《膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)化動物模型》征求意見稿

本文件規(guī)定了膿毒癥（sepsis）動物模型制備原則、麻醉操作要求、制備方法、模型評價等技術(shù)要求。本文件適用于膿毒癥嚙齒類動物模型的制備和評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過本文件的規(guī)范性引用而成為本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求T/CALAS3實(shí)驗(yàn)動物健康監(jiān)測總則3術(shù)語和定義下列術(shù)語及定義適用于本文件。膿毒癥動物模型sepsisanimalmodel通過對動物進(jìn)行內(nèi)源性或外源性感染，使其能夠模擬膿毒癥的臨床表現(xiàn)、發(fā)病過程、病理生理學(xué)變化、免疫學(xué)反應(yīng)等特征的疾病動物。4制備原則4.1疾病再現(xiàn)最大化制備膿毒癥動物模型時，最大程度的模擬人類膿毒癥疾病臨床表現(xiàn)、疾病過程、病理生理學(xué)變化、免疫學(xué)反應(yīng)等疾病特征。4.2模型制備規(guī)范化膿毒癥動物模型制備涉及動物品系、實(shí)驗(yàn)條件、操作程序、標(biāo)本處理、數(shù)據(jù)采集、檢測指標(biāo)和結(jié)果分析等，模型重復(fù)性好，檢測指標(biāo)穩(wěn)定，利于客觀、真實(shí)的應(yīng)用。4.3生物安全防護(hù)膿毒癥動物模型制備在動物三級生物安全實(shí)驗(yàn)室按照GB19489-2008的要求進(jìn)行。5麻醉操作要求5.1操作程序5.1.1實(shí)驗(yàn)動物麻醉前宜禁食8h-12h。5.1.2實(shí)驗(yàn)動物麻醉按表1所示方法進(jìn)行。2表1實(shí)驗(yàn)動物麻醉方法動物種類麻醉劑選擇麻醉劑量/（mg/kg）麻醉方式嚙齒類動物小鼠三溴乙醇125-250腹腔注射戊巴比妥鈉30-90腹腔注射大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射5.1.3麻醉后護(hù)理a）麻醉中可使用加熱燈或加熱毯等維持動物體溫；b）麻醉中持續(xù)觀察動物呼吸、體溫等指標(biāo)監(jiān)測動物身體狀態(tài)。5.2其他要求5.2.1麻醉不足時，需補(bǔ)充麻醉劑量，以動物沒有肌張反射為準(zhǔn)。5.2.2麻醉過度時，應(yīng)立即對動物采取急救措施，如心臟按壓等。6制備方法根據(jù)感染來源不同，可分為內(nèi)源性及外源性感染模型。6.1內(nèi)源性感染模型——盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）6.1.1在腹部中線位置用手術(shù)刀切開皮膚，長約1-2cm，避免損傷下面的肌肉層和內(nèi)臟。6.1.2用生理鹽水濕潤的紗布輕輕擦拭暴露的腹腔，以保持濕潤并避免組織干燥。6.1.3仔細(xì)找到盲腸，通常位于右下腹。輕輕拉出盲腸，放置于無菌墊上以便操作。6.1.4選擇適當(dāng)?shù)奈恢迷诿つc上進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎位置通常在盲腸與回腸連接的三分之一或二分之一處。結(jié)扎的緊密度和位置會影響模型的嚴(yán)重程度和復(fù)制性。6.1.5使用無菌手術(shù)針在結(jié)扎下方的盲腸上進(jìn)行穿刺，穿刺次數(shù)和針的大小會影響病理結(jié)果。（小鼠推薦使用21號針頭；大鼠推薦使用18號針頭）。