腫瘤高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)范

DB32/TXXXXX—XXXX腫瘤高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了腫瘤高通量基因測(cè)序適用人群、指標(biāo)要求及條件、測(cè)序流程、腫瘤高通道基因測(cè)序?qū)嶒?yàn)室質(zhì)量評(píng)價(jià)。本文件適用于腫瘤患者的高通量基因測(cè)序檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例國(guó)務(wù)院令第276號(hào)醫(yī)療器械注冊(cè)管理辦法國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局令第4號(hào)ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要求術(shù)語(yǔ)和定義以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。高通量基因測(cè)序next-generationgenesequencing；NGS區(qū)別于傳統(tǒng)的雙脫氧法測(cè)序，能夠一次并行對(duì)大量核酸分子進(jìn)行平行序列測(cè)定的技術(shù)，通過(guò)一次測(cè)序反應(yīng)能產(chǎn)出不低于100Mb的測(cè)序數(shù)據(jù)。文庫(kù)library通過(guò)生物來(lái)源的、人工合成的或者克隆技術(shù)等所得到的一個(gè)重建分子群，如基因組文庫(kù)、互補(bǔ)文庫(kù)、噬菌體展示肽文庫(kù)等。測(cè)序通量throughputofgenesequencing單次測(cè)序可獲得序列信息的基因片段數(shù)量或可測(cè)定的脫氧核糖核酸和核糖核酸（以堿基表示）的數(shù)量。有效通量validthroughput單次測(cè)序質(zhì)量合格的基因片段數(shù)或堿基數(shù)。測(cè)序準(zhǔn)確率accuracyofgenesequencing對(duì)已知序列的基因進(jìn)行測(cè)序，計(jì)算正確的堿基數(shù)占可識(shí)別的堿基數(shù)比例。測(cè)序深度depthofsequencing待測(cè)樣本中某個(gè)指定的核苷酸被檢測(cè)的次數(shù)。堿基識(shí)別質(zhì)量qualityofbasecalling測(cè)序過(guò)程中從熒光信號(hào)或者其他信號(hào)轉(zhuǎn)換成序列，衡量堿基正確識(shí)別的概率。通常以數(shù)字值直接表示。適用人群、指標(biāo)要求及條件適用人群能獲取腫瘤細(xì)胞的腫瘤患者。測(cè)序設(shè)備使用條件環(huán)境溫度：（18±5）℃，24小時(shí)溫度變化不超過(guò)2℃，目標(biāo)溫度以各個(gè)儀器設(shè)備性能參數(shù)中的要求而定。環(huán)境濕度：根據(jù)以各個(gè)儀器設(shè)備性能參數(shù)中的要求而定。工作電壓：220V。電源保護(hù)：帶有不間斷1500W電源器。支撐平臺(tái)：氣壓式緩沖系統(tǒng)的防震平臺(tái)，防震效果達(dá)到1Hz級(jí)別。實(shí)驗(yàn)室要求資質(zhì)要求開展腫瘤高通量測(cè)序醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)該具備國(guó)家級(jí)衛(wèi)生計(jì)生行政部門審批許可，并具備省級(jí)技術(shù)審核的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)，相關(guān)工作開展符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》的規(guī)定。設(shè)置要求參照GB/T30989中規(guī)范性目錄B的要求。實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合GB19489中的要求。區(qū)域分區(qū)可分為：樣本前處理區(qū)、試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫(kù)制備區(qū)、雜交捕獲區(qū)／多重PCR區(qū)域（第一擴(kuò)增區(qū)）、文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（第二擴(kuò)增區(qū)）、文庫(kù)檢測(cè)與質(zhì)控區(qū)、測(cè)序區(qū)、數(shù)據(jù)存貯區(qū)。