新版大腸桿菌基因工程課件可編輯

7.基因工程應(yīng)用大腸桿菌基因工程酵母菌基因工程高等植物基因工程哺乳動(dòng)物基因工程新版大腸桿菌基因工程第1頁(yè)細(xì)菌與基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首次完成外源基因在大腸桿菌中表示，在試驗(yàn)室里實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)移，為基因工程開(kāi)啟了通向現(xiàn)實(shí)應(yīng)用大門(mén)。幾年后，第一個(gè)基因工程產(chǎn)品—利用構(gòu)建基因基因工程菌生產(chǎn)人胰島素取得成功，從此人類(lèi)進(jìn)入了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)時(shí)代。細(xì)菌不但在基因重組技術(shù)誕生和技術(shù)進(jìn)步中起到了舉足輕重作用，而且細(xì)菌遺傳改造也是基因工程中歷史最早、研究最廣泛、取得實(shí)際應(yīng)用結(jié)果最多領(lǐng)域。新版大腸桿菌基因工程第2頁(yè)7-1.大腸桿菌基因工程C大腸桿菌基因工程菌構(gòu)建策略B外源基因在大腸桿菌中高效表示原理A大腸桿菌作為表示外源基因受體菌特征E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素D基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策新版大腸桿菌基因工程第3頁(yè)一、大腸桿菌作為表示外源基因受體菌特征大腸桿菌表示外源基因優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架基因克隆表示系統(tǒng)成熟完善繁殖快速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國(guó)FDA同意為安全基因工程受體生物新版大腸桿菌基因工程第4頁(yè)大腸桿菌表示外源基因劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)復(fù)性功效缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多內(nèi)毒素新版大腸桿菌基因工程第5頁(yè)二、外源基因在大腸桿菌中高效表示原理開(kāi)啟子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)?？截悢?shù)新版大腸桿菌基因工程第6頁(yè)（一）開(kāi)啟子開(kāi)啟子最正確距離探測(cè)目標(biāo)基因EEA開(kāi)啟子A酶切開(kāi)Bal31酶解目標(biāo)基因EE新版大腸桿菌基因工程第7頁(yè)開(kāi)啟子篩選AprorigalKpKO1采取鳥(niǎo)槍法戰(zhàn)略，將適當(dāng)大小DNA片段克隆到開(kāi)啟子探針質(zhì)粒pKO1上；受體細(xì)胞染色體DNA上galE、galT與質(zhì)粒上匯報(bào)基因galk表示產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)。轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-大腸桿菌受體菌株含有外源開(kāi)啟子活性重組克隆新版大腸桿菌基因工程第8頁(yè)開(kāi)啟子構(gòu)建-35區(qū)序列-10區(qū)序列PLPrecAPtrpPlacPtraAPtac開(kāi)啟子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAAT新版大腸桿菌基因工程第9頁(yè)開(kāi)啟子可控性P乳糖開(kāi)啟子Plac可控性：OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基底水平表示；基底水平轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物能夠使開(kāi)啟子Plac介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄大幅提升。新版大腸桿菌基因工程第10頁(yè)P(yáng)lacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP結(jié)合開(kāi)啟子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄?；姿睫D(zhuǎn)錄葡萄糖代謝使cAMP降低，也能阻遏Plac介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用乳糖開(kāi)啟子均為抗葡萄糖代謝阻遏突變型，即PlacUV5。CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄PlacO乳糖開(kāi)啟子Plac可控性：新版大腸桿菌基因工程第11頁(yè)色氨酸開(kāi)啟子Ptrp可控性：除去色氨酸色氨酸開(kāi)啟子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)；在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用?；姿睫D(zhuǎn)錄在正常細(xì)菌培養(yǎng)體系中,除去色氨酸是困難，所以基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)目基因表示。色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉(zhuǎn)錄PtrpOtrp阻遏蛋白

