動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

(完整(完整word版)2023動(dòng)物細(xì)胞培育技術(shù)試驗(yàn)報(bào)告一、試驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)并把握動(dòng)物細(xì)胞培育的無菌操作技術(shù)。2、學(xué)習(xí)并把握細(xì)胞傳代培育的方法。3、學(xué)習(xí)并把握用倒置熒光顯微鏡觀看細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)。二、試驗(yàn)原理細(xì)胞培育〔cellculture〕：細(xì)胞在體外條件下生長(zhǎng)，細(xì)胞不再形成組織。動(dòng)物細(xì)胞培育〔animalcellculture〕就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞〔使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶〕然后，放在適宜的培育基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。由于細(xì)胞具有生長(zhǎng)和自我復(fù)制的力氣，為細(xì)胞體外培育和爭(zhēng)論供給可能。動(dòng)物細(xì)胞培育可分為原代培育和傳代培育。原代培育〔primaryculture〕即直接從動(dòng)物機(jī)體分別、獲得組織細(xì)胞，在無菌條件下，用胰蛋白酶消化或機(jī)械分散等方法，將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞開頭首次培育長(zhǎng)出單層細(xì)胞的方法。傳代培育〔subculture〕當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)增值到達(dá)確定密度，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化分散成單細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到的培育皿中擴(kuò)大培育的方法。高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要爭(zhēng)論單個(gè)細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)的功能活動(dòng)是格外困難的，但假設(shè)把或細(xì)胞拿到體外培育、增殖并進(jìn)展觀看和爭(zhēng)論，則便利簡(jiǎn)潔的多。被培育的動(dòng)物細(xì)胞是格外好的試驗(yàn)對(duì)象和試驗(yàn)爭(zhēng)論材料，對(duì)體外培育的活細(xì)胞進(jìn)展?fàn)幷摽梢詭椭祟愄骄糠乐胃鞣N疾病途徑和機(jī)制，也可以人為地誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)變細(xì)胞的遺傳性狀和特性，因此，動(dòng)物細(xì)胞體外培育技術(shù)是爭(zhēng)論細(xì)胞分子機(jī)制格外重要的試驗(yàn)手段，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、基因工程等爭(zhēng)論領(lǐng)域。三、細(xì)胞培育相關(guān)設(shè)施及材料1、細(xì)胞培育室無菌操作區(qū)：只限于細(xì)胞培育及其它無菌操作，與外界隔離。。制備區(qū)：培育液及有關(guān)培育用液體的制備，液體制備后應(yīng)當(dāng)在凈化工作臺(tái)進(jìn)展過濾除菌。貯存區(qū)：包括冰箱、枯燥箱、液氮罐等。清洗區(qū)和消毒滅菌區(qū)：清洗區(qū)為相對(duì)污染區(qū)，消毒滅菌區(qū)與清洗區(qū)分開。2、細(xì)胞培育常用根本設(shè)施：熒光顯微鏡、超凈工作臺(tái)、孵箱、電熱鼓風(fēng)枯燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒溫水浴槽、濾器等。細(xì)胞培育常用器皿：培育瓶、培育板、培育皿，玻璃瓶、吸管，離心管、凍存管，注射器，燒杯、量筒等。3、細(xì)胞培育用品的清洗、消毒玻璃器皿要用5%稀鹽酸浸泡，以中和其外表堿性物質(zhì)：刷洗：硫酸清潔液浸泡：濃硫酸+重鉻酸鉀+蒸餾水；15-2031-3全部需滅菌的器械、物品滅菌前均需包裝，防止滅菌后污染。使用時(shí)放入超凈工作臺(tái)后翻開包裝。消毒滅菌：高壓蒸汽滅菌〔120℃，20min〕；紫外線消毒：主要用于試驗(yàn)室房間空氣及操作臺(tái)。四、細(xì)胞培育用液及培育基1、培育用液：水〔高度純潔〕；緩沖液：平衡鹽溶液，維持滲透壓，調(diào)整PH值，供給細(xì)胞生存所需能量和無機(jī)離子成分；消化液：胰蛋白酶液，EDTA，膠原酶等。2、培育基：維持體外細(xì)胞培育生存和生長(zhǎng)的溶液。自然培育基：血清〔胎牛血清、小牛血清、馬血清、兔血清、人血清等〕、血漿和組織提取液〔如雞胚和牛胚浸液〕水解乳蛋白；TC199BME、MEM五、動(dòng)物細(xì)胞培育的條件無菌、無毒的環(huán)境：對(duì)培育液和全部培育用具進(jìn)展無菌處理，通常還要在培育液中加入確定量的的抗生素，以防被污染。