6.1.6將盲腸放回腹腔內(nèi)，在確保沒有過多的盲腸內(nèi)容物外溢的情況下閉合腹壁。6.1.7用吸收性或非吸收性縫合線閉合肌肉層和皮膚。6.1.8術(shù)后立即給予動物適當(dāng)?shù)逆?zhèn)痛藥物，以及適量的溫生理鹽水（37°C；每100克體重5毫升）補(bǔ)液支持。6.2外源性感染模型6.2.1外源性毒血癥模型通過靜脈、腹腔等不同途徑向動物體內(nèi)輸注脂多糖（LPS），根據(jù)劑量和方法不同，分為小劑量一次性輸注（單次腹腔注射LPS1-10mg/kg）、小劑量持續(xù)輸注（靜脈緩慢輸注LPS0.1-4ug/(kg·min)）和大劑量一次性輸注（單次腹腔注射LPS50mg/kg）。6.2.2外源性菌血癥模型不同細(xì)菌誘導(dǎo)膿毒癥模型所用濃度不同，推薦濃度：銅綠假單胞菌為4×108CFU/ml，金黃色葡萄球菌懸液為3×108CFU/ml。大腸桿菌經(jīng)為1.0×109CFU/kg，推薦注射量為300μL。7模型評價37.1一般癥狀觀察膿毒癥術(shù)后從動物外觀、自主意識、自主活動、對刺激的反應(yīng)、眼睛、呼吸頻率和呼吸質(zhì)量這七個方面（表1）觀察并記錄動物出現(xiàn)的癥狀，根據(jù)動物出現(xiàn)癥狀的情況，判斷疾病發(fā)生的嚴(yán)重程度。即每項(xiàng)指標(biāo)評分≥1分可認(rèn)為造模成功。指標(biāo)分?jǐn)?shù)-描述外觀0—光澤1—部分毛發(fā)豎毛2—背部全部毛發(fā)豎毛3—蓬松，凌亂4—憔悴0—活躍1—活躍，不直立2—活動減少遲緩，仍然行走3—挑釁后才活動，行動震顫4—挑釁后仍靜止不動0—活動正常（攝食、飲水、攀爬、行走、打斗等）1—活動減少，只在籠底活動2—活動顯著減少，靜止，偶爾探索活動3—靜止不動4—靜止不動，顫抖對刺激的反應(yīng)0—迅速反應(yīng)1—對聲音無反應(yīng)或反應(yīng)慢，對觸碰反應(yīng)強(qiáng)烈（馬上逃離）2—對聲音無反應(yīng)，對觸碰反應(yīng)一般（走幾步）3—對聲音無反應(yīng)，對觸碰反應(yīng)弱（不移動）4—對聲音無反應(yīng)，對觸碰反應(yīng)幾乎無反應(yīng)，推倒后不能翻身0—全開1—沒有全開，可能有分泌2—半閉，可能有分泌3—沒有全閉，可能有分泌4—閉合或者顯著分泌物（渾濁）呼吸頻率0—正常1—輕微減少（肉眼無法計數(shù)）2—中度減少（肉眼勉強(qiáng)能計數(shù)）3—顯著減少（肉眼輕松計數(shù)，呼吸間隔0.5s）4—極度減少（呼吸間隔＞1s）呼吸質(zhì)量0—正常1—間斷性呼吸困難2—呼吸困難，不喘氣3—呼吸困難，間斷性喘氣4—喘氣7.2血生化檢測4測定炎癥指標(biāo)、肝功能、腎功能、心肌酶等指標(biāo)：白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、C-反應(yīng)蛋白、降鈣素原、白介素1β、腫瘤壞死因子、白介素6、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、直接膽紅素、總蛋白、白蛋白、總膽汁酸、膽堿酯酶、肌酐、尿酸、尿素、β2-微球蛋白、乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶MB型同工酶等。7.3組織病理學(xué)檢測7.3.1心臟：心肌肌纖維結(jié)構(gòu)排列疏松，帶狀空泡化，細(xì)胞核腫脹，間質(zhì)水腫、充血。7.3.2肝臟：肝有大量空泡脂肪樣變性，肝細(xì)胞腫脹并有炎性細(xì)胞浸潤。7.3.3肺：模型組肺間隔增厚，部分肺泡組織結(jié)構(gòu)被破壞，炎癥細(xì)