（IAA）OtrpPtrp高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp新版大腸桿菌基因工程第12頁(yè)l噬菌體開(kāi)啟子PlL可控性：噬菌體開(kāi)啟子PL受CI阻遏蛋白阻遏，極難直接誘導(dǎo)控制。在基因工程中常使用溫度敏感型cI突變基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃時(shí)失活脫落，PL便可介導(dǎo)目標(biāo)基因表示.PtrpAcI857BPL目標(biāo)基因阻遏作用BPLPtrpA表示色氨酸但在大型細(xì)菌培養(yǎng)罐中快速升溫非常困難，所以常使用一個(gè)雙質(zhì)?？刂葡到y(tǒng)，用色氨酸間接控制目標(biāo)基因表示。新版大腸桿菌基因工程第13頁(yè)（二）終止子1.強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止必要性外源基因在強(qiáng)開(kāi)啟子控制下表示，輕易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近DNA序列，形成長(zhǎng)短不一mRNA混合物；過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因表示。新版大腸桿菌基因工程第14頁(yè)假如外源基因下游緊接有載體上其它主要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)識(shí)基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒復(fù)制及其它生物功效，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需時(shí)間就對(duì)應(yīng)增加，外源基因本身轉(zhuǎn)錄效率下降；過(guò)長(zhǎng)mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂能量消耗；更為嚴(yán)重是，過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物翻譯效率。新版大腸桿菌基因工程第15頁(yè)2.強(qiáng)終止子選擇與使用當(dāng)前外源基因表示質(zhì)粒中慣用終止子是來(lái)自大腸桿菌rRNA操縱子上rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上Tf；pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs轉(zhuǎn)化子對(duì)于一些終止作用較弱終止子，通常能夠采取二聚體終止子串聯(lián)特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用；終止子也能夠象開(kāi)啟子那樣，從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選。終止子序列新版大腸桿菌基因工程第16頁(yè)（三）核糖體結(jié)合位點(diǎn)

外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中高效表示不但取決于轉(zhuǎn)錄開(kāi)啟頻率，而且在很大程度上還與mRNA翻譯起始效率親密相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不一樣mRNA分子含有不一樣翻譯效率，它們之間差異有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯起始效率主要由其5‘端結(jié)構(gòu)序列所決定，稱(chēng)為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）新版大腸桿菌基因工程第17頁(yè)四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：1.核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)Shine-Dalgarno（SD）序列：位于翻譯起始密碼子上游6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，它經(jīng)過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專(zhuān)一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而開(kāi)啟翻譯；翻譯起始密碼子：大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架起始位點(diǎn),但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；SD序列與翻譯起始密碼子之間距離及堿基組成?；蚓幋a區(qū)5’端若干密碼子堿基序列。啟始密碼子后為GCAU或AAAA時(shí)，翻譯效率最高。

新版大腸桿菌基因工程第18頁(yè)2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表示影響

SD序列影響：

普通來(lái)說(shuō)，mRNA與核糖體結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16SrRNA堿基互補(bǔ)性，其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為主要。對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T，均會(huì)造成翻譯效率大幅度降低。新版大腸桿菌基因工程第19頁(yè)SD序列與起始密碼子之間序列影響：緊鄰AUG前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響，對(duì)于大腸桿菌b-半乳糖苷酶mRNA而言，在這個(gè)位置上最正確堿基組合是UAU或CUU，假如用UUC、UCA或AGG取代之，則酶表示水平低20倍。SD序列下游堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG翻譯效率則分別是最高值50%和25%。新版大腸桿菌基因工程第20頁(yè)SD序列與起始密碼子之間距離影響：SD序列與起始密碼子之間準(zhǔn)確距離確保了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG恰好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中P位，這是翻譯開(kāi)啟前提條件。在很多情況下,SD序列位于AUG之前大約7個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)造成翻譯起始效率不一樣程度降低。新版大腸桿菌基因工程第21頁(yè)起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子影響：大腸桿菌中起始tRNA分子能夠同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同,通常GUG為AUG50%而UUG只及AUG25%。除此之外，從AUG開(kāi)始前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)主要，最少這一序列不能與mRNA5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上準(zhǔn)確定位；當(dāng)前廣泛用于外源基因表示大腸桿菌表示型質(zhì)粒上，均含有與開(kāi)啟子起源相同核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳。新版大腸桿菌基因工程第22頁(yè)(四)密碼子1.生物體對(duì)密碼子偏愛(ài)性

