TSTIC 130021-2024 乳及乳制品中2-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS67.050CCSX00STIC團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/STIC130021—20242N-Determinationof2'-FucosyllactoseandLacto-N-neotetraoseinMilkandDairyproductsbyLiquidChromatography-Mass/MassSpectrometry2024-2-27發(fā)布 2024-2-27實(shí)施上海市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證協(xié)會(huì)??發(fā)布T/STIC130021T/STIC130021—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1原理 1試劑和材料 1儀器和設(shè)備 2測(cè)定步驟 2分析結(jié)果的表述 4精密度 4檢出限與定量限 4附錄A多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件 5附錄B2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖示例 6前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由上海市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證協(xié)會(huì)提出并歸口。本文件由上海市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證協(xié)會(huì)發(fā)布。（沈陽本文件主要起草人：李冰、趙玉然、劉天益、張慧萍、黃文強(qiáng)、錢文濤、李秋琴、呂寧、唐亞娟、李慧娟、王艷華、潘思奕、劉明、白國平。T/STIC130021T/STIC130021—2024PAGEPAGE1乳及乳制品中2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法范圍本文件規(guī)定了乳及乳制品中2′-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于液體調(diào)制乳、發(fā)酵乳以及以牛乳和羊乳為原料的嬰幼兒調(diào)制乳粉中2′-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量測(cè)定。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。原理試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。試劑乙腈（C2H3N），色譜純。5.1.275%乙醇（C2H6O）。甲酸銨（NH4HCO2），優(yōu)級(jí)純及以上。硼氫化鈉溶液（10g/L）：優(yōu)級(jí)純硼氫化鈉（NaBH4），稱取1.0g硼氫化鈉，加入80mL水，溶解后，用水定容至100mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。乙酸溶液（15mL/L）：優(yōu)級(jí)純乙酸，吸取1.5mL100mL。甲酸銨溶液（10mmoL/L）：稱取0.318g甲酸銨，用水溶解并定容到500mL中，混勻。5.1.72'-巖藻糖基乳糖（C18H32O15）：CAS41263-94-9，純度≥95質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。2'-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10mg/mL）：準(zhǔn)確稱取100mg2'-巖藻糖基乳糖（按照實(shí)際純度折算質(zhì)量），用水溶解稀釋并定容10mL。分裝后置于-18℃條件可儲(chǔ)存6個(gè)月。乳糖-N-新四糖標(biāo)準(zhǔn)品（C26H45NO21）CAS13007-32-4，純度≥95%予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。乳糖-N-（10100mg乳糖-N-（按照實(shí)際純度折算質(zhì)量），用水溶解稀釋并定容10mL。分裝后置于-18℃條件可儲(chǔ)存6個(gè)月。2'-巖藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取1mL2'-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和0.5mL乳糖-N-新四糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，并用水定容至刻度配制成2'-巖藻糖基乳糖濃度為1mg/mL、乳糖-N-新四糖濃度為0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液，置于-18℃條件可儲(chǔ)存6混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：可采用同類樣品類型的空白基質(zhì)溶液或水配制，2'-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液參考濃度1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL-N-新四糖標(biāo)準(zhǔn)工作液參考濃度0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL。材料離心管：2mL，15mL。10mL比色管。10mL容量瓶。微孔濾頭：有機(jī)相，0.22μm。儀器和設(shè)備液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）。色譜柱，ACQUITYBEHAmideColumn(1502.1mm,1.7μm,Waters)或性能相當(dāng)著。移液器，量程10μL-100μL和100μL-1000μL。6.4分析天平，感量0.0001g和0.001g。高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于12000r/min。渦旋混合器。測(cè)定步驟提取20.m0.00g,100m20.00，5.0g（m3，精確至0.001g）至可準(zhǔn)確定容的10mL比色管或容量瓶中，用75%乙醇定容至10mL，渦旋混勻，取1mL樣品溶液至2mL離心管，進(jìn)行低溫離心處理。將2mL離心管中樣品-20℃冷凍1h，4℃12000r/min離心15min沉淀蛋白及除脂肪，準(zhǔn)確吸取離心管中的上層清液100μL（低濃度樣品如小于30mg/100g至10mL30乙腈溶液定容至10mL，混勻，取1.5mL樣品12000r/min離心5min，得樣品清液備用。10mL比色管或容量瓶稱取均勻液體試樣1.0加入水4mL75%乙醇定容至10mL1mL樣品溶液至2mLmL離心管中樣品-20℃冷凍1h，4℃12000r/min離心15min確吸取離心管中的上層清液200低濃度樣品如小于30mg/100g至10mL比色管或容量瓶中，用30%乙腈溶液定容至10mL，混勻，取1.5mL樣品12000r/min離心5min，得樣品清液備用。還原取0.8mL樣品清液轉(zhuǎn)移至15mL500μLmin，期間每隔5min500μL30min，每隔5min旋渦振蕩一次，不再產(chǎn)生氣泡為止。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液也同步取0.8mL，與樣品同步進(jìn)行還原，且最終定容體積相同。最終處理液經(jīng)0.22μm微孔濾頭過濾至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)試上機(jī)。工作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備空白基質(zhì)溶液：取同類型不含2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的樣品做空白基質(zhì)，前處理過程同樣品，得空白基質(zhì)，用于標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。注：如檢測(cè)未強(qiáng)化樣品的本底含量值，標(biāo)準(zhǔn)工作液可選擇用水配制。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀參考條件液相色譜參考條件色譜柱：ACQUITYBEHAmideColumn(1502.1mm,1.7μm,Waters)或性能相當(dāng)著。流動(dòng)相：流動(dòng)相A為10mmol/L甲酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.3mL/min。進(jìn)樣體積：5μL。7.4.1.5柱溫：40℃。7.4.1.6梯度洗脫參考程序：見表1。表1 酰胺色譜柱梯度洗脫程序時(shí)間(min)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)01090315856.56040910909.51090質(zhì)譜參考條件離子源：ESI源。250℃。噴霧電壓：4.5kV。監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式。掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。實(shí)驗(yàn)中所用的氣體均為高純氮?dú)?。多反?yīng)監(jiān)測(cè)的母離子、子離子、碰撞電壓、錐孔電壓參見附錄A。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定定性測(cè)定表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）監(jiān)測(cè)時(shí)定量定性離子對(duì)相對(duì)豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度％＞5020～5010～20≤10允許的相對(duì)偏差％±20±25±30±50定量測(cè)定分析結(jié)果的表述試樣中2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量按公式（1）計(jì)算：?=?×?×?×10?1 ·································（1）?3式中：X—試樣中待測(cè)組分含量，單位為毫克每百克(mg/100g)；c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的待測(cè)試樣溶液中待測(cè)組分的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V—定容體積，單位為毫升（mL）；?—稀釋因子，液體試樣?為50，固體試樣?=100×?2；?1單位換算系數(shù)；m（。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。檢出限與定量限本方法對(duì)2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的檢出限為3mg/100g，定量限為10mg/100g。附 錄 A（資料性）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件表A.1多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件序號(hào)化合物母離子（m/z）（m/z）碰撞電壓錐孔電壓12'-巖藻糖基乳糖489.