工作區(qū)空氣及人員流向需嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》配置。分區(qū)可根據(jù)實(shí)際情況合并，但是在前處理和建庫(kù)時(shí)，血液樣本與組織樣本分開。設(shè)備試劑要求設(shè)備包括：高通量基因測(cè)序儀、DNA提取相關(guān)設(shè)備、PCR儀等，設(shè)備的種類、數(shù)量與試劑開展的項(xiàng)目與檢測(cè)標(biāo)本的數(shù)量相匹配。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該做好儀器設(shè)備維護(hù)及保養(yǎng)，建立儀器設(shè)備標(biāo)簽管理、檔案管理，按設(shè)備要求定期進(jìn)行計(jì)量校準(zhǔn)及維護(hù)管理。開展高通量基因測(cè)序的診斷機(jī)構(gòu)和醫(yī)院需嚴(yán)格按照《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》和《醫(yī)療器械注冊(cè)管理辦法》使用國(guó)家食品藥品管理總局（CFDA）獲批注冊(cè)的設(shè)備和試劑開展高通量基因測(cè)序工作。涉及實(shí)驗(yàn)室自配試劑（LDT），需有嚴(yán)格的試劑制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），需經(jīng)過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目驗(yàn)證合格才可使用。LDT基于不同樣本類型的性能驗(yàn)證的指標(biāo)包括:精密度（批內(nèi)、批間）、準(zhǔn)確度、分析靈敏度、分析特異性、可測(cè)量范圍、樣本穩(wěn)定性、試劑穩(wěn)定性、攜帶污染、參考范圍、臨床診斷靈敏度、臨床診斷特異性。檢測(cè)項(xiàng)目管控檢測(cè)項(xiàng)目驗(yàn)證因素包括：建庫(kù)方法、測(cè)序平臺(tái)和分析工具以及不同的突變類型（包括單堿基突變（singlenucleotidevariant，SNV）、小片段插入或者缺失（ins，del）、基因拷貝數(shù)變異（copynumbervariations，CNV）、染色體結(jié)構(gòu)變異（structuralvariation，SV））以及不同的樣本類型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）。驗(yàn)證參數(shù)包括：目標(biāo)區(qū)域測(cè)序（panel）的準(zhǔn)確性、精確性、敏感性、特異性。人員要求高通量測(cè)序檢測(cè)技術(shù)人員需具備臨床病理學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷，需接受省級(jí)衛(wèi)生計(jì)生行政部門組織的高通量基因測(cè)序技術(shù)培訓(xùn)，或者省級(jí)衛(wèi)生計(jì)生行政部門頒發(fā)的培訓(xùn)合格證書；需具有臨檢中心《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員培訓(xùn)合格證》。數(shù)據(jù)分析人員需具有臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)或遺傳學(xué)知識(shí)背景并經(jīng)生物信息學(xué)培訓(xùn)。實(shí)驗(yàn)室需依照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要求》（ISO15189）進(jìn)行內(nèi)部人員周期性培訓(xùn)和考核機(jī)制并制定文件化程序，保留相關(guān)記錄。測(cè)序流程測(cè)序前準(zhǔn)備醫(yī)師須自覺(jué)維護(hù)患者的權(quán)利，尊重患者的知情同意權(quán)和選擇權(quán)，保護(hù)患者隱私。全面客觀宣教高通量測(cè)序在腫瘤中的應(yīng)用價(jià)值，優(yōu)缺點(diǎn)及可供選擇的高通量測(cè)序方案等。告知要點(diǎn)主要包括：檢出率、假陽(yáng)性率。該檢測(cè)有失敗的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)重新檢測(cè)，檢測(cè)周期變長(zhǎng)。告知該檢測(cè)的局限性。