不一樣生物，甚至同種生物不一樣蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，含有一定偏愛(ài)性。新版大腸桿菌基因工程第23頁(yè)生物基因組中堿基含量：在富含AT生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中,密碼子第三位上U和A出現(xiàn)頻率較高;而在GC豐富生物（如鏈霉菌）基因組中,第三位上含有G或C簡(jiǎn)并密碼子占90%以上絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。密碼子與反密碼子相互作用自由能：性中等強(qiáng)度規(guī)律細(xì)胞內(nèi)tRNA含量如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；偏愛(ài)密碼子決定原因：新版大腸桿菌基因工程第24頁(yè)2.密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表示影響因?yàn)樵松锖驼婧松锘蚪M中密碼子使用頻率含有較大程大差異性，因另外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯一個(gè)主要原因是密碼子正確選擇。普通而言，有兩種策略能夠使外源基因上密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中取得最正確表示：

外源基因全合成同時(shí)表示相關(guān)tRNA編碼基因新版大腸桿菌基因工程第25頁(yè)按照大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不宜對(duì)應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中高效表示均采取了這種方法。

外源基因全合成新版大腸桿菌基因工程第26頁(yè)對(duì)于那些含有不友好密碼子、種類(lèi)單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大外源基因而言，則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同時(shí)克隆表示策略較為有利。同時(shí)表示相關(guān)tRNA編碼基因新版大腸桿菌基因工程第27頁(yè)為了提升人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中高效表示，將大腸桿菌這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高效表示質(zhì)粒上。由此構(gòu)建大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表示制約作用。比如，在人尿激酶原cDNA412個(gè)密碼子中，共含有22個(gè)精氨酸密碼子，其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA，而大腸桿菌受體細(xì)胞中tRNAAGG和tRNAAGA豐度較低。新版大腸桿菌基因工程第28頁(yè)（五）質(zhì)?？截悢?shù)1.質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝影響當(dāng)前試驗(yàn)室里廣泛使用表示型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛階段。質(zhì)粒分子過(guò)分增殖以及其后目標(biāo)基因高效表示勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而造成重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性以及目標(biāo)基因宏觀表示水平下降。新版大腸桿菌基因工程第29頁(yè)2.質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序控制在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞質(zhì)粒拷貝數(shù)為60oripCP3PLMCSApr在42℃時(shí)，拷貝數(shù)快速增至300-600在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上CI基因表示溫度敏感型阻遏蛋白失活。所以，用一個(gè)伎倆同時(shí)控制質(zhì)粒拷貝數(shù)和基因表示pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型復(fù)制子新版大腸桿菌基因工程第30頁(yè)三、大腸桿菌基因工程菌構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白表示分泌型異源蛋白表示融合型異源蛋白表示寡聚型異源蛋白表示整合型異源蛋白表示蛋白酶抗性或缺點(diǎn)型表示系統(tǒng)構(gòu)建新版大腸桿菌基因工程第31頁(yè)（一）包涵體型異源蛋白表示1.包涵體及其性質(zhì)包涵體(InclusionBodies，IB)：在一些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露水不溶性結(jié)構(gòu)。新版大腸桿菌基因工程第32頁(yè)富含蛋白質(zhì)包涵體多見(jiàn)于生長(zhǎng)在含有氨基酸類(lèi)似物培養(yǎng)基大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類(lèi)似物所合成蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特征和生物功效，從而集聚形成包涵體。由高效表示質(zhì)粒構(gòu)建大腸桿菌工程菌大量合成非天然性同源或異源蛋白質(zhì)，后者在普通情況下也以包涵體形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少許DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。新版大腸桿菌基因工程第33頁(yè)2.以包涵體形式表示目標(biāo)蛋白優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表示形式優(yōu)點(diǎn)：包涵體水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成份，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接經(jīng)過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)。在形成包涵體之后，大腸桿菌蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅。能簡(jiǎn)化外源基因表示產(chǎn)物分離操作

能在一定程度上保持表示產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定新版大腸桿菌基因工程第34頁(yè)包涵體表示形式缺點(diǎn)：以包涵體形式表示重組蛋白喪失了原有生物活性，必須經(jīng)過(guò)有效變性復(fù)性操作，才能回收得到含有正確空間構(gòu)象（因而含有生物活性）目標(biāo)蛋白，所以包涵體變復(fù)性操作效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物收率至關(guān)主要。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題,尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)成功率相當(dāng)?shù)?，普通不超?0%。新版大腸桿菌基因工程第35頁(yè)3.以包涵體形式表示目標(biāo)蛋白操作假如未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)(如分泌型表示或融合型表示),外源基因在大腸桿菌中表示蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表示產(chǎn)物普通傾向于形成包涵體。所以，以包涵體形式表示目標(biāo)基因操作關(guān)鍵就是選擇高表示載體。實(shí)際上，這種高表示率也是包涵體法長(zhǎng)處所在。新版大腸桿菌基因工程第36頁(yè)4.包涵體變性與復(fù)性操作C

