疹病毒案例

EB病毒(EpsteinBarrvirus,EBV)EB病毒是一種嗜淋巴細(xì)胞的DNA病毒,主要侵犯B細(xì)胞。EB病毒基因組編碼6個(gè)抗原蛋白,膜殼抗原(VCA)、膜抗原(MA)、早期抗原(EA,可分為彌散成分D和局限成分R)、補(bǔ)體結(jié)合抗原(即可溶性抗原S)、EB病毒核抗原(EBNA,分EBNA1和EBNA2)和淋巴細(xì)胞檢測(cè)的膜抗原(LYDMA)。第24章皰疹病毒案例

EBV與人類許多疾病密切相關(guān)，如：傳染性單核細(xì)胞增多癥，EBV相關(guān)嗜血細(xì)胞綜合癥，鼻咽癌，淋巴瘤等。目前國(guó)外研究只證明EBV感染與MS發(fā)病高度相關(guān)，國(guó)內(nèi)目前尚屬空白，至今沒有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明EBV感染可以導(dǎo)致MS的研究。第24章皰疹病毒案例

本課題將從臨床抗體檢測(cè)、病毒核酸檢測(cè)、MS小鼠神經(jīng)系統(tǒng)病理變化等方面研究EBV感染與MS發(fā)病間的關(guān)系，將為探討MS致病機(jī)制和治療提供理論基礎(chǔ)。第24章皰疹病毒案例

ELISA法EBVIgG檢測(cè)試劑盒（上海生物制品研究所）、多功能酶標(biāo)儀（奧地利迪肯公司產(chǎn)品）、EBV-DNA-PCR試劑盒(EBV-DNA：269bp,華美生物工程公司)、PCR儀(美國(guó)MJ公司產(chǎn)品)、凝膠成像系統(tǒng)、垂直電泳儀豚鼠由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

主要試劑和主要儀器第24章皰疹病毒案例1.通過酶免疫法檢測(cè)對(duì)臨床MS患者的CSF中EBV特異的IgG水平，對(duì)MS患者CSF中EBV核酸的檢測(cè)。2.構(gòu)建動(dòng)物模型，將滅活EBV和EBV提取蛋白接種小鼠足墊，觀查神經(jīng)系統(tǒng)病理變化。實(shí)驗(yàn)方法第24章皰疹病毒案例1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相關(guān)抗體的檢測(cè)及EBV核酸的PCR檢測(cè)1.1研究對(duì)象

MS組：選擇臨床確診為MS的患者26例，符合Poster等制定的MS診斷標(biāo)準(zhǔn)，男10例，女16例，年齡12~72歲，平均40.1±13.6歲。對(duì)照組：4例為緊張性頭痛及5例神經(jīng)衰弱患者，17例為腰麻的痔瘡或肛瘺手術(shù)患者，男11例，女15例，年齡19~71歲，平均43.2±13.5歲。

MS組與正常對(duì)照組兩組間患者的年齡、性別間具有均衡性。實(shí)驗(yàn)方法第24章皰疹病毒案例1.2實(shí)驗(yàn)方法

收集MS組和對(duì)照組CSF標(biāo)本，均在采集30分鐘內(nèi)放入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.1ELISA法檢測(cè)腦脊液（CSF）中IgG

嚴(yán)格按照ELISA法EBVIgG檢測(cè)試劑盒說明書的流程操作，用兔抗人IgG（1mg/ml）包被ELISA板后，加入待測(cè)腦脊液（CSF）和HRP標(biāo)記的羊抗人IgG（1：5000），用DAB顯色。用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490nm測(cè)定光吸收值（A490）,IgG濃度與A490值成正比。檢測(cè)結(jié)果采用SSPSforwindows軟件包對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有顯著差異。實(shí)驗(yàn)方法第24章皰疹病毒案例1.2.2PCR技術(shù)檢測(cè)MS患者腦脊液（CSF）中EBV-DNA

腦脊液（CSF）模板處理方法：取腦脊液（CSF）2ml,用PBS液按等倍稀釋為1：4，稀釋過程需搖勻，用A法[17]提取模板DNA。取5ul用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：94℃，2min；93℃，30s；55℃,45s;72℃,45s；35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果。每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)EBV—DNA陽性質(zhì)粒對(duì)照和無模板的陰性對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)方法第24章皰疹病毒案例

2.小鼠MS動(dòng)物模型制備及EB病毒感染導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)病理變化的研究

將滅活的EBV和EBV的提取蛋白分別接種小鼠足墊。病理和免疫組化觀察小鼠是否因此導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生MS病理變化，從而找到MS患者與EB病毒感染關(guān)系的依據(jù)。

2.1動(dòng)物

豚鼠由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供30只，2.5月齡,雌雄各半,體重350g左右。實(shí)驗(yàn)方法第24章皰疹病毒案例

2.2EBV的制備

EBV的制備及滅活將B95－8細(xì)胞株用RPMI1640(含10%胎牛血清和2mmol/L谷氨酰胺)調(diào)整細(xì)胞密度至1×109個(gè)細(xì)胞/L,接種于培養(yǎng)瓶中，隔日半量換液,并適時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細(xì)胞饑餓14天后,收集培養(yǎng)上清500ml,于4℃以

22000r/min離心1小時(shí)。棄上清,用10mlIMDM培養(yǎng)基重懸沉淀,并濃集50倍,0.45μm濾膜過濾。

實(shí)驗(yàn)方法第24章皰疹病毒案例

2.3MS動(dòng)物模型的制備

實(shí)驗(yàn)分兩組:(1)實(shí)驗(yàn)組,21只，取EBV懸液,加福(氏)完全佐劑(CFA),乳化后按體重注入豚鼠后足掌,抗原量約為按體重0.66μg/g。免疫后約8～9天發(fā)病,發(fā)病動(dòng)物出現(xiàn)不同程度肢體無力,體重減輕,繼之癱瘓,伴有尿便障礙,有的抽搐死亡。