檢測(cè)的種類、費(fèi)用和技術(shù)流程。標(biāo)本采集樣本類型新鮮組織在顯微鏡下確認(rèn)腫瘤細(xì)胞所占比例應(yīng)≥30%，壞死細(xì)胞所占比例應(yīng)≤10%，相關(guān)的病理檢測(cè)結(jié)果保存?zhèn)洳椤颖静杉罅⒓捶湃胍旱耆鋬觯?80℃低溫保存，干冰運(yùn)輸。石蠟組織/切片組織10%中性福爾馬林固定手術(shù)標(biāo)本，按病理學(xué)操作規(guī)范進(jìn)行取材。5～10張石蠟包埋標(biāo)本切片，厚度為5μm～10μm，用載玻片片盒或者離心管保存，常溫保存、運(yùn)輸。其中一片進(jìn)行HE染色，確認(rèn)腫瘤細(xì)胞含量。活檢材料的固定時(shí)間一般是24小時(shí)以內(nèi)。體液體液中的腫瘤細(xì)胞用于基因檢測(cè)時(shí)，需確認(rèn)腫瘤細(xì)胞，穿刺獲得胸腹水樣本提交給細(xì)胞病理檢查之后，剩余液體冷藏/冷凍保存，或在含有細(xì)胞成分的離心沉淀中加入含有蛋白質(zhì)變性劑的緩沖液室溫保存。外周血采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測(cè)，取樣時(shí)需使用一次性密閉EDTA抗凝真空采血管，采集6ml～10ml全血，冷藏運(yùn)輸，6小時(shí)內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸，建議用商品化的游離DNA樣本保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存7天。采樣質(zhì)量評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)內(nèi)容細(xì)胞組成、腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，是否按照要求進(jìn)行處理與運(yùn)輸。評(píng)價(jià)方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和濃度分析等。需經(jīng)病理醫(yī)師審閱，取一張切片HE染色后顯微鏡下觀察，確保腫瘤細(xì)胞存在，并記錄腫瘤組織含量，標(biāo)注腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域。腫瘤細(xì)胞比例在20%以上。樣本采集中的防污染樣本采集需采用一次性材料。采集中需注意防止污染，防止混入操作者的毛發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等。玻璃器皿需高壓滅菌，以使可能存在的DNase失活。制備不同患者病理切片樣本時(shí)，需更換新刀片。提取RNA樣品，需采用RNase抑制劑措施和無(wú)RNase材料。樣本運(yùn)送和保存采用唯一編號(hào)對(duì)樣本進(jìn)行編號(hào)。該編號(hào)應(yīng)當(dāng)與檢測(cè)報(bào)告中的樣本編號(hào)一致。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立詳細(xì)的樣本運(yùn)送標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對(duì)臨床醫(yī)生提供樣本采集手冊(cè)，要求物流人員填寫相關(guān)運(yùn)送記錄表，確保運(yùn)送過(guò)程中樣本的安全性和過(guò)程的可控性。樣本運(yùn)送和保存：用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的EDTA抗凝全血樣本及RNA檢測(cè)的樣本，需穩(wěn)定化處理常溫運(yùn)送，或速凍后，置干冰中運(yùn)送。樣本提取新鮮和凍存的手術(shù)組織樣本采用常規(guī)的商品化DNA提取試劑盒。活檢樣本推薦使用能提取石蠟包埋組織微量DNA的試劑盒。RNA提取胍鹽提取結(jié)合酚-氯仿抽提，石蠟樣本或活檢樣本可使用商品化RNA提取試劑盒。細(xì)胞或組織的徹底勻漿核酸純度評(píng)價(jià)可用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與核酸標(biāo)準(zhǔn)品比較測(cè)定；DNA濃度控制在50ng/ul～100ng/ul，總量20μg～40μg或以上；A260/280在1.8～2.0之間；RNA溶于無(wú)RNase的純水中，建議濃度在100ng/ul以上，總量達(dá)30μg以上。