共價(jià)修飾蛋白質(zhì)1）蛋白質(zhì)變性復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAgAgAgAgI

有效變復(fù)性過(guò)程中中間狀態(tài)X

脫離有效變復(fù)性過(guò)程而進(jìn)入集聚中間狀態(tài)N

天然狀態(tài)蛋白質(zhì)U

變性狀態(tài)蛋白質(zhì)A集聚狀態(tài)蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價(jià)修飾蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過(guò)程，所以永遠(yuǎn)成為無(wú)活性蛋白質(zhì)。包涵體中蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，所以需要在體外進(jìn)行人工變性（解除共價(jià)修飾和驅(qū)散集聚體）復(fù)性操作。新版大腸桿菌基因工程第37頁(yè)2）包涵體溶解與變性：包涵體溶解與變性主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配二硫鍵和次級(jí)鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性路徑中。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性試劑和條件包含：清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化促溶劑

鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素廉價(jià)，但常被自發(fā)形成氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中氨基反應(yīng)混合溶劑

如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH

廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)新版大腸桿菌基因工程第38頁(yè)5.包涵體復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體復(fù)性與重折疊主要任務(wù)是：將多肽鏈中被拆開(kāi)游離巰基重新折疊經(jīng)過(guò)次級(jí)鍵形成使蛋白質(zhì)復(fù)性新版大腸桿菌基因工程第39頁(yè)包涵體復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作1)包涵體復(fù)性操作方法包含：一步稀釋法：蛋白復(fù)性與濃度無(wú)關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大分段稀釋法：逐步降低變性劑濃度，預(yù)防二次集聚發(fā)生試劑添加法：精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法：氨基檸檬酸酐?；鞍讕ж?fù)電，抑制集聚產(chǎn)物隔離法：將變性蛋白分子固定化，防止其相互碰撞分子伴侶法：GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表示新版大腸桿菌基因工程第40頁(yè)包涵體復(fù)性與重折疊(refolding)：二硫鍵形成在包涵體變性體系中，一直存在著還原劑，使多肽鏈中巰基保持還原狀態(tài)，防止二硫鍵錯(cuò)配造成嚴(yán)重集聚。在變性操作結(jié)束后，這些游離型巰基必須重新配對(duì)形成二硫鍵，此時(shí)多肽鏈也重新發(fā)生折疊。新版大腸桿菌基因工程第41頁(yè)化學(xué)氧化法（A）需要電子受體，最廉價(jià)電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機(jī)，僅適合用于那些不含游離半胱氨酸殘基蛋白質(zhì)重折疊。二硫鍵交換（B）需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對(duì)特異，所以適用性較廣，重折疊效果好。形成二硫鍵方式主要有：HSHS

S

S2e+2H+AHSHS

S-S-R

HS+BR-S-S-R

SS2R-SH新版大腸桿菌基因工程第42頁(yè)（二）分泌型異源蛋白表示即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者經(jīng)過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列存在是蛋白質(zhì)分泌前提條件。在大腸桿菌中表示異源蛋白按其在細(xì)胞中定位可分為兩種形式：新版大腸桿菌基因工程第43頁(yè)1.以分泌形式表示目標(biāo)蛋白優(yōu)缺點(diǎn)分泌表示形式優(yōu)點(diǎn)：目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性高

重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中10倍。目標(biāo)蛋白易于分離目標(biāo)蛋白末端完整

