翻譯好的羅氏公司Tunel試劑盒操作說明書

羅氏(Roche)公司Tunel 試劑盒操作說明書(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理：TUNEL〔TdT-mediateddUTPnickendlabeling〕細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂狀況。其原理是熒光素〔fluorescein〕dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶〔HRP，horse-radishperoxidase〕HRP〔DAB〕反響產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反響〔呈深棕色〕，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的DNA3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本〔石蠟包埋、冰凍和超薄切片〕和細(xì)胞樣本〔細(xì)胞涂片〕在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。二、器材與試劑〔塑料飯盒與紗布〕、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含：號(hào)〔藍(lán)蓋〕EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、號(hào)〔紫蓋〕LabelSolution標(biāo)記液：熒光素標(biāo)記的dUTP1×、號(hào)〔棕瓶〕Converter-POD:標(biāo)記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇〔100、95、90、80、70%〕、DAB工作液〔臨用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS〕、ProteinaseK工作液〔10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8〕或細(xì)胞通透液〔0.1%TritonX-1000.1%檸檬酸鈉，臨用前配制〕、DNase3000U/m–3U/mlin50mMTris-HCpH7.，等。三、試驗(yàn)步驟操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反響液→加converter-POD→與底物DAB反響顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。具體操作步驟〔石蠟包埋切片的檢測(cè)〕：25min；〔100、95、90、80、70%〕13min；注：上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣本的處理4.ProteinaseK15-30min21–37°C〔溫度、時(shí)間、濃度均需摸索〕假設(shè)凋亡細(xì)胞染色較弱時(shí)，可用高濃度的ProteinaseK〔400μg/mL〕5分鐘。其它替代方法：石蠟切片的預(yù)處理也可根椐實(shí)際狀況可承受下述三種替代方法之一，即蛋白酶K處理的步聚改用下述方法，其余步聚均一樣：1:8-10min〔通透液：0.1%TritonX-1000.1%檸檬酸鈉，需穎配制〕替代方法2：將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中0.01NHCl〕3:200ml0.1M的檸檬酸緩沖液PH6的塑料盒中，350W〔低檔〕5min。5.PBS2次；制備TUNEL反響混合液：50μl1號(hào)液+450μl2號(hào)液混勻；50μl2

號(hào)液，100μlDNase115~25℃×10min，后面步驟同處理組。50μlTUNEL反響混合液〔50μl2號(hào)液〕37℃×1h。PBS3次；可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞〔激發(fā)光波長(zhǎng)為515~565nm〕；37℃×30min。PBS3次；50~100μlDAB15~25℃×10min；PBS3次；拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后馬上用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透亮、中性樹膠封片。PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀看凋亡細(xì)胞〔共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞〕并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合推斷〔未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但消滅發(fā)泡現(xiàn)象，晚期消滅凋亡小體，貼壁細(xì)胞消滅鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體〕對(duì)于培育細(xì)胞的預(yù)處理：①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸，枯燥后在去離子水中漂洗，4℃保存；約1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然枯燥，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上；4%25min；④PBS5min；0.2%的TritonX-1005min；⑥PBS5min；后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的6-15四、留意事項(xiàng)進(jìn)展PBS5min。PBSPBS溶液后再進(jìn)展下一步反響。在載玻片上的樣本上加上試驗(yàn)用反響液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)展，這樣可以使反響液均勻分布于樣本整體，又可以防止反響液枯燥造成試驗(yàn)失敗。TUNEL反響液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。20×DAB溶液顏色變深成為紫色，則不行使用，需重配制。PH4.0〕染色后，請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)展洗凈〔100%乙醇〕、脫水〔二甲苯〕透亮、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀看80~90%的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較簡(jiǎn)潔脫色，留意快速進(jìn)展脫水操作。7.2號(hào)液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，留意防護(hù)。試劑保存；未翻開的試劑盒貯存在-20℃〔-15~25℃〕；3號(hào)液6m內(nèi)穩(wěn)定，避開再次凍存；TUNEL反響液臨用前配好后，放至冰上直至使用。/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽性結(jié)果；而有些類型的凋亡DNADNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣現(xiàn)象現(xiàn)象可能緣由TdT酶的濃度過高非特異性 TdT酶反響時(shí)間過長(zhǎng)或TdT酶反響過程中反響液染色 滲漏，細(xì)胞或組織外表不能保持潮濕。〔建議TdTdilutionbuffer*1︰2—1︰10稀釋很好地掩蓋樣品。嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑成分阻擋TdT進(jìn)入胞內(nèi)反響，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。標(biāo)記率低很高

會(huì)導(dǎo)致樣本DNA的斷裂〕在固定組織時(shí)樣本DNA已斷裂〔內(nèi)源核酸酶的作用〕使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?，例如一些酸性固定液固定后某些核酸酶活性照舊較高導(dǎo)致DNA斷裂〔由于喪失〕熒光淬滅過低支原體污染TdT酶的濃度過高或反響時(shí)間過長(zhǎng)

固定承受推舉的固定液dUTPdAPT的溶液封閉用溶于PBSPH7.44%多聚甲醛固定或福爾馬林或戊二醛固定。聚甲醛固定10分鐘就會(huì)嚴(yán)峻淬滅，需留意避光操作12、增加通透劑的作用溫度〔15-25℃〕〔如：400ug/ml5min〕4、0.1M7030min。原體污染1︰2—1︰10稀釋或留意掌握反響時(shí)間紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)峻干擾。宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。DNA脫落

1、冷凍切片使用3u/ml的DNaseIDNas