測(cè)序流程文庫(kù)制備文庫(kù)制備方法主要有雜交捕獲和擴(kuò)增子建庫(kù)，應(yīng)對(duì)檢測(cè)基因、區(qū)域或突變熱點(diǎn)進(jìn)行描述，并建立實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SOP。上機(jī)測(cè)序前需對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量分析。每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)設(shè)定其文庫(kù)質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)序儀上機(jī)檢測(cè)測(cè)序主要有檢測(cè)氫離子釋放和熒光信號(hào)兩大技術(shù)平臺(tái)。測(cè)序時(shí)根據(jù)檢測(cè)樣本量和質(zhì)量要求確定適當(dāng)?shù)男酒?，以保證測(cè)序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號(hào)、檢測(cè)內(nèi)容、設(shè)定參數(shù)等信息，按儀器操作流程進(jìn)行測(cè)序。生物信息分析分為兩個(gè)主要步驟：一是對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析及過(guò)濾；二是對(duì)通過(guò)質(zhì)控的序列進(jìn)行變異位點(diǎn)鑒定分析并注釋。所用各種生物信息分析軟件，均需通過(guò)適量標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，證明所用軟件及參數(shù)可達(dá)到臨床報(bào)告的要求。所有數(shù)據(jù)分析的軟件均需版本號(hào)，版本更新后需要在SOP中進(jìn)行更新。檢測(cè)報(bào)告內(nèi)容檢測(cè)報(bào)告內(nèi)容檢測(cè)報(bào)告內(nèi)容包括：患者姓名、年齡、住院號(hào)、病區(qū)床號(hào)、送檢單位及送檢日期、臨床診斷等基本信息。樣本編號(hào)、樣本種類、采樣日期和接收日期、樣本處理過(guò)程。檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)方法、檢測(cè)設(shè)備、檢測(cè)結(jié)果及報(bào)告版本號(hào)。檢測(cè)者、審核者及檢測(cè)時(shí)間。突變位點(diǎn)命名基因突變命名人類基因組突變學(xué)會(huì)（HGVS）已建立系統(tǒng)的基因突變命名方法。具體基因突變命名方法可查閱網(wǎng)站/mutnomen/index.html。以最新版本為準(zhǔn)。描述某一序列改變時(shí)，前綴表明其參考序列類型。例如“g.”表示基因組序列，“c.”表示cDNA序列，“m.”表示線粒體DNA序列，“r.”表示RNA序列，“p.”表示蛋白序列。在數(shù)據(jù)庫(kù)中的收錄號(hào)以及版本號(hào)應(yīng)在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中列出。參考序列.1序列參考美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）收錄的參考序列編碼。.2前綴“NM_”表示為mRNA序列，“NP_”表示多肽序列，“NG_”表示基因組序列。.3基因組參考序列應(yīng)列出完整基因序列，包括5'以及3'非編碼區(qū)（UTR）。.4應(yīng)選擇合適的轉(zhuǎn)錄體，如最常見的轉(zhuǎn)錄體，或已知的最大轉(zhuǎn)錄體，或具有組織特異性的編輯轉(zhuǎn)錄體，且明確起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)。.5當(dāng)某一參考序列具有多種轉(zhuǎn)錄方式時(shí)，選擇NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里注釋最全面的版本。DNA序列變異術(shù)語(yǔ).1DNA核苷酸用大寫字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鳥嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）來(lái)表示。.2用正鏈表示DNA序列。.3當(dāng)DNA序列改變時(shí)，以相應(yīng)核苷酸所在位置及相應(yīng)字母來(lái)描述?！?gt;”符號(hào)表示“從某一變化至另一”。.4在描述突變方式時(shí)，數(shù)字、字母、箭頭、上標(biāo)以及下標(biāo)之間不應(yīng)出現(xiàn)空格。