PCR核酸擴增儀(部編)課件

分子生物學相關儀器檢驗學院李平法PCR基因擴增儀DNA測序儀

核酸雜交儀

中心法則轉錄翻譯逆轉錄復制DNARNA蛋白質

一、分子生物學核心內容前言生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產品法醫(yī)學檢測人類學研究……二、分子生物學的應用前言生物樣品DNA片段基因工程核酸雜交基因擴增基因測序表達調控……三、分子生物學的核心技術前言第二節(jié)PCR核酸擴增儀原理和應用內容提要PCR核酸擴增儀的工作原理

PCR技術的原理及發(fā)展PCR基因擴增儀的工作原理PCR擴增儀的分類與結構

定性PCR擴增儀實時熒光定量PCR擴增儀PCR儀的性能指標、操作規(guī)程及常見故障PCR擴增儀的應用內容提要PCR核酸擴增儀的工作原理

PCR技術的原理及發(fā)展PCR基因擴增儀的工作原理PCR擴增儀的分類與結構

定性PCR擴增儀實時熒光定量PCR擴增儀PCR儀的性能指標、操作規(guī)程及常見故障PCR擴增儀的應用聚合酶鏈反應

（PolymeraseChainReaction）利用DNA變性、復性和復制的原理，在一對寡聚核苷酸引物的引導下，依靠DNA聚合酶的作用，通過變性-退火-延伸多次循環(huán)，將一段特異DNA片段高度擴增的技術。一、PCR技術的原理（一）DNA的結構與復制（二）PCR技術PCR(Polymerasechainreaction)：用一對寡聚核苷酸為引物，通過變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴增。這種擴增產物是以指數形式積累的，經25－30個循環(huán)后，擴增倍數可達106。

Dr.KarryMullis1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學獎。

PCR只是一個簡單的不起眼玩藝

——凱利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實驗系統(tǒng)，變成了一項成熟的技術，后者又上升成為新的概念?！?/p>

它最大的特點就是能不斷推出新形式。

——

摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]

雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補單鏈DNA

（變性）↓與一對寡核苷酸引物（5’，3’）降低溫度退火

DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結合，形象地稱為退火↓適溫延伸5’/3’引物形成新鏈變成4條鏈DNA（延伸）↓第二輪：變性—退火—延伸呈指數增長理論值：一輪一倍10輪103=1000倍,20輪106,30輪109

理論模板擴增30輪1ng-----------1g

實際模板擴增30輪1ng-----------10

g5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

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目錄Cycle35

5

5

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5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄（二）PCR的反應體系標準的PCR反應體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：

水生棲熱菌(thermusaquaticus,Taq)活性：有5’

3’DNA聚合酶活性；無3’

5’外切酶活性錯配率:35輪0.25%,與原始模板有關；最適溫度：72℃，選擇72℃延伸半衰期：92.5℃130min；95℃40min97.5℃5—6min

變性溫度：≤95℃，在整個擴增循環(huán)中保持足夠活性1.DNA聚合酶pfuDNA聚合酶耐熱5’

3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精確度：pfu>Taq

但pfu擴增效率通常比Taq酶略差文獻報道：Taq+pfu會起到較好效果

2.引物

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，

Tm值要相近，每條10-50pmol/100l

◆設計原則：（1）靠近5'上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同

3'下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補，與負鏈相同正鏈5'—————3'——上游Primer

——下游Primer負鏈3'—————5'

例如：

IL-3正鏈

5'GCTCCATGACCCAG-----------GCGATCTTTTGAGTCCAA3'

負鏈3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'

上游~：與其相同下游~：先寫出相應負鏈3'→5'然后倒過來5'→3'

所以負鏈Primer：5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'（2）Primer本身不要出現內部互補序列形成loop環(huán)，內部二級結構如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意減少Primer間互補序列導致2個Primer形成dimer

一般不要超過3個互補bp

如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC

修飾如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果

突變：

AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG3'

注意：絕不可以在3'端進行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補→不能延伸

（4）Primer5’未端可修飾、突變:

（5）primer5’端增加堿基

①內切酶識別點：

（G）GAATTC

GCTCCATGACCCAG

↑保護bp

對PCR產物cloning有很大好處便于內切酶消化，不同內切酶需保護bP數量不同

EcoRI1BglII2-3XbaI2-3HindⅢ>3BamHI2-3PstI>4XhoI>4NotI>10

如果所用保護bp數量不合適→影響內切酶消化→影響下步克隆∵未切開，連接不上

②ATG起始密碼③TAA、TAG、TGA終止密碼如：可溶性受體的表達，無膜內區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。

