(高清版)GBT 41212-2021 納米技術(shù) 熒光素二乙酸酯法檢測(cè)納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測(cè)納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧Nanotechnologies—5-(and6)-Chloromethyl-2',7'Dichloro-dihydr國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本文件使用翻譯法等同采用ISO/TS19006:2016《納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測(cè)納米顆粒誘——GB/T16886.5—2017醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)(ISO10993-5:Ⅱ多技術(shù)，但目前僅開展了CM-H?DCF-DA法評(píng)價(jià)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生的比對(duì)研究。在有對(duì)照組的情況下，CM-H?DCF-DA法也可能出現(xiàn)誤判。有若干因素可能會(huì)造成假陰性0。CM-H?DCF-DA法并非對(duì)所有的ROS都能實(shí)現(xiàn)最佳檢測(cè)。例如，對(duì)半衰期較短的超氧陰離子和羥基分不同的ROS。其他檢測(cè)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)(參見附件A替代細(xì)胞系)。當(dāng)檢測(cè)體系中存在著可能會(huì)造成假ⅢGB/T41212—2021/IS1ISO10993-5醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)(Biologicalevaluationofmedicaldevices—Part5:TestsforinvitrocytoISO/TS80004-2納米技術(shù)術(shù)語第2部分：納米物體(Nanotechnologies—Vocabulary—Part2:2GB/T41212—2021/ISO/TS1顆粒particle3GB/T41212—2021/ISchloro-dihydro-fluoresDMEM:Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium)MESF:可溶性熒光基團(tuán)(molecularequivalentylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetraPBS:磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebufferedsaline)ROS:活性氧(reactiveoxygenspe-80℃或以下。長(zhǎng)期凍存(幾個(gè)月到幾年)則需要在-130℃或以下。用MTS法測(cè)定納米顆粒的細(xì)胞毒性時(shí)，應(yīng)遵循細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基本原則中關(guān)于凍存細(xì)胞擴(kuò)增的4GB/T41212—2021/IS純度。5.3.9無酚紅DMEM。6.224孔培養(yǎng)板。6.4離心機(jī)。5a)抗團(tuán)聚的穩(wěn)定性(反映在平均顆粒尺寸上);b)膠體懸浮液的穩(wěn)定性(反映在沉淀和沉降程度上)。害標(biāo)準(zhǔn))中進(jìn)行。納米顆粒的ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程參見圖1。圖1納米顆粒的ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程6GB/T41212—2021/ISO/TS1背景熒光。儀器設(shè)置應(yīng)遵照制造商的要求。通過測(cè)量參照物的熒光來建立相對(duì)強(qiáng)度校準(zhǔn)曲線mg/mL兩性霉素B。應(yīng)采用規(guī)范的細(xì)胞培養(yǎng)操作7。將細(xì)胞懸浮在無酚紅的培養(yǎng)基(10%FBS)中，密度達(dá)2×10?細(xì)胞/mL。率。細(xì)胞活力宜保持>95%(通過臺(tái)酚藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)判定),培養(yǎng)時(shí)間在48h以內(nèi)。a)在24孔板中分別培養(yǎng)細(xì)胞24h和48h:1)每孔接種500μL(200000細(xì)胞/mL),每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置8個(gè)重復(fù)樣品；2)每個(gè)時(shí)間段(24h和48h)使用一個(gè)培養(yǎng)板；3)將培養(yǎng)板平穩(wěn)地轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，避免干擾細(xì)胞貼壁導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻；5)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24h和48h),從培養(yǎng)箱中取出一塊培養(yǎng)板；6)用體視顯微鏡記錄細(xì)胞的狀態(tài)和形貌，如圖2所示。7GB/T41212—2021/ISO/TS1)輕吸除去孔中的培養(yǎng)液；3)將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基加入離心管中；4)在離心機(jī)中，將細(xì)胞懸液以400×g、5min離心形成沉淀；5)棄去上清液；6)在100μL培養(yǎng)基中，加入25μL含0.4%臺(tái)酚藍(lán)的PBS溶液；7)用移液器吹打細(xì)胞沉淀，重懸在臺(tái)酚藍(lán)/培養(yǎng)基溶液中；8)將細(xì)胞懸液滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)器上；9)用體視顯微鏡對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄活細(xì)胞和死細(xì)胞(藍(lán)色)的總數(shù)以及10)細(xì)胞增殖時(shí)間宜符合該細(xì)胞系預(yù)期的增殖時(shí)間。