RNA序列變異術(shù)語(yǔ).1RNA序列以小寫字母a（腺嘌呤）、c（胞嘧啶）、g（鳥嘌呤）、u（尿嘧啶）進(jìn)行描述。.2RNA序列改變描述方式與DNA相類似。蛋白質(zhì)序列變異術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)序列改變通常以單個(gè)字母或三個(gè)字母（第一個(gè)字母大寫）來(lái)描述。錯(cuò)義突變及無(wú)義變異術(shù)語(yǔ).1由于三聯(lián)體密碼子的簡(jiǎn)并性，多個(gè)位點(diǎn)核苷酸的改變可能不影響最終氨基酸序列。因此，應(yīng)分別從DNA水平和氨基酸水平描述突變。.2從DNA水平對(duì)某一突變位點(diǎn)的描述方式包括堿基位點(diǎn)，正常堿基，“>”符號(hào)，突變堿基。例如，某一蛋白第551號(hào)氨基酸殘基由G（甘氨酸）突變?yōu)镈（天冬氨酸），從DNA水平描述即c.1652G>A。.3在氨基酸水平，由于錯(cuò)義突變的產(chǎn)物以氨基酸殘基位點(diǎn)以及表示氨基酸的單字母或三聯(lián)體密碼子來(lái)描述。表示方法是野生型的氨基酸、位點(diǎn)、突變氨基酸，三者之間不要有空格。無(wú)義突變表示方法與之相類似。.4“X”符號(hào)代表終止密碼子。缺失和插入術(shù)語(yǔ)缺失和插入突變分別用前綴“del”和“ins”來(lái)表示，并注明突變位點(diǎn)以及堿基?！癲elins”則表示該段序列缺失的同時(shí)有片段插入。移碼突變術(shù)語(yǔ)移碼突變用“fs”符號(hào)表示。堿基重復(fù)序列重復(fù)突變用“dup”符號(hào)表示。0其他對(duì)于其他突變，可參考HGVS建議的命名規(guī)則。報(bào)告臨床意義的解讀和批注對(duì)于腫瘤體細(xì)胞突變，根據(jù)突變的類型和已有的報(bào)道及指南，基因變異提倡分級(jí)的處理方式。A級(jí)：美國(guó)食品藥品管理局FDA或CFDA批準(zhǔn)的用藥治療靶點(diǎn)；寫入中外診療指南有明確診斷/治療/預(yù)后意義的變異。在報(bào)告中注釋該變異位點(diǎn)的臨床診斷/治療/預(yù)后意義的權(quán)威指南來(lái)源。B級(jí)：尚未進(jìn)入診療指南，但已經(jīng)寫入該領(lǐng)域的專家共識(shí)的變異位點(diǎn)。注釋時(shí)要批注研究報(bào)道及專家共識(shí)的來(lái)源，明確其藥物及其臨床意義、正在開展的狀態(tài)等信息。C級(jí)：FDA或CFDA批準(zhǔn)用于其他腫瘤可預(yù)測(cè)療效的基因變異，或者正在進(jìn)行中的臨床試驗(yàn)變異位點(diǎn)。注釋時(shí)要批注用于其他腫瘤的權(quán)威指南，研究文獻(xiàn)及臨床試驗(yàn)正在開展的狀態(tài)等信息。D級(jí)：處于學(xué)術(shù)爭(zhēng)議或臨床意義不明確的基因變異。同一實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有統(tǒng)一的政策用來(lái)應(yīng)對(duì)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。檢測(cè)報(bào)告的審核發(fā)放規(guī)定相關(guān)檢測(cè)報(bào)告的周期；最終報(bào)告應(yīng)由具備高級(jí)職稱人員審核；檢測(cè)報(bào)告應(yīng)當(dāng)以書面報(bào)告形式告知受檢者，應(yīng)通知受檢者或其家屬獲取該報(bào)告的地點(diǎn)和時(shí)間。資料與標(biāo)本的保存腫瘤高通量基因測(cè)序患者相關(guān)資料以及相關(guān)的數(shù)據(jù)信息均應(yīng)當(dāng)在醫(yī)療機(jī)構(gòu)保存3年以上。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立完整質(zhì)量文件體系，包括質(zhì)量手冊(cè)、程序文件及標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）文件體系，以保證檢測(cè)各環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)、有序進(jìn)行，確保檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。質(zhì)