3.模板：

可選：DNAmRNA→逆轉錄→cDNADNA包括：質粒噬菌體染色體DNA

較小較大①目的gene是單拷貝變性較易變性較難②非常大，變性難模板用量

Plasmid:lngChromosome:300-500ng

注意：防止交叉污染4.dNTP：四種脫氧核苷酸，基本原料終濃度：50

M注意：不穩(wěn)定，保存時間長會失效

5.Mg2+TaqDNA聚合酶作用時需要Mg2+

不同的酶需不同Mg2+Taq：較少，Mg2+

對反應影響很大，0.5-1.5mM終濃度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍外界影響：

EDTA鰲合Mg2+∴選較低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團均可與Mg2+

結合，降低Mg2+

有效濃度?！嗳绻麛U增產物或效率不理想，要注意調整合適的

Mg2+濃度（1）變性溫度：94-95℃Templete：GC比例高、長度很長，則變性T↑

（2）退火：溫度越高，擴增特異性越好取決于Tm值：Tm↑退火T↑；

Tm↓退火T↓若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3）延伸：

500nt---1min500nt－－3min一般：40－60sec

6.溫度和時間：PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產物紫外光觀察3-4小時（四）PCR技術應用基本流程1.PCR技術的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA（1）目的基因的克?。?）基因的體外突變（3）DNA和RNA的微量分析（4）DNA序列測定（5）基因突變分析

2.PCR技術的應用二、PCR擴增儀的分類與結構PCR擴增儀的種類

普通PCR擴增儀

實時熒光定量PCR擴增儀

梯度PCR儀

原位PCR儀

根據變溫模式分類

水浴式PCR儀：由三個不同溫度的水浴槽和機械臂組成。變溫金屬塊式PCR儀：中心是由鋁塊或不銹鋼制成的熱槽，上有不同數目甚至不同規(guī)格的凹孔，用來放置樣品管。變溫氣流式PCR儀：由機殼、熱源、冷空氣泵、控制器及輔助元件等組成。（一）普通定性PCR擴增儀

由普通PCR儀衍生出的帶梯度PCR功能的基因擴增儀。每個孔的溫度可以在指定范圍內按照梯度設置，

根據結果，一步就可以摸索出最適反應條件。使用梯度PCR儀，多次實驗可在一臺儀器上完成，既節(jié)省實驗時間，提高實驗效率，又節(jié)約實驗成本。

（二）梯度PCR擴增儀由普通PCR儀衍生出的帶原位擴增功能的基因擴增儀。其樣品基座上有若干平行的鋁槽，每條鋁槽內可垂直放置一張載玻片，每張載玻片面均與鋁槽緊密接觸，溫度傳導極佳，控溫很精確。配有支持原位PCR模塊的PCR儀可以一機兩用，比較經濟。（三）原位PCR擴增儀實時熒光定量PCR儀

金屬板式實時定量PCR儀

離心式實時定量PCR儀

各孔獨立控溫的定量PCR儀（四）熒光定量PCR儀熒光實時定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技術在PCR反應體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號，從而實時監(jiān)測整個PCR反應過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。PCR儀溫度控制水浴鍋控溫壓縮機控溫

半導體控溫

離心式空氣加熱控溫

三、PCR儀的控溫指標和控溫方式從PCR反應基本原理可以看出，PCR基因擴增儀工作關鍵是溫度控制。

（一）PCR儀的控溫指標1.溫度的準確性：指樣品孔溫度與設定溫度的一致性。對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質量。2.溫度的均一性：指樣品孔間的溫度差異，關系到不同樣品孔之間反應結果的一致性?！拔恢玫倪吘壭睍绊懡Y果的可重復性。

3.升降溫的速度：升降溫速度快，可以提高工作效率，提高PCR反應特異性。樣品管與基座接觸的緊密性、基座的導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。4.不同模式下的相同溫度特性：帶梯度功能的PCR儀，應考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性?，F有專利技術，能以同樣的溫度變化速率到達所有設定的梯度溫度。以不同溫度的水浴鍋串聯成一個控溫體系。樣品與水直接無縫接觸，控溫準確，溫度均一性好，無邊緣效應。體積大，自動化程度不高，需人為干預，更換水浴鍋時控溫不穩(wěn)定。（二）PCR儀的控溫方式由壓縮機自動控溫，金屬導熱，控溫較水浴鍋方便，一臺機器便可完成整個PCR流程。壓縮機故障率高，邊緣效應及溫度overshooting現象嚴重。升溫過程中，由于一些加熱元件，比如半導體、金屬塊本身會積蓄能量，雖然溫度探頭探測溫度到達了設定溫度，但半導體、金屬塊上積蓄的能量仍然會傳給PCR體系，造成實際的溫度高于設定的溫度，即overshooting。1.由壓縮機自動控溫由半導體自動控溫，金屬導熱，控溫方便，體積小，相對穩(wěn)定性好。仍有邊緣效應，溫度均一性尚有欠缺，各孔擴增效率可能不一致，并且仍存在溫度overshooting現象。2.半導體自動控溫由金屬線圈加熱，采用空氣作為導熱媒介，溫度均一性好，各孔擴增效率高度一致滿足熒光定量PCR的高要求，直接發(fā)展為離心式的定量PCR儀。金屬板式實時定量PCR儀可作為普通PCR儀使用可帶梯度功能可容納的樣本量大，無需特殊耗材溫度均一性欠佳，有邊緣效應，標準曲線的反應條件難以做到與樣品完全一致

ABI7500熒光定量PCR儀

MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀

Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀離心式實時定量PCR儀溫度均一性較好使用的是同一個激發(fā)光源和檢測器，隨時檢測旋轉到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差可容納樣品量少，有的需用特殊毛細管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能