此外應(yīng)定期更換培育液，以便去除代謝產(chǎn)物防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物累積對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生危害。養(yǎng)分物質(zhì)：無機(jī)物〔無機(jī)鹽、微量元素等，有機(jī)物〔糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因等〕清和血漿，但血清和血漿不是養(yǎng)分物質(zhì)?！?〕PH：36.5±0.5℃，7.2-7.4。所需要的特別條件：血清：動(dòng)物細(xì)胞離體培育常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清供給生長(zhǎng)必需因激素、根底培育基中沒有或量很少的養(yǎng)分物以及主要的低分子養(yǎng)分物等；供給結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)整轉(zhuǎn)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力；有些狀況下其結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用；生牛血清是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料、玻璃等培育基質(zhì)上所需因子的來源；構(gòu)成緩沖系統(tǒng)，調(diào)整酸堿平衡；供給蛋白酶抑制劑，在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受損害；支持物氣體交換：二氧化碳和氧氣的比例要在細(xì)胞培育過程中不斷進(jìn)展調(diào)整，不斷維持所需CO2混合氣體5%CO2PH定。六、試驗(yàn)內(nèi)容1、用倒置熒光顯微鏡觀看細(xì)胞形態(tài)2、動(dòng)物細(xì)胞傳代80%-90%時(shí)要傳代；預(yù)備好所需材料，先將手及超凈工作臺(tái)用酒精消毒，點(diǎn)燃酒精燈，將滴管用火焰燒，PBS、培育基、胰酶預(yù)備好，要避開滴管穿插污染；將培育基噴酒精消毒，拿入超凈工作臺(tái)，用滴管把原有培育基吸掉；PBS〔PBS，不要用勁吹，細(xì)胞貼壁不好，然后吸出S；參與適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌浮彩钩蓡渭?xì)胞懸液30s，可快速在熒光顯微鏡下觀看細(xì)胞形態(tài)，吸出胰酶；參與含有血清的培育基終止胰酶消化，用滴管吹打細(xì)胞，讓細(xì)胞懸浮起來；依據(jù)細(xì)胞種類把細(xì)胞傳到幾個(gè)培育皿中，一般癌細(xì)胞分5個(gè)，正常細(xì)胞傳3個(gè)，放入孵箱連續(xù)培育；把超凈工作臺(tái)消毒整理干凈，將用過的滴管拿出超凈工作臺(tái)。七、試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析倒置熒光顯微鏡下HaCaT細(xì)胞形態(tài)倒置熒光顯微鏡下A375細(xì)胞形態(tài)代用胰酶消化時(shí)，先用胰酶潤(rùn)洗，吸出后，孵育5min。A375胰酶消化時(shí)，在倒置熒光顯微鏡下可觀看到細(xì)胞變圓變亮，不再貼壁，成為單細(xì)胞。八、試驗(yàn)留意事項(xiàng)1、試驗(yàn)進(jìn)展前，無菌室及無菌操作臺(tái)以紫外燈照耀30-60分鐘滅菌，以70%乙醇擦拭無菌操作臺(tái)面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開頭試驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培育基一樣亦不共享培育基，以避開失誤混淆或細(xì)胞間污染。試驗(yàn)完畢后，將試驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%乙醇擦拭無菌操作臺(tái)面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)展下一個(gè)細(xì)胞株的操作。2、無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬闊，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等70%乙醇擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。試驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中心無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。試驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中心無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。3、留神取用無菌之試驗(yàn)物品，避開造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，不要在翻開的容器正上方操作試驗(yàn)。容器翻開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。4、試驗(yàn)人員應(yīng)留意自身之安全，須穿戴試驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)展試驗(yàn)。操作過程中留神毒性