相當(dāng)多真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表示時(shí)，蛋白質(zhì)N端甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表示，其N(xiāo)端甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽剪切過(guò)程中被有效除去。新版大腸桿菌基因工程第44頁(yè)分泌表示形式缺點(diǎn)：外源真核生物基因極難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表示，少數(shù)外源基因既便能分泌表示，但其表示率通常要比包涵體方式低很多；相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌蛋白分泌機(jī)制并不健全；所以當(dāng)前用于產(chǎn)業(yè)化異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。新版大腸桿菌基因工程第45頁(yè)2.蛋白質(zhì)分泌機(jī)制所以與包涵體相比，分泌型重組蛋白含有較高百分比正確構(gòu)象，生物活性回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感。信號(hào)肽胞內(nèi)胞外目標(biāo)蛋白內(nèi)膜外膜周質(zhì)胞壁信號(hào)肽剪切酶系原核細(xì)菌周質(zhì)中含有各種分子伴侶可阻止分泌蛋白隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中重組蛋白極少形成份子間二硫鍵交聯(lián)；新版大腸桿菌基因工程第46頁(yè)3.分泌型目標(biāo)蛋白表示系統(tǒng)構(gòu)建包含大腸桿菌在內(nèi)絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中；這一過(guò)程嚴(yán)格依賴(lài)于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)膜上磷酸酯酶，造成細(xì)菌內(nèi)外膜通透性增大。新版大腸桿菌基因工程第47頁(yè)所以，只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)適當(dāng)質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型受體細(xì)胞。此時(shí)，用另一個(gè)攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列和目標(biāo)基因表示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞，并使用相同性質(zhì)開(kāi)啟子介導(dǎo)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，則可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白從重組大腸桿菌中完全分泌。新版大腸桿菌基因工程第48頁(yè)（三）融合型異源蛋白表示除了直接表示異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌本身蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開(kāi)放型閱讀框架進(jìn)行表示。由這種雜合基因表示出蛋白質(zhì)稱(chēng)為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。經(jīng)過(guò)在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，能夠在體外從純化融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。新版大腸桿菌基因工程第49頁(yè)1.以融合形式表示目標(biāo)蛋白優(yōu)缺點(diǎn)目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性高尤其對(duì)分子量較小多肽效果更佳目標(biāo)蛋白易于分離利用受體蛋白成熟抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，能夠快速取得純度較高融合蛋白目標(biāo)蛋白表示率高與受體蛋白共用一套完善表示元件目標(biāo)蛋白溶解性好因?yàn)槭荏w蛋白存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好空間構(gòu)象，且大多含有水溶性目標(biāo)蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和深入分離，才能獲目標(biāo)蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要成本往往就在該工段新版大腸桿菌基因工程第50頁(yè)2.融合型目標(biāo)蛋白表示系統(tǒng)構(gòu)建1）融合蛋白表示質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)：受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因能高效表示，且其表示產(chǎn)物能夠經(jīng)過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化；外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在一些情況下，并不需要完整受體結(jié)構(gòu)基因，目標(biāo)是盡可能防止融合蛋白分子中兩種組份分子量過(guò)于靠近，為目標(biāo)蛋白分離回收創(chuàng)造條件；兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處序列設(shè)計(jì)十分主要，它直接決定著融合蛋白裂解工藝；兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致翻譯閱讀框架。新版大腸桿菌基因工程第51頁(yè)2）用于融合蛋白構(gòu)建受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）

維持良好空間構(gòu)象麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）

促進(jìn)分泌硫氧化還原蛋白（TrxA）

維持良好空間構(gòu)象pTrxFus金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫親和層析pRIT2Tβ-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫親和層析外膜蛋白（OmpF）

促進(jìn)分泌泛素蛋白（Ubi）

維持良好空間構(gòu)象新版大腸桿菌基因工程第52頁(yè)3)目標(biāo)蛋白回收融合蛋白中受體蛋白部分存在可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白空間構(gòu)象和生物活性，假如將之注入人體還會(huì)造成免疫反應(yīng)，所以在制備和生產(chǎn)藥用目標(biāo)蛋白時(shí)，將融合蛋白中受體蛋白部分完整除去是必不可少工序。酶促裂解法

化學(xué)斷裂法

融合蛋白位點(diǎn)專(zhuān)一性斷裂方法有兩種：新版大腸桿菌基因工程第53頁(yè)用于蛋白位點(diǎn)專(zhuān)一性化學(xué)斷裂最正確試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中甲硫氨酸殘基側(cè)鏈硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段；

化學(xué)斷裂法：其中上游肽段甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端第一位氨基酸殘基保持不變。新版大腸桿菌基因工程第54頁(yè)這一方法優(yōu)點(diǎn)：然而，假如異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法!回收率高（可到達(dá)85%以上），專(zhuān)一性強(qiáng)，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中成熟表示產(chǎn)物較為靠近。新版大腸桿菌基因工程第55頁(yè)酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白酶酶促裂解法特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每種蛋白酶均含有對(duì)應(yīng)斷裂位點(diǎn)決定簇，所以可供選擇專(zhuān)一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾個(gè)斷裂位點(diǎn)專(zhuān)一性最強(qiáng)商品化蛋白酶分別在多肽鏈中精氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相同。新版大腸桿菌基因工程第56頁(yè)