在納米顆粒暴露實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞培養(yǎng)4的細(xì)胞活力宜>95%。8.8.2用含1.5pg/mLCM-H?DCF-DA/PBS溶液將納米顆粒懸浮液稀釋至1μg/mL、10pg/mL、8.8.6檢測(cè)納米顆粒是否發(fā)光或納米顆粒與CM8.8.8如果納米顆粒懸浮液干擾CM-H?DCF-DA測(cè)定，則不用此方法測(cè)定納米顆粒引發(fā)的細(xì)胞8GB/T41212—2021/ISO/TS1電中性和帶負(fù)電荷的聚苯乙烯可能不具在-20℃下，1m將帶有正電荷和負(fù)電荷的聚苯乙烯懸浮液濃度調(diào)至10mg/mL。9.1準(zhǔn)備24孔板中的細(xì)胞9.1.3在37℃,潮濕的5%CO?培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞24h。9.2.3用移液器轉(zhuǎn)移500μL體積的納米顆粒懸浮液、9GB/T41212—2021/ISO/T苯乙烯(+PS)苯乙烯(-PS)不處理(NT)測(cè)試NTNoDCFNTNoDCFNTNoDCF圖324孔板納米顆粒和對(duì)照物用量9.3CM-H?DCF-DA細(xì)胞暴露9.4用CM-H?DCF-DA孵育細(xì)胞9.4.2先用移液器除去非牢固貼壁的細(xì)胞、PBS和DCF;然后，使用無血清培養(yǎng)基(不含酚紅的細(xì)胞儀分析應(yīng)盡快進(jìn)行(在1h內(nèi)),單次實(shí)驗(yàn)不要超過20個(gè)～30個(gè)樣品。GB/T41212—2021/IS9.5.2在流式細(xì)胞儀上分析CM-H?DCF-DA染色的細(xì)胞(收集10000個(gè)細(xì)胞)。a)確定包括對(duì)照組在內(nèi)的所有樣品的平均熒光強(qiáng)度(MFb)準(zhǔn)備一個(gè)電子表格，將納米顆粒處理組細(xì)c)根據(jù)8.8和9.5.2收集的數(shù)據(jù)，確定納米顆GB/T41212—2021/ISO/TS1細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)GB/T41212—2021/ISO/TS19006:2016(資料性)通過采用8.7的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程驗(yàn)證RAW264.7細(xì)胞的健康狀況和生長(zhǎng)速率。納米顆粒在RAW264.7細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧的能力使用第9章和第10章的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)細(xì)胞健康狀況進(jìn)行評(píng)估的兩個(gè)重要指標(biāo)是生長(zhǎng)率和實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞活力。IANH召集的六家實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)過48h實(shí)驗(yàn)具有大于90%的細(xì)胞活力，如圖D.2所示。增加計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量和用于評(píng)123生長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞活力/%細(xì)胞活力/%圖D.2RAW264.7細(xì)胞在24h和48h的細(xì)胞活力D.4暴露于納米顆粒的RAW264.7細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生(圖D.3)將RAW264.7細(xì)胞暴露于帶正電的聚苯乙烯(60nm)和二氧化鈰(約200nm)24h,然后暴露于CM-H?DCF-DA。暴露于帶正電荷的聚苯乙烯的細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨暴露劑量增加顯著增強(qiáng)，而暴露于二氧化鈰顆粒的細(xì)胞熒光強(qiáng)度在不同暴露劑量保持不變。暴露劑量/(ug/mL)相對(duì)平均熒光變化作為示例，圖D.3僅給出了其中一家實(shí)驗(yàn)室的測(cè)量結(jié)果。與未暴露的細(xì)胞相比，兩種材料都導(dǎo)致了平均熒光強(qiáng)度的增加，但暴露于帶正電荷的聚苯乙烯導(dǎo)致平均熒光強(qiáng)度隨暴露劑量增加而顯著增強(qiáng)，而暴露于二氧化鈰則無明顯劑量關(guān)系。[2]ISO29701:2010Nanotechnologies—Endotoxintestonnanomatesystems—Limulusamebocyte[3]ISO/TR13097:2013Guideliuringreactiveoxygenspecies(R[5]ISO/TS80004-2:2015Nanotechnologies—Vocabul[6]BIHARIP.,VIPPOLAM.,SCHREICHELC.A.OptimizeddispersionofnanopFibreToxicol.2008,5p.14.[7]COECKES.,BALLSM.,BOWEG.,DAVISCulturePractice,ATLA,33,pp.261-287,2005;Freshney,R.I.(1993)CultureofAnimalManualofBasicTechnique,3rded.,NewYork:Wiley-LiUSA:2010.[9]KALYANARAMANB.,DARLEY-USMARV.,DAVIESK.J.,DENNERYP.A.FORMAH.J.,GRISHAM,M.B.,MANN,K.MOORE,G.E.,ROBERTSⅡ,L.J.,ANDISCHIROPOULOS,H.MeasuringreactiveoxygenFreeRadic.Biol.Med.2012,52pp.1-6.[10]KROLLA.,PILLUKATM.H.,HAHND.,SCmethodsinnanoparticleriskassessment:Limitatiop.370.[11]ProtocolforNanoparticle/public[12]PreparationofNanoparticleDispersionsfrom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