(2)對(duì)照組，9只，取EBV懸液5ml56℃加熱滅活60分鐘，加CFA注入,此組動(dòng)物不發(fā)病。實(shí)驗(yàn)方法第24章皰疹病毒案例

2.4取材

動(dòng)物處死后立即將腦和脊髓取出,除留少量組織置于3%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛中,其余均置于40g/L的多聚甲醛中固定,固定后2周取材,取腦室周圍的腦實(shí)質(zhì),脊髓分頸、胸、腰3段。

2.5組織病理

HE染色及Weil鐵礬蘇木素染色。

2.6半薄切片及超薄切片

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)電鏡室制備。

實(shí)驗(yàn)方法第24章皰疹病毒案例

1.腦脊液（CSF）中IgG的檢測(cè)

ELISA法檢測(cè)MS組和正常對(duì)照組腦脊液（CSF）中IgG含量，MS組腦脊液（CSF）中IgG含量平均為（x±s）：0.026±0.002，（26例臨床確診為MS患者CSF中IgG含量在0.016~0.047ng/ml之間）；正常對(duì)照組腦脊液（CSF）中IgG含量平均為（x±s）：0.005±0.002（26例正常對(duì)照組CSF中IgG含量在0.002~0.008ng/ml之間）。以EBVIgG4倍升高作為診斷依據(jù)。

結(jié)果：MS組CSF中IgG含量異常的百分率為76.93%（20/26）；對(duì)照組CSF中IgG含量異常的百分率為0。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果第24章皰疹病毒案例

2.PCR法檢測(cè)腦脊液（CSF）中EBV-DNA

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并以PCRMarker(x174)為分子標(biāo)準(zhǔn)參照物，以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在269bp處有擴(kuò)增條帶者為EBV-DNA陽性，反之為陰性，電泳結(jié)果見圖1-4。MS組EBV-DNA陽性率為94.6%（24/26），正常對(duì)照組EBV-DNA陽性率為0。

T檢驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：MS組與正常對(duì)照組EBV-DNA陽性率有顯著性差異（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第24章皰疹病毒案例PCR法檢測(cè)腦脊液（CSF）中EBV-DNA圖1MS組EBV-DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果Fig1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNAP.positivecontrol;N.negativecontrol；Line1-9.PCRproductsofMSgroup(9,negative)PN123456789第24章皰疹病毒案例圖2MS組EBV-DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果Fig2AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA10-15.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174101112131415MPCR法檢測(cè)腦脊液（CSF）中EBV-DNA第24章皰疹病毒案例圖3MS組EBV-DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果Fig3AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA16-21.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174161718192021MPCR法檢測(cè)腦脊液（CSF）中EBV-DNA第24章皰疹病毒案例圖4MS組EBV-DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果Fig4AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA22-26.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174（25：negative）2223242526MPCR法檢測(cè)腦脊液（CSF）中EBV-DNA第24章皰疹病毒案例圖1MS組EBV-DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果Fig1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNAP.positivecontrol;N.negativecontrol；Line1-9.PCRproductsofMSgroup(9,negative)PN123456789PCR法檢測(cè)腦脊液（CSF）中EBV-DNA第24章皰疹病毒案例

3.光鏡結(jié)果

對(duì)照組的神經(jīng)組織病理檢查未見異常,這與此組未出現(xiàn)臨床癥狀吻合。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物大體腦組織可見腦膜血管充血,珠網(wǎng)膜下腔輕度混濁,腦橫切面可見呈針尖狀的小血管充血,彌漫分布。MS動(dòng)物的組織病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為急性血管炎伴周圍髓鞘脫失,脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)、珠網(wǎng)膜下腔及側(cè)腦室脈絡(luò)叢小血管充血,管周有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),形成“袖套”(cuffing)狀改變(圖1),發(fā)病初期主要為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),繼之以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主并有少量單核細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第24章皰疹病毒案例

Knobler等原位組織化學(xué)檢測(cè)顯示:

病變部位浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞以輔助T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞為主,而細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞/抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞罕見,小血管管壁增厚,管周間隙有漿液滲出。病灶播散在CNS白質(zhì)內(nèi),病灶均累及小靜脈,有的小靜脈破裂,周圍少量出血,可見白細(xì)胞附壁或正通過管壁,或進(jìn)而游出血管向炎性區(qū)移動(dòng)。腦膜和脊髓膜亦有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。側(cè)腦室旁白質(zhì)尤其側(cè)腦室角周圍白質(zhì)及脊髓后聯(lián)合、側(cè)角髓鞘腫脹,崩解消失,軸突腫脹,偶有軸突消失(圖2),并可見大量格子細(xì)胞存在。神經(jīng)元細(xì)胞無明顯改變,有的出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。以上病理改變符合文獻(xiàn)報(bào)道。第24章皰疹病毒案例

圖1血管周圍炎性浸潤(rùn)

Fig1

Inflammatoryinfiltrationaroundbloodvessels×10×15×20×40第24章皰疹病毒案例圖2白質(zhì)脫髓鞘

Fig2

Demyelinationinwhitematter第24章皰疹病毒案例

4.電鏡結(jié)果

電鏡下觀察MS發(fā)病動(dòng)物,病變分布不規(guī)則,脫髓鞘改變以血管周圍明顯,大部分髓鞘環(huán)形結(jié)構(gòu)呈松散狀