用上述蛋白酶裂解融合蛋白前提條件：外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴(lài)氨酸殘基，假如外源基因表示產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量異源蛋白來(lái)說(shuō)，上述三種氨基酸殘基出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高。新版大腸桿菌基因工程第57頁(yè)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶假單孢菌蛋白酶豬胰蛋白酶ArgCNNC受體蛋白目標(biāo)蛋白Arg-CGlu-CLys-CArg-CLys-C新版大腸桿菌基因工程第58頁(yè)酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)為了克服僅切單一氨基酸殘基蛋白酶所帶來(lái)應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）人工接頭片段，該寡肽為含有蛋白酶活性凝血因子X(jué)a識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在ArgC末端。新版大腸桿菌基因工程第59頁(yè)因?yàn)閄a識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列概率極少，所以這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不一樣大小目標(biāo)蛋白產(chǎn)物。純化后融合蛋白用Xa處理，即可取得不含上述寡肽序列目標(biāo)蛋白。新版大腸桿菌基因工程第60頁(yè)酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)開(kāi)啟子受體基因接頭目標(biāo)基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgGluArgLysIle-Glu-gly-Arg表示親和層析酶解回收新版大腸桿菌基因工程第61頁(yè)P(yáng)inpointXatac生物素結(jié)合肽編碼序列Xa因子識(shí)別位點(diǎn)編碼序列SP6T7AproriMCSATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArg

GluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位點(diǎn)酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)新版大腸桿菌基因工程第62頁(yè)（四）寡聚型異源蛋白表示從理論上講，外源基因表示水平與受體細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄基因拷貝數(shù)（即基因劑量）呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標(biāo)識(shí)抗生素抗性基因等。伴隨重組質(zhì)?？截悢?shù)不停增加，受體細(xì)胞內(nèi)大部分能量和原料被用于合成全部重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝卻因能量不濟(jì)受到影響，所以經(jīng)過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù)提升外源基因表示產(chǎn)物產(chǎn)量往往不能取得滿意效果。新版大腸桿菌基因工程第63頁(yè)另一個(gè)經(jīng)過(guò)增加外源基因劑量而提升目標(biāo)蛋白產(chǎn)量有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表示載體，即將多拷貝外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表示策略。新版大腸桿菌基因工程第64頁(yè)1.以寡聚形式表示目標(biāo)蛋白優(yōu)缺點(diǎn)目標(biāo)蛋白高效表示在不提升質(zhì)?？截悢?shù)前提下，增加目標(biāo)基因拷貝數(shù)，能夠在一定程度上改進(jìn)表示量；穩(wěn)定表示小分子短肽目標(biāo)產(chǎn)物回收困難短肽因?yàn)槿狈τ行Э臻g結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中半衰期較短。串聯(lián)短肽含有與蛋白質(zhì)相同長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解能力大幅度提升；寡聚短肽需要裂解和深入分離，才能獲最終分子，但裂解后短肽分子輕易出現(xiàn)序列不均一性。新版大腸桿菌基因工程第65頁(yè)2.寡聚型目標(biāo)蛋白表示系統(tǒng)構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略：新版大腸桿菌基因工程第66頁(yè)構(gòu)建舉例：PSDT1T2EcoRIBamHIAATTCAGATCTGTCTAGAGCCTAGEcoRIBgl

IIBamHIEcoRIBamHIBgl

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+BamHIBgl

II+

BamHIBamHI新版大腸桿菌基因工程第67頁(yè)(五)整合型異源蛋白表示1.以整合形式表示目標(biāo)蛋白優(yōu)缺點(diǎn)目標(biāo)基因穩(wěn)定表示整合型目標(biāo)基因隨受體細(xì)胞染色體DNA復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下能夠連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目標(biāo)基因表示盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目標(biāo)基因工程案例尤其有意義。目標(biāo)基因表示率低單拷貝整合目標(biāo)基因表示率受到限制，此時(shí)可經(jīng)過(guò)強(qiáng)化表示元件而加以賠償。新版大腸桿菌基因工程第68頁(yè)2.DNA體內(nèi)重組基本原理細(xì)胞內(nèi)遺傳重組可分為兩大類(lèi)：

轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型同源序列依賴(lài)型在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA遺傳重組機(jī)制，其可能生物學(xué)功效是促進(jìn)生物種群進(jìn)化。新版大腸桿菌基因工程第69頁(yè)

轉(zhuǎn)位因子是指生物細(xì)胞內(nèi)天然存在一類(lèi)無(wú)復(fù)制能力DNA可移動(dòng)因子，不一樣生物種群擁有結(jié)構(gòu)不一樣轉(zhuǎn)位因子，比如：

1）轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族噬菌體 G片段（G-Fragment）原核細(xì)菌 插入次序（IS）真核細(xì)菌 轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty）高等植物可移動(dòng)因子（Ac、Ds）高等動(dòng)物 跳躍基因（mobilgene）新版大腸桿菌基因工程第70頁(yè)IS（1kb）Ty（5

kb）Tn（2

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20kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識(shí)別位點(diǎn)阻遏基因IRIRIRIRISIS轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子結(jié)構(gòu)新版大腸桿菌基因工程第71頁(yè)轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型體內(nèi)重組：整合形式新版大腸桿菌基因工程第72頁(yè)在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA鏈上兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生同源重組，其頻率與細(xì)菌種類(lèi)、兩個(gè)同源區(qū)之間距離同源區(qū)長(zhǎng)度、同源程度親密相關(guān)。2)同源序列依賴(lài)型體內(nèi)重組：基本形式普通地說(shuō)，距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高，重組頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn)，而后者包括兩個(gè)斷裂位點(diǎn)。新版大腸桿菌基因工程第73頁(yè)同源序列依賴(lài)型體內(nèi)重組：同源整合ori目標(biāo)基因同源區(qū)域標(biāo)識(shí)基因整合位點(diǎn)染色體DNA新版大腸桿菌基因工程第74頁(yè)同源序列依賴(lài)型體內(nèi)重組：同源交換ori目標(biāo)基因同源區(qū)域標(biāo)識(shí)基因交換區(qū)域染色體DNAori標(biāo)識(shí)基因+新版大腸桿菌基因工程第75頁(yè)（六）蛋白酶抗性或缺點(diǎn)型表示系統(tǒng)構(gòu)建不論是在真核生物還是在原核細(xì)胞中，重組目標(biāo)蛋白表達(dá)后都見(jiàn)面臨被降解命運(yùn)，其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短受體細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)。在大多數(shù)情況下，重組目標(biāo)蛋白不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)敏感性。然而越來(lái)越多試驗(yàn)表明，重組目標(biāo)蛋白在受體細(xì)胞內(nèi)半衰期能夠經(jīng)過(guò)蛋白序列人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞改造加以調(diào)整和控制。新版大腸桿菌基因工程第76頁(yè)試驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)不穩(wěn)定重組目標(biāo)蛋白是被大腸桿菌中蛋白酶La和Ti降解，二者分別由lon和clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴(lài)于ATP。1.蛋白酶缺點(diǎn)型受體細(xì)胞改造1）lon基因缺點(diǎn)大腸桿菌受體(lon-)：lon基因由熱休克等環(huán)境壓力激活，細(xì)胞內(nèi)異常蛋白或重組異源蛋白過(guò)量表示也可作為一個(gè)環(huán)境壓力誘導(dǎo)lon基因表示。lon-大腸桿菌突變株可使原來(lái)半衰期較短細(xì)菌調(diào)控蛋白(如SulA、RscA、lN）穩(wěn)定性大增，所以被廣泛用作外源基因高效表示受體菌。新版大腸桿菌基因工程第77頁(yè)熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及環(huán)境壓力特異性s因子編碼基因htpR突變株均展現(xiàn)出對(duì)異源蛋白降解作用嚴(yán)重缺點(diǎn)；htpR基因缺點(diǎn)大腸桿菌受體（htpR-）：大腸桿菌中龐大熱休克蛋白家族對(duì)異?；虍愒吹鞍捉到庖灿兄饕饔茫錂C(jī)理是脅迫異?；虍愒吹鞍仔纬梢环N對(duì)蛋白酶識(shí)別和降解較有利空間構(gòu)象，從而提升異?；虍愒吹鞍讓?duì)蛋白酶敏感性；尤其是lon-htpR-雙缺點(diǎn)株，非常適合高效表示各種不穩(wěn)定重組異源蛋白。新版大腸桿菌基因工程第78頁(yè)大量試驗(yàn)結(jié)果表明，在所有極性氨基酸中，天冬氨酸（Asp）存在對(duì)提升蛋白質(zhì)穩(wěn)定性效應(yīng)最顯著，而且Asp殘基離C末端越近，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性就越大。2.抗蛋白酶重組異源蛋白序列設(shè)計(jì)1)多肽鏈C末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性影響：更為主要是，在各種結(jié)構(gòu)和功效相互獨(dú)立蛋白質(zhì)C末端引入Asp殘基，都能顯著地延長(zhǎng)這些蛋白質(zhì)半衰期，因此含有普遍意義。新版大腸桿菌基因工程第79頁(yè)大量試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，假如多肽鏈N末端序列中含有較高百分比Ala、Asn、Cys、Gln、His，則蛋白質(zhì)穩(wěn)定性顯著改進(jìn)。2)多肽鏈N末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性影響：相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細(xì)胞中半衰期通常很短,尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞內(nèi)蛋白酶超敏感區(qū)。新版大腸桿菌基因工程第80頁(yè)四、基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)與機(jī)制改進(jìn)基因工程菌不穩(wěn)定性策略新版大腸桿菌基因工程第81頁(yè)1)工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)形式基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性含有兩種表現(xiàn)形式：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，造成其表觀生物學(xué)功效喪失整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性分配不穩(wěn)定性1.基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)與機(jī)制新版大腸桿菌基因工程第82頁(yè)2)工程菌遺傳不穩(wěn)定性產(chǎn)生機(jī)制能量、物質(zhì)匱乏和外源基因表示產(chǎn)物毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成路徑，開(kāi)啟降解程序。受體細(xì)胞中限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子降解外源基因高效表示嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝這是重組質(zhì)粒逃逸基本原因重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配受體細(xì)胞中內(nèi)源性轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子缺失重排新版大腸桿菌基因工程第83頁(yè)3)重組質(zhì)粒逃逸率當(dāng)含有重組質(zhì)粒工程菌在非選擇性條件下生長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱(chēng)為稱(chēng)為重組質(zhì)粒宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸原因有：高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥品（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏；受體細(xì)胞中核酸酶降解重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，細(xì)胞所含重組質(zhì)?？截悢?shù)差異伴隨細(xì)胞分裂次數(shù)增多而加劇。新版大腸桿菌基因工程第84頁(yè)2.改進(jìn)基因工程菌不穩(wěn)定性策略1)改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目標(biāo)構(gòu)建方法包含：將R1質(zhì)粒上parB基因引入表示型載體中，其表示產(chǎn)物可以選擇性地殺死因?yàn)榉峙洳痪鶆蛩a(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞；正確設(shè)置載體上多克隆位點(diǎn)，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細(xì)胞致死性基因安裝在載體上，同時(shí)構(gòu)建條件致死性對(duì)應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）。新版大腸桿菌基因工程第85頁(yè)2）施加選擇壓力依據(jù)載體上抗藥性標(biāo)識(shí)，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加對(duì)應(yīng)抗生素藥品和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素依據(jù)載體上營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型標(biāo)識(shí)，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加對(duì)應(yīng)營(yíng)養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高新版大腸桿菌基因工程第86頁(yè)3）控制目標(biāo)基因過(guò)量表示使用可控型開(kāi)啟子控制目標(biāo)基因定時(shí)表示及表示程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒定時(shí)增殖或降低質(zhì)?？截悢?shù)4）優(yōu)化基因工程菌培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒穩(wěn)定新版大腸桿菌基因工程第87頁(yè)六、利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素結(jié)構(gòu)及其生物合成人胰島素生產(chǎn)方法重組人胰島素大腸桿菌工程菌構(gòu)建新版大腸桿菌基因工程第88頁(yè)(一)胰島素結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)特異性肽酶NC信號(hào)肽B肽C肽A肽信號(hào)肽酶新版大腸桿菌基因工程第89頁(yè)（二）人胰島素生產(chǎn)方法1.直接提取法制人胰島素早期人胰島素是從人胰臟中直接分離純化，因?yàn)樵瞎┙o限制，其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增多糖